IDG-SW3 cellodling i en tredimensionell extracellulär matris
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för odling av IDG-SW3-celler i en tredimensionell (3D) extracellulär matrix.
Abstract
Osteocyter anses vara icke-proliferativa celler som är terminalt differentierade från osteoblaster. Osteoblaster inbäddade i benets extracellulära matris (osteoid) uttrycker Pdpn-genen för att bilda cellulära dendriter och omvandlas till preosteocyter. Senare uttrycker preosteocyter Dmp1-genen för att främja matrismineralisering och därigenom omvandlas till mogna osteocyter. Denna process kallas osteocytogenes. IDG-SW3 är en välkänd cellinje för in vitro-studier av osteocytogenes. Många tidigare metoder har använt kollagen I som huvudsaklig eller enda komponent i odlingsmatrisen. Men förutom kollagen I innehåller osteoiden också ett grundämne, som är en viktig komponent för att främja celltillväxt, vidhäftning och migration. Dessutom är matrissubstansen transparent, vilket ökar transparensen hos den kollagen I-bildade gelen och därmed hjälper till att utforska dendritbildning genom avbildningstekniker. Således beskriver denna artikel ett protokoll för att etablera en 3D-gel med hjälp av en extracellulär matris tillsammans med kollagen I för IDG-SW3-överlevnad. I detta arbete analyserades dendritbildning och genuttryck under osteocytogenesen. Efter 7 dagars osteogen odling observerades ett omfattande dendritnätverk tydligt under ett fluorescenskonfokalmikroskop. Realtids-PCR visade att mRNA-nivåerna av Pdpn och Dmp1 kontinuerligt ökade under 3 veckor. Vid vecka 4 avslöjade stereomikroskopet en ogenomskinlig gel fylld med mineralpartiklar, i överensstämmelse med röntgenfluorescensanalysen (XRF). Dessa resultat indikerar att denna odlingsmatris framgångsrikt underlättar övergången från osteoblaster till mogna osteocyter.
Introduction
Osteocyter är terminalt differentierade celler som härrör från osteoblaster 1,2. När osteoblasten är begravd av osteoiden genomgår den osteocytogenes och uttrycker Pdpn-genen för att bilda preosteocyter, Dmp1-genen för att mineralisera osteoiden och Sost– och Fgf23-generna för att fungera som en mogen osteocyt i benvävnad3. Här introduceras ett 3D-odlingssystem för att identifiera dendritförlängning och markörgenuttryck i osteocytogenesprocessen.
IDG-SW3-celler är en odödliggjord primär cellinje som härrör från transgena möss och kan expandera eller replikera osteoblast till sen osteocytdifferentiering när de odlas iolika medier. Jämfört med MLO-A5, MLO-Y4 och andra cellinjer är uttrycksprofilen för funktionella proteiner, förmågan att utföra kalciumsaltavsättning och svaren på olika hormoner i IDG-SW3-celler mer benägna att vara desamma som för primära osteocyter i benvävnaden4.
Jämfört med 2D-system är 3D-odlingssystem mer kapabla att efterlikna den cellulära tillväxtmiljön in vivo, inklusive näringsgradienten, låg mekanisk styvhet och omgivande mekaniskt område (tabell 1). De flesta av de tidigare metoderna för att odla osteoblastiska celler i ett 3D-system använde kollagen I som den unika komponenten i formuleringar 4,5,6, eftersom kollagen I-fibrer fungerar som platsen för kalcium- och fosforavsättning. En oumbärlig beståndsdel i osteoiden, den extracellulära matrisen, innehåller dock en stor grupp cellulära faktorer som främjar cellulär tillväxt, vidhäftning och migration 7,8 och är transparent och bekväm för avbildningsobservation. Således använder detta protokoll Matrigel (hädanefter kallad basalmembranmatris) som en sekundär komponent för osteocytogenesstudien.
Protocol
Representative Results
Discussion
En kritisk punkt i detta protokoll är att steg 1 och steg 2 måste utföras på is för att förhindra spontan koagulation. I denna metod var den slutliga koncentrationen av kollagen I 1,2 mg/ml. Således bör en optimal ddH2O-volym beräknas för att matcha de olika kollagenerna från olika tillverkare.
In vivo involverar osteocytogenes en polär rörelse av osteoblaster från ytan till det inre av trabekulärt ben14. Detta protokoll befriar celler…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr. Lynda F. Bonewald för gåvan av IDG-SW3-cellinjen. Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (82070902, 82100935 och 81700778) och Shanghai “Science and Technology Innovation” Sailing Project (21YF1442000).
Materials
| 0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid | Hyclone | SH30042.01 | |
| 15 mL tubes | Corning, NY, USA | 430791 | |
| 7.5% (w/v) Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, MO, USA | S8761 | |
| ascorbic acid | Sigma-Aldrich, MO, USA | A4544 | |
| Collagen I | Thermo Fisher Scientific | A10483-01 | |
| fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
| homogenizer | BiHeng Biotechnology, Shanghai, China | SKSI | |
| laser confocal fluorescence microscopy | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | LSM 800 | |
| Live/Dead Cell Imaging kit | Thermo Fisher Scientific | R37601 | |
| Matrigel matrix | Corning, NY, USA | 356234 | |
| MEM (10X), no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 21430079 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, MO, USA | 158127 | |
| phosphate buffered saline | Hyclone | SH30256.FS | |
| stereo microscope | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Zeiss Axio ZOOM.V16 | |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| X-ray fluorescence | EDAX, USA | EAGLE III | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich, MO, USA | G9422 |
Riferimenti
- Bonewald, L. F. The amazing osteocyte. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).
- Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. The osteocyte: An endocrine cell … and more. Endocrine Reviews. 34 (5), 658-690 (2013).
- Bonewald, L. F. The role of the osteocyte in bone and nonbone disease. Endocrinology and Metabolism Clinics of North America. 46 (1), 1-18 (2017).
- Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).
- Wang, J. S., et al. Control of osteocyte dendrite formation by Sp7 and its target gene osteocrin. Nature Communications. 12 (1), 6271 (2021).
- Chicatun, F., et al. Osteoid-mimicking dense collagen/chitosan hybrid gels. Biomacromolecules. 12 (8), 2946-2956 (2011).
- Kawasaki, K., Buchanan, A. V., Weiss, K. M. Biomineralization in humans: making the hard choices in life. Annual Review of Genetics. 43, 119-142 (2009).
- Bosman, F. T., Stamenkovic, I. Functional structure and composition of the extracellular matrix. Journal of Pathology. 200 (4), 423-428 (2003).
- Papadopoulos, N. G., et al. An improved fluorescence assay for the determination of lymphocyte-mediated cytotoxicity using flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 177 (1-2), 101-111 (1994).
- Staines, K. A., et al. Hypomorphic conditional deletion of E11/Podoplanin reveals a role in osteocyte dendrite elongation. Journal of Cellular Physiology. 232 (11), 3006-3019 (2017).
- Feng, J. Q., et al. Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism. Nature Genetics. 38 (11), 1310-1315 (2006).
- Winkler, D. G., et al. Osteocyte control of bone formation via sclerostin, a novel BMP antagonist. EMBO Journal. 22 (23), 6267-6276 (2003).
- Riminucci, M., et al. FGF-23 in fibrous dysplasia of bone and its relationship to renal phosphate wasting. Journal of Clinical Investigation. 112 (5), 683-692 (2003).
- Dallas, S. L., Bonewald, L. F. Dynamics of the transition from osteoblast to osteocyte. Annals of the New York Academy of Sciences. 1192, 437-443 (2010).
- Robin, M., et al. Involvement of 3D osteoblast migration and bone apatite during in vitro early osteocytogenesis. Bone. 88, 146-156 (2016).
- Chen, K., et al. High mineralization capacity of IDG-SW3 cells in 3D collagen hydrogel for bone healing in estrogen-deficient mice. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 864 (2020).
