आईडीजी-एसडब्ल्यू 3 सेल कल्चर एक त्रि-आयामी बाह्य मैट्रिक्स में
Summary
यहां, हम एक त्रि-आयामी (3 डी) बाह्य मैट्रिक्स में आईडीजी-एसडब्ल्यू 3 कोशिकाओं के संवर्धन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
ओस्टियोसाइट्स को नॉनप्रोलिफेरेटिव कोशिकाएं माना जाता है जो ओस्टियोब्लास्ट से टर्मिनल रूप से विभेदित होती हैं। अस्थि बाह्य मैट्रिक्स (ओस्टियोइड) में एम्बेडेड ओस्टियोब्लास्ट सेलुलर डेंड्राइट बनाने और प्रीओस्टियोसाइट्स में बदलने के लिए पीडीपीएन जीन को व्यक्त करते हैं। बाद में, प्रीओस्टियोसाइट्स मैट्रिक्स खनिज को बढ़ावा देने के लिए डीएमपी 1 जीन को व्यक्त करते हैं और इस तरह परिपक्व ओस्टियोसाइट्स में बदल जाते हैं। इस प्रक्रिया को ओस्टियोसाइटोजेनेसिस कहा जाता है। आईडीजी-एसडब्ल्यू 3 ओस्टियोसाइटोजेनेसिस के इन विट्रो अध्ययन के लिए एक प्रसिद्ध सेल लाइन है। कई पिछले तरीकों ने कोलेजन I को संवर्धन मैट्रिक्स के मुख्य या एकमात्र घटक के रूप में उपयोग किया है। हालांकि, कोलेजन I के अलावा, ऑस्टियोइड में एक जमीनी पदार्थ भी होता है, जो सेलुलर विकास, आसंजन और प्रवास को बढ़ावा देने में एक महत्वपूर्ण घटक है। इसके अलावा, मैट्रिक्स पदार्थ पारदर्शी है, जो कोलेजन आई-गठित जेल की पारदर्शिता को बढ़ाता है और इस प्रकार, इमेजिंग तकनीकों के माध्यम से डेंड्राइट गठन की खोज में सहायता करता है। इस प्रकार, यह पेपर आईडीजी-एसडब्ल्यू 3 अस्तित्व के लिए कोलेजन आई के साथ एक बाह्य मैट्रिक्स का उपयोग करके 3 डी जेल स्थापित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का विवरण देता है। इस काम में, ऑस्टियोसाइटोजेनेसिस के दौरान डेंड्राइट गठन और जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण किया गया था। ओस्टोजेनिक कल्चर के 7 दिनों के बाद, एक व्यापक डेंड्राइट नेटवर्क स्पष्ट रूप से फ्लोरेसेंस कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के तहत देखा गया था। रियल-टाइम पीसीआर से पता चला कि पीडीपीएन और डीएमपी 1 के एमआरएनए स्तर लगातार 3 सप्ताह तक बढ़े। सप्ताह 4 में, स्टीरियोमाइक्रोस्कोप ने खनिज कणों से भरे एक अपारदर्शी जेल का खुलासा किया, जो एक्स-रे फ्लोरेसेंस (एक्सआरएफ) परख के अनुरूप था। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि यह कल्चर मैट्रिक्स सफलतापूर्वक ओस्टियोब्लास्ट से परिपक्व ओस्टियोसाइट्स में संक्रमण की सुविधा प्रदान करता है।
Introduction
ओस्टियोसाइट्स ओस्टियोब्लास्ट 1,2 से प्राप्त टर्मिनल विभेदित कोशिकाएं हैं। एक बार ओस्टियोब्लास्ट को ओस्टियोइड द्वारा दफन कर दिया जाता है, तो यह ओस्टियोसाइटोजेनेसिस से गुजरता है और प्रीओस्टियोसाइट्स बनाने के लिए पीडीपीएन जीन को व्यक्त करता है, ओस्टियोइड को खनिज करने के लिए डीएमपी 1 जीन, और हड्डीके ऊतकों में परिपक्व ऑस्टियोसाइट के रूप में कार्य करने के लिए सोस्ट और एफजीएफ 23 जीन। यहां, ओस्टियोसाइटोजेनेसिस प्रक्रिया में डेंड्राइट एक्सटेंशन और मार्कर जीन अभिव्यक्ति की पहचान करने के लिए एक 3 डी संवर्धन प्रणाली पेश की गई है।
आईडीजी-एसडब्ल्यू 3 कोशिकाएं ट्रांसजेनिक चूहों से प्राप्त एक अमर प्राथमिक सेल लाइन हैं औरविभिन्न मीडिया 4 में सुसंस्कृत होने पर ओस्टियोसाइट भेदभाव के लिए ओस्टियोब्लास्ट का विस्तार या प्रतिकृति कर सकती हैं। एमएलओ-ए 5, एमएलओ-वाई 4, और अन्य सेल लाइनों की तुलना में, कार्यात्मक प्रोटीन की अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल, कैल्शियम नमक जमाव करने की क्षमता, और आईडीजी-एसडब्ल्यू 3 कोशिकाओं में विभिन्न हार्मोनों की प्रतिक्रियाएं हड्डीके ऊतकों में प्राथमिक ओस्टियोसाइट्स के समान होने की अधिक संभावना है।
2 डी सिस्टम की तुलना में, 3 डी संवर्धन प्रणाली विवो सेलुलर विकास वातावरण की नकल करने में अधिक सक्षम हैं, जिसमें पोषक तत्व ढाल, कम यांत्रिक कठोरता और आसपास की यांत्रिक सीमा शामिल है (तालिका 1)। 3 डी प्रणाली में ओस्टियोब्लास्टिक कोशिकाओं की खेती के लिए पिछले तरीकों में से अधिकांश ने कोलेजन I को फॉर्मूलेशन 4,5,6 में अद्वितीय घटक के रूप में उपयोग किया, क्योंकि कोलेजन I फाइबर कैल्शियम और फास्फोरस जमाव की साइट के रूप में काम करते हैं। हालांकि, ओस्टियोइड में एक अनिवार्य घटक, बाह्य मैट्रिक्स, में सेलुलर कारकों का एक बड़ा समूह होता है जो सेलुलर विकास, आसंजन और माइग्रेशन 7,8 को बढ़ावा देता है और इमेजिंग अवलोकन के लिए पारदर्शी और सुविधाजनक है। इस प्रकार, यह प्रोटोकॉल ओस्टियोसाइटोजेनेसिस अध्ययन के लिए एक माध्यमिक घटक के रूप में मैट्रिगेल (इसके बाद बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स के रूप में संदर्भित) का उपयोग करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण बिंदु यह है कि सहज जमावट को रोकने के लिए चरण 1 और चरण 2 को बर्फ पर किया जाना चाहिए। इस विधि में, कोलेजन I की अंतिम एकाग्रता 1.2 मिलीग्राम / इस प्रकार, विभिन्न निर्माताओं से विभिन?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम आईडीजी-एसडब्ल्यू 3 सेल लाइन उपहार में देने के लिए डॉ लिंडा एफ बोनवाल्ड को धन्यवाद देते हैं। इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (82070902, 82100935 और 81700778) और शंघाई “विज्ञान और प्रौद्योगिकी नवाचार” नौकायन परियोजना (21वाईएफ 1442000) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid | Hyclone | SH30042.01 | |
| 15 mL tubes | Corning, NY, USA | 430791 | |
| 7.5% (w/v) Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, MO, USA | S8761 | |
| ascorbic acid | Sigma-Aldrich, MO, USA | A4544 | |
| Collagen I | Thermo Fisher Scientific | A10483-01 | |
| fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
| homogenizer | BiHeng Biotechnology, Shanghai, China | SKSI | |
| laser confocal fluorescence microscopy | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | LSM 800 | |
| Live/Dead Cell Imaging kit | Thermo Fisher Scientific | R37601 | |
| Matrigel matrix | Corning, NY, USA | 356234 | |
| MEM (10X), no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 21430079 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, MO, USA | 158127 | |
| phosphate buffered saline | Hyclone | SH30256.FS | |
| stereo microscope | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Zeiss Axio ZOOM.V16 | |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| X-ray fluorescence | EDAX, USA | EAGLE III | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich, MO, USA | G9422 |
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