Summary
T hücresi sinyalizasyonunun bir ölçüsü olan kalsiyum akışı, T hücresi reseptör stimülasyonuna verilen yanıtları analiz etmenin etkili bir yoludur. Hint-1'i hücre yüzey moleküllerine yönelik antikor panelleriyle çoklamak için kullanılan bu protokol, tam spektrumlu akış sitometrisinin son derece esnek yeteneklerinden yararlanır.
Abstract
T hücresi reseptör stimülasyonuna yanıt olarak kalsiyum akışı, T hücresi sinyallemesinin yaygın bir ölçüsüdür. Kalsiyum sinyalizasyonunu bant geçişli akış sitometrisi ile değerlendirmek için çeşitli kalsiyum indikatör boyaları geliştirilmiştir. Bu protokol, tam spektrumlu akış sitometrisi kullanarak birincil murin T-hücrelerindeki kalsiyum yanıtlarını ölçmek için tasarlanmıştır. Toplam splenositler, orantısal kalsiyum indikatör boyası Indo-1 ve hücre yüzey moleküllerine florokrom konjuge antikorlardan oluşan bir panel ile etiketlenir. Tam spektrumlu akış sitometrisinin yeteneklerinden yararlanmak, Hint-1 ile kombinasyon halinde çok çeşitli hücre yüzeyi lekelerini kullanmak için bir platform sağlar. Hücreler daha sonra T hücresi reseptörünü uyarmak için bir anti-CD3 antikorunun eklenmesinden önce ve sonra 37 ° C'de gerçek zamanlı olarak analiz edilir. Spektral sinyallerin karıştırılmasından sonra, kalsiyuma bağlı kalsiyumun kalsiyumsuz Hint-1'e oranı hesaplanır ve her kapılı splenosit popülasyonu için zaman içinde görselleştirilebilir. Bu teknik, çoklu hücre popülasyonlarında kalsiyum yanıtlarının eşzamanlı analizine izin verebilir.
Introduction
T-hücresi reseptörü (TCR) ile indüklenen kalsiyum akışı, T-hücresi aktivasyonunun yararlı bir ölçüsüdür ve sıklıkla bir T-hücresi popülasyonunun TCR sinyal yolu1'in proksimal adımlarında bozulmuş yanıtlara sahip olup olmadığını belirlemek için kullanılır. Kalsiyum akışının ölçümleri genellikle T hücrelerinin bir veya bir çift floresan kalsiyum gösterge boyası ile önceden etiketlenmesi ve daha sonra TCR çapraz bağlama 2,3,4'ten sonra gerçek zamanlı olarak akış sitometrisi kullanılarak floresan sinyallerinin incelenmesiyle gerçekleştirilir. Orantı-metrik bir kalsiyum boyası olan Indo-1, kalsiyum bağlanma5'e bağlı iki farklı dalga boyunda pik emisyonlara sahip UV lazer tarafından uyarılır ve canlı lenfositlerde kalsiyum yanıtlarının akış sitometri analizi için yaygın olarak kullanılan bir gösterge boyasıdır. Hint-1'in emisyon profili oldukça geniş olduğundan, Hint-1 değerlendirmesini bant geçişli akış sitometrisi ile çoklu hücre yüzey belirteçlerinin eşzamanlı analizi ile birleştirmek zor olabilir. Bu sınırlama, önceden saflaştırılmış T hücresi popülasyonlarına veya sınırlı sayıda hücre yüzey molekülü tarafından tanımlanan popülasyonlara kalsiyum yanıtlarının akış sitometri analizinin kullanımını kısıtlar.
Primer lenfositlerin heterojen popülasyonları üzerindeki kalsiyum yanıtlarının bant geçişli akış sitometrisi kullanılarak ölçülmesinin sınırlamalarını ele almak için, tam spektrumlu akış sitometrisi kullanarak Hint-1 floresansını ölçmek için bir protokol geliştirilmiştir. Bu yöntem, tam spektrumlu akış sitometrisinin son derece esnek yeteneklerinden yararlanarak, Hint-1'in hücre yüzey moleküllerine yönelik antikor panelleriyle çoğullanmasına izin verir. Tam spektrumlu akış sitometrisinin geleneksel akış sitometrisine göre avantajı, floresan sinyallerini yüksek oranda örtüşen boyalardan ayırt etme kabiliyeti ve böylece her numunede aynı anda değerlendirilebilen yüzey belirteçlerinin sayısını arttırmasıdır. Geleneksel akış sitometrisi bandpass filtreleri kullanır ve dedektör sistemi6 başına bir florokrom ile sınırlıdır. Tam spektrumlu akış sitometrisi, beş lazerli spektral akış sitometri sistemi 7,8 üzerinde 64 dedektör kullanarak florokromun tüm spektrumu boyunca sinyaller toplar. Ek olarak, tam spektrumlu akış sitometrisi, geleneksel akış sitometrelerinde bulunan fotoçarpan tüp dedektörlerine göre artan duyarlılığa sahip APD (Çığ Fotoğraf Diyot) dedektörlerinden yararlanır8. Sonuç olarak, bu yaklaşım, kalsiyum boya etiketlemesinden önce spesifik T hücresi popülasyonlarının izolasyonuna olan ihtiyacı ortadan kaldırdığından, periferik kan mononükleer hücreleri veya murin sekonder lenfoid organ hücresi süspansiyonları gibi heterojen hücre popülasyonları için idealdir. Bunun yerine, veri toplandıktan sonra hücre yüzey belirteci ekspresyon profilleri ve akış sitometrisi geçişi, ilgilenilen her popülasyondaki kalsiyum yanıtlarını değerlendirmek için kullanılabilir. Bu raporda gösterildiği gibi, Hint-1, sekiz florokrom konjuge antikorla kolayca birleştirilebilir ve bu da toplam 10 benzersiz spektral imza ile sonuçlanır. Ayrıca, bu yöntem konjenik olarak farklı fare çizgilerinden gelen hücre karışımlarına kolayca uygulanabilir ve bu da gen hedefli bir fare hattından gelenlere kıyasla vahşi tip T hücrelerindeki kalsiyum tepkilerinin eşzamanlı analizine izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fareler, IACUC protokollerine uygun olarak Colorado Üniversitesi Anschutz Tıp kampüsünde tutuldu. Tüm fareler AAALAC standartlarına göre ötenazi yapıldı.
1. Fare dalağından bağışıklık hücrelerinin hazırlanması
NOT: CO2 ötenazi ile naif fareleri ötenazi yapın. Jackson Laboratuvarları'ndan satın alınan ve şirket içinde yetiştirilen C57BL/6 fareleri, 6-12 haftalıkken deneyler için kullanılır. Deneyler için hem erkek hem de dişi fareler kullanılır.
- Dış kirleticilerin numuneye girme olasılığını azaltmak için fare derisini %70 etanol ile dezenfekte edin.
- Diseksiyon aletleri, cerrahi makas ve forseps kullanarak fare dalağını diseke edin. Dalağı hasat edin ve ayrılan dalağı buz üzerinde ~ 5 mL tam RPMI ortamı (cRPMI) ile 50 mL konik tüpe yerleştirin.
NOT: Tam RPMI% 10 FBS, 2 mM L-glutamin ve% 1 penisilin / streptomisin'den oluşur.- Fare dalağını hasat etmek için, farenin sol tarafı boyunca kürk ve cilde 5 cm'lik bir kesi yapın, ön ve arka bacakların ortasına kadar makasla yapın. Vücut boşluğunu ~ 5 cm açın ve forseps kullanarak dalağı çıkarın. Dalak, bir böbrek çekirdeğinin rengidir ve komşu böbrekten daha uzun ve düzdür.
- Adım 1.2'nin içeriğini, yeni bir 50 mL konik tüpe bağlı steril bir 70 μm filtreye dökün. Dalağı, filtre yüzeyinde dalak hamuru kalmayıncaya kadar 5 mL'lik bir şırınga pistonu ile filtreden geçirerek dalağı mekanik olarak tek bir hücre süspansiyonuna ayırın.
- Splenositleri, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de bir salınımlı rotor tezgah santrifüjü kullanarak pelet yapın.
- Supernatant'ı dikkatlice boşaltın. Peletlenmiş splenositler 50 mL konik tüpün dibinde kalır.
- Kırmızı kan hücrelerini çıkarmak için, peletlenmiş splenositleri üreticinin talimatlarına göre 1 mL ACK lizis tamponunda 3 dakika boyunca tekrar askıya alın. İyice karıştırın.
- ACK lizis tamponunu 15 mL cRPMI ile söndürün.
- Lenfositleri adım 1.4'te belirtildiği gibi pelet yapın.
- Hücre süspansiyonunu 50 mL'lik bir konik tüp içinde 5 mL cRPMI'de tekrar askıya alın. Örnekleri buzun üzerine yerleştirin.
- Hücreleri saymak için, hücre süspansiyonunun 10 μL'sini 0.6 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve Trypan mavisi çözeltisi ile 1: 1 oranında seyreltin. Ardından, bir hemositometreye veya otomatik hücre sayım sistemine aktarın.
- Sayımdan sonra, adım 1.9'da olduğu gibi hücre süspansiyonundaki hücre konsantrasyonuna bağlı olarak, Hint-1 ester boyası içeren cRMPI ortamının eklenmesine hazırlanmak için hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 5 x g'de bir masa üstü santrifüjde pelet haline getirin.
- 10-12 x 106 hücre / mL elde etmek için hücrelerin yeniden süspansiyon hacmini hesaplayın. Bu, gerekli toplam hücre sayısının 2 katı konsantrasyondur.
- Adım 1.11'de hesaplanan cRPMI hacmindeki hücreleri yeniden askıya alın. Hücreleri %5 CO2 ile 37 °C'de, kapağı havalandırmalı 50 mL'lik bir konik tüpe veya bir doku kültürü plakasına yerleştirin.
2. Hint-1 oranmetrik boya ve floresan antikor etiketleme
- Üreticinin talimatlarına göre, 50 μg Indo-1 içeren bir şişeye 50 μL DMSO ekleyin. Stok çözeltisinin konsantrasyonu 1 μg / μL'dir.
NOT: DMSO, DMSO'nun oksidasyonunu önlemek için kit ile birlikte mikro şişelerde sağlanır. - Stok alikotunu (1 μg / μL), 2x konsantrasyon olan 6 μg / mL'lik bir konsantrasyonda cRPMI'nin uygun deneysel hacmine (1.11'de kurulan) seyreltin. Hint-1'i sulu bir çözeltide saklamayın.
NOT: Kalsiyum eklenmiş diğer tamponlar, hücre ihtiyaçlarına bağlı olarak kullanılabilir. - Hint-1 ile birlikte tüm medyayı 37 ° C'de bir su banyosunda bir kenara koyun.
NOT: Yeterli bir sinyal elde etmek için gerekli minimum Hint-1 ester konsantrasyonunu kullanın. Bunun, değişen hücre tipleri için titre edilmesi gerekir. Tipik olarak, 3-5 μM arasında bir konsantrasyon yeterlidir. Birincil T-hücreleri için, >5 μg / mL konsantrasyonda Hint-1 içeren hücrelerin yüklenmesi, spektral akış sitometrelerinde ortalama floresan yoğunluğunu (MFI) 6'lık bir kütüğün üzerine çıkarır. Bu meydana gelirse, UV lazer yoğunluğunu azaltın ve Hint-1'i daha düşük bir konsantrasyona titre edin. - Önceden hazırlanmış hücre süspansiyonunu (adım 1.12'de), adım 2.2'de yapılan 2x Hint-1 ortamı da dahil olmak üzere cRPMI'de 1: 1'i seyreltin. Hücrelerin 5-6 x 106 / mL arasında bir konsantrasyonda olduğundan emin olun.
NOT: Lekesiz tek leke kontrolünü veya yüzey işaretleyici tek leke hücresi kontrollerini Indo-1 ile boyamayın. Tek lekeli antikor kontrollerine Hint-1 eklenmesi, tek lekeli hücrelere eklenen Hint-1 nedeniyle çok renkli bir örnek oluşturacaktır. Hint-1 (kalsiyum içermeyen) EGTA, adım 2.6'da oluşturulan numune plakasına ek kontrol ekleyin. - 12 delikli bir doku kültürü plakasına 1 mL hücre / kuyu / deneysel durum ekleyin.
- Daha önce Hint-1 boya yüklü hücreleri kullanarak Indo-1 (kalsiyumsuz) numune için tek bir lekeli kontrol oluşturun ve EGTA'yı 2 mM'lik nihai konsantrasyona ekleyin. EGTA, hücre süspansiyonundaki kalsiyumu şelatlayarak daha temiz bir kontrol örneği verir.
- Akış sitometresindeki boya yüklü hücre süspansiyonuna 50 μM iyonomisin ekleyerek bir Hint-1 pozitif kontrol (Hint-1 kalsiyuma bağlı) oluşturun. İonomisin, kalsiyum iyonlarını bağlayan ve kalsiyum iyonlarının hücrelere transferini kolaylaştıran membran geçirgen bir kalsiyum iyonoforudur.
- Florofor veya Hint-1 boyası içermeyen biyolojik negatif kontrol için bir kuyu oluşturun.
- Bir akış sitometri paneli tasarımında antikor konjuge floroforları kullanarak ilgilenilen herhangi bir ek hücre popülasyonu (kullanıcı tarafından tanımlanan antikorlar) için tek leke kontrolleri için bir kuyu oluşturun. Bunlar Hint-1 oranmetrik boyasını içermeyecektir.
- Yüzey boyama için ek florokrom-konjuge antikorlar eklemeden önce, üreticinin talimatlarına göre Fc reseptörü bloke edici antikoru (~ 2 μg / 1 x 106 hücre) ekleyin.
- Plakayı %5 CO 2 ile 37 °C'de 45 dakika boyunca inkübe edin.
- Her 15 dakikada bir plakaya hafifçe dokunarak hücreleri 12 delikli bir plakada tekrar askıya alın.
- Ortamda asılı duran hücrelerin tüm hacmini 12 delikli plakadan karıştırın ve çıkarın. Daha sonra hücre süspansiyonunu 1.7 mL mikrosantrifüj tüplerine ekleyin.
- Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 x g'de bir mikrosantrifüjde peletleyin. Süpernatantı boşaltın ve 1 mL önceden ısıtılmış cRPMI ekleyerek hücreleri yıkayın. Pelet tekrar ve süpernatantı boşaltın.
NOT: Hücrelerin yıkanması, kalan FC bloke edici antikorları ortadan kaldırır. - Hücreleri 1.7 mL mikrosantrifüj tüplerinde 1 mL cRPMI'de yeniden askıya alın ve her bir tüpü 37 ° C'de% 5 CO2'de 30 dakika daha inkübe edin ve gaz değişimine izin vermek için tüpün üstünü hafifçe açık bırakın. Bu, hücre içi esterlerinin tamamen deesterifikasyonuna izin verir.
- Gerekirse, hücreleri 12 delikli bir doku kültürü plakasına geri aktarın. Ek kullanıcı tanımlı titre florokrom-konjuge antikorlar dinlenme aşamasında eklenebilir.
NOT: Yöntemler panelinde kullanılan işaretleyiciler şunları içerir: Ghost 540, CD4, CD8, TCRβ, TCRγδ, CD25 ve CD1d/α-galcer tetramer. İşaretçiler, T hücresi alt kümelerini analiz etmek için seçilir.- Kullanıcı tanımlı florokrom-konjuge antikorların tümünün, ilgilenilen hücre tiplerine göre, daha önce titre edilmiş bir hacimde 1.7 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne ana karışımını oluşturun.
- Dinlenme hücrelerine titre edilmiş antikorlara bağlı olarak, hücre hacminin 1 mL'si için hesaplanmış bir ana karışım ekleyin.
NOT: Sonraki adım 2.18 yerine adım 2.15'te boyamanın avantajı, adım 2.15'te boyamanın deney için genel kuluçka süresini azaltacak olmasıdır. Bununla birlikte, adım 2.15'te toplam 1 mL'lik bir hacimde boyanma, antikor kullanımını arttırır.
- Dinlendikten sonra, hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 x g'de pelet yapın.
NOT: 12 delikli bir doku kültürü plakasındaki hücreler, bir plaka santrifüj aksesuarı ile plaka içinde peletlenebilir. Aksi takdirde, hücreleri 1.7 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde pelet edin. - Peletleri 1 mL 4 °C soğuk cRPMI'de yeniden askıya alarak hücreleri yıkayın ve adım 2.16'da olduğu gibi hücreleri tekrar pelet haline getirin. Hücreleri buzun üzerine yerleştirin.
NOT: Yüzey boyama hücreleri ayrı ayrı yapılırsa, adım 2.18'de deesterifikasyon sonrasında, daha az antikor hacmine ihtiyaç vardır. Bu adımda yüzey boyama, soğuk akış tamponunda dinlenme aşamasından sonra (% 1 FBS eklenmiş 1x DPBS), kullanıcı tanımlı antikorlar kullanılarak, buz üzerinde 30 dakika boyunca gerçekleştirilebilir. Lekeden sonra hücreleri adım 2.17'de olduğu gibi cRPMI'de yıkayın.- DPBS'de 1:7.500 seyreltilmiş canlılık lekesi Ghost540'ı üreticinin talimatlarına göre numunelere ekleyin. Isı, tek lekeli canlı / ölü kontrolü için bir ısınma bloğunda hücreleri 55 ° C'de öldürür.
NOT: Akış sitometrik analizinde ölü hücreleri ortadan kaldırmak için canlılık fonksiyonel boya boyama FBS olmadan gerçekleştirilir. FBS, üreticinin talimatlarına göre amin boyaları ile etkileşime girebilir.
- DPBS'de 1:7.500 seyreltilmiş canlılık lekesi Ghost540'ı üreticinin talimatlarına göre numunelere ekleyin. Isı, tek lekeli canlı / ölü kontrolü için bir ısınma bloğunda hücreleri 55 ° C'de öldürür.
- Kapaklı 5 mL'lik bir polistiren akış tüpü kullanarak bireysel numuneleri 500 μL cRPMI'de (fenol kırmızısız) tekrar askıya alın.
NOT: Hücreler 4 °C'de bir saate kadar bırakılabilir. - Hücreleri içeren her 5 mL'lik tüpü, ayrı ayrı, akış sitometresindeki analizden önce bir boncuk banyosu kullanarak 7 dakika boyunca 37 ° C'ye ısıtın ve numuneler arasında tutarlı bir süre tutun. Bir zamanlayıcı kullanın.
3. Boncuk banyo tüpü: kalsiyum akısı analizi sırasında sıcaklığın korunması
- Su eklenmeden küçük bir su banyosuna banyo boncukları ekleyin; 37 °C'ye kadar ısıtın.
- 50 mL'lik bir konik tüpü, 25 mL işaretinde, bir tıraş bıçağı ile dikkatlice ikiye bölün; tüpün üstünü atın.
- Yarıya indirilmiş tüpü yolun 3 / 4'ünü banyo boncuklarıyla doldurun.
- Adım 3.2'de oluşturulan tüpü, adım 3.1'de oluşturulan boncuk banyosuna yerleştirin. Tüp ve boncukları 37 °C'ye getirin.
- Numune analizine hazırlanırken sıcaklığı korumak için boncuk banyosunu akış sitometresinin yanındaki bir elektrik prizine takın.
- Akış sitometresinde çalışırken tüpü yerine yerleştirmek üzere bir tüpü tutmak için 50 mL'lik konik strafor raf kesimi ekleyin. Bu, eğri analizi süresince tüpü manuel olarak tutma ihtiyacını ortadan kaldıracaktır.
4. Akış sitometrik analizi kullanarak kalsiyum akışının elde edilmesi
- Bir akış analizöründeki akış sitometresi yazılımında oturum açın.
- Indo-1 (kalsiyuma bağlı) ve Indo-1 (kalsiyumsuz) floresan etiketleri eklemek için Kütüphane sekmesine tıklayın. Soldaki yazılım menüsünden Floresan Etiketleri'ni seçin. Floresan etiket grupları altında UV lazeri seçin ve kütüphaneye floresan etiket adı (Indo-1 (kalsiyuma bağlı)/Indo-1 (kalsiyumsuz)) eklemek için +ekle'ye tıklayın. Lazer uyarma dalga boyunu ve emisyon dalga boyunu seçin ve ardından Kaydet'e tıklayın. Deneme kurulumuna devam edin.
NOT: Indo-1, UV lazer tarafından 355 nm dalga boyunda uyarılır. Hint-1'in (kalsiyuma bağlı) emisyon dalga boyu 372 nm'dir. Hint-1'in (kalsiyumsuz) emisyon dalga boyu 514 nm'dir. - Edinme sekmesine tıklayın. Yeni bir deneme açın/oluşturun ve istediğiniz floresan etiketlerini denemeye ekleyin.
- Deneme için Referans Grubu ve yeni bir örnek grup/gruplar oluşturun. Hem numuneleri hem de referans gruplarını gerektiği gibi etiketleyin.
- Almalar sekmesi altında, olayları kaydedilecek en yüksek değere ayarlayın: 10.000.000.
- Durdurma ses düzeyini maksimum ses düzeyine ayarlayın: 3.000 μL.
- Durma süresini maksimum süreye ayarlayın: 36.000 sn.
- Çok renkli panelde bulunan tanımlanmış konjuge antikorlar için tek boyalı kontroller edinin.
- Indo-1 fonksiyonel boya için tek lekeli kontroller edinin.
- Kalsiyuma bağlı Hint-1 pozitif kontrolüne 50 μM iyonomisin ekleyin. Karıştırmak için vorteks. Akış tüpünü numune enjeksiyon portuna ekleyin ve Kaydet'e tıklayın.
- Akış sitometresine kalsiyumsuz Indo-1 negatif kontrolü ekleyin ve Kaydet'e tıklayın. EGTA adım 2.6'da eklenmiştir.
- Tek lekeli kontrollerin karışımını Karıştır düğmesine tıklayarak çıkarın.
NOT: Tüm konjuge antikorlardan ve fonksiyonel boyalardan alınan tüm tek boyalı kontroller, numunelerin karıştırılmasından önce kaydedilmelidir. Unmix (Karıştır) düğmesinin çalışması için önce tüm referans kontrollerinin kaydedilmesi gerekir. Karıştırmanın kaldırılması, numune toplanmasından önce veya sonra yapılabilir.
- Karıştırmayı kaldırma işlemi tamamlandıktan sonra, karıştırılmamış çalışma sayfasını kullanarak sıralı grafikler oluşturun. SSC-A'ya karşı FSC-A, numuneden döküntüleri kaldırmak, SSC-A'ya karşı SSC-H, çiftleri çıkarmak için. Bunu, ilgilenilen popülasyonlar üzerinde daha fazla geçit ile birlikte bir yaşayabilirlik temizleme kapısı izler. Kapılar oluşturmak için, Grafik'e tıklayın. Çalışma sayfasına bir grafik ekleyin ve aşağı akış kapılı bir popülasyon oluşturmak için kapının içine çift tıklayın. İlgilenilen tüm popülasyonlar hesaba katılana kadar devam edin.
- Sıcak tek boyalı kontrol numuneleri (Hint-1 oransal boya ve floresan antikor etiketleme bölümündeki 2.6-2.9 adımlarından) sıralı analiz için 37 °C'ye kadar. Akış sitometri yazılımını kurun.
- Akış sitometresinin akışkan stabilitesini sağlamak için sitometre üzerinde DI suyunu 2-3 dakika çalıştırın.
- Çokgen, Dikdörtgen veya Elips kapı düğmelerini kullanarak kapılar oluşturarak karıştırılmamış çalışma sayfasında sıralı grafikler ayarlayın. İlgilenilen popülasyonu içeren kapı (yani, SSC-A ve FSC-A kullanan lenfositler [boyut / lenfosit ayrımcılığı]). Negatif popülasyonlar sıfır civarında kümelenmiş görünürken, pozitif popülasyonlar MFI'yı artırarak görselleştirilebilir. İlgilenilen popülasyonlar, biyolojik soruya dayanarak kullanıcı tarafından tanımlanacaktır.
- Oluşturulan kapının içine çift tıklayın ve Y ekseni ve X ekseni parametrelerini SSC-A ve SSC-H (tekli ayrım) olarak değiştirin. Eksen üzerindeki kelimelere sol tıklayarak eksen parametrelerini tanımlamayı tamamlayın.
- SSC-A ve canlılık boya sinyali (canlılık kapısı parametreleri) ile bir grafik oluşturun. Amin boya boyaması için negatif olan canlı hücreler üzerindeki kapı . Canlı ölü boyama için negatif olan canlı hücreler, hem Y hem de X eksenlerinde 0 işaretinde kümelenecektir.
- Sadece tek hücreli canlı lenfositleri içeren yeni bir arsa oluşturmak için iç çizime çift tıklayın. Kalsiyum akışının görselleştirilmesi için X eksenindeki zamana karşı Y eksenini Hint-1 (bağlı kalsiyum) (V1) ve / veya Hint-1 (serbest kalsiyum) (V7) olarak değiştirin.
- Isıtılmış biyolojik numuneyi makine SIT üzerine yerleştirin ve sınırlı hücre sayısı popülasyonlarında (örneğin, iNKT) kalsiyum akışının görselleştirilmesine izin vermek için numuneleri ortam üzerinde 2.500-3.000 olay / s'de çalıştırın.
NOT: Hücreleri 1 x 106/mL konsantrasyonda yeniden askıya alarak, orta akış hızında toplanan hücre olayları 2.500-3.000 olay / s'ye eşit olmalıdır. Açılır menüye tıklayarak edinme kontrolü altındaki akış hızını düşürün veya hücre süspansiyonu daha yüksek bir konsantrasyona sahipse numuneyi seyreltin. Numunelerin yüksek bir akış hızında çalıştırılması, sinyalin bir florofordan paneldeki diğer floroforlara yayılmasını artırabilir. - 37 ° C'ye ısıtmak için bir sonraki tüpü boncuk banyosuna ekleyin.
- Edinme Kontrolünde, numunede bazal bir kalsiyum sinyali seviyesi elde etmek üzere ilk verileri 30 sn boyunca kaydetmek için Kaydet'e basın.
- Edinme Kontrolünde, Durdur'a tıklayın ve tüpü Numune Enjeksiyon Portundan (SIP) çıkarın.
- Kalsiyum akışını başlatmak için 30 μg konjuge edilmemiş anti-CD3'ü doğrudan numune tüpüne ekleyin. Tüp başına nihai konsantrasyon 60 μg / mL'dir.
NOT: Anti-CD3 ilavesinden sonra yıkama adımı yoktur. - Tüpü mümkün olduğunca çabuk makine SIP'ine geri yerleştirin ve yazılımda Kaydet'e basın.
- Örnek popülasyonlardaki kalsiyum akışının zaman seyrini gözlemlemek için yazılımdaki edinim kontrolleri altında geçen süreyi izleyerek 7 dakika boyunca veri kaydedin.
- 7 dakika sonra, yazılımda Durdur'a basın ve 1 μg / mL iyonomisin ekleyin. İlgilenilen hücrelerde maksimum kalsiyum sinyalini elde etmek için 30 s boyunca kayıt yapın. İyonomisinin bir sonraki numuneye taşınmasını sınırlamak için, numuneler arasında cihaz üzerinde iki SIT yıkama işlemi tamamlayın.
- Sonraki örneğe geçin ve tüm örnekler toplanana kadar iş akışını yineleyin.
- Denemeyi kaydedin ve dışa aktarma zip dosyasına tıklayın. Karıştırılmamış dosyalar (.fsc) harici akış sitometri analiz yazılımına yüklenir.
5. Kalsiyum eğrisi analizi
- Akış sitometrisi için bir analiz yazılımı6 kullanarak, Hint-1 floresan sinyallerini hızlandırılmış kalsiyum ölçümleri için bir orana dönüştürün. Doğrusal bir ölçek kullanarak Indo-1 (kalsiyuma bağlı)/Indo-1 (serbest kalsiyum) referanslarını ekleyerek araçlar sekmesi altındaki parametreleri türetin. Minimumu sıfıra ve kalsiyum oranının akışına göre, tipik olarak 10 civarında maksimuma ayarlayın. Maksimum oran, hücre tipine ve Hint-1'in MFI'sine göre değişir.
- Seçilen parametreyi vurgulayın. Araçlar altında, Kinetik sekmesine tıklayarak parametreyi seçmek için kinetik analiz ekleyin. Y eksenini türetilmiş olarak ayarlayın.
- Kinetik sekmesinde MFI (ortalama floresan yoğunluğu) öğesini seçin.
- İsterseniz Gauss yumuşatma ekleyin. Gauss yumuşatma eklemek için, akış analizi yazılımındaki açılır istatistikler menüsündeki seçeneği belirleyin. Analizin kalsiyum akışı eğrisinin görselleştirilmesini yumuşatmak için Gauss yumuşatma eklenebilir.
- Numuneler içindeki biyolojik karşılaştırmalar için kalsiyum akısı zaman seyri boyunca istatistikler için çoklu aralıklar oluşturun.
- Örnekleri mizanpaj düzenleyicisine sürükleyin ve istatistikleri istediğiniz gibi ekleyin. İstatistiksel analiz biyolojik soruya bağlı olarak değişir. Yayın amacıyla, çoklu replikalar t-testi veya ANOVA kullanılarak analiz edilir.
- Bir anlık zaman analizi için, kapıyı kalsiyum akısı boyunca belirli bir zamanda ayarlayın. İstenilen yüzey işaretleyicilerini inceleyin ve ilgilenilen popülasyon üzerindeki kapıyı inceleyin; daha sonra, zaman diliminde o an içinde kapılı hücreler için Hint-1'in (kalsiyumsuz) ve Hint-1'in (kalsiyum bağlı) iki boyutlu bir nokta grafiğini değerlendirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Çoklu yüzey lekelerine sahip bir Hint-1 oranmetrik boya kullanarak birincil murin T-hücrelerinde kalsiyum yanıtlarını değerlendirmek için deneysel iş akışı Şekil 1'de gösterilmiştir. Fare splenositlerini tek bir hücre süspansiyonuna topladıktan ve işledikten sonra, hücreler bir Hint-1 esteri ile boyanır ve yüzey florokroma bağlı antikorlarla boyanır. Boya yüklemesi ve antikor boyama işlemi tamamlandıktan sonra, lenfosit örnekleri biyolojik bir sıcaklığa (37 ° C) kadar ısıtılır. Numuneler daha sonra, analizden önce numuneleri sıralamaya gerek kalmadan, istenen bireysel hücre tiplerine geçit verdikten sonra Hint-1 floresan için tam spektrumlu akış sitometrisi kullanılarak analiz edilir. Avalanche Photo Diode (APD) dedektörlerini tam spektrumlu akış sitometresinde kullanmak için, tepe emisyon dalga boyunu nm cinsinden ölçülen bir bandpass filtre dalga boyundan APD'deki ilgili kanalına dönüştürmek gerekir. Şekil 2'de gösterilen tablo bir kılavuz sunmaktadır, ancak Hint-1'in iki floresan imzası (kalsiyuma bağlı ve kalsiyumsuz) için optimum dedektörler ampirik olarak belirlenmelidir. Bu, Hint-1 (kalsiyuma bağlı) sinyalini üretmek için İonomisin kullanılarak tek lekeli Hint-1 örnekleri ve Hint-1 (kalsiyumsuz) sinyalini üretmek için bir kalsiyum şelatlama ajanı olan EGTA kullanılarak gerçekleştirilir. Tam spektrumlu akış sitometrisi kullanılarak yapılan analizden sonra, her Hint-1 imzası için tepe floresan yoğunluğunu gösteren kanal görselleştirilebilir (Şekil 3A). Pozitif popülasyonların MFI'sini negatif popülasyonlarınkine normalleştirerek, Hint-1 floresanındaki kalsiyumsuz olandan kalsiyuma bağlı olana geçiş belirlenebilir (Şekil 3B). Bu görüntü, hem bağlı hem de serbest Indo-1 için başvuru denetimleri kullanılarak bir çalışma kitabında (.xls) oluşturulur ve MFI normalleştirmesi için açık pozitif ve negatif kapılara sahip negatif ve pozitif aralıklı bir kapı çizilir (Şekil 3A). Örnek MFI istatistikleri, istatistik tablosuna sağ tıklayarak da elde edilebilir. Yazılımda, pozitif popülasyonu negatif popülasyona bölerek MFI oranını belirleyin ve iki spektrumu tek bir ekranda kaplayın (Şekil 3B, sağda). Sarı noktalı ok, hem bağlı hem de serbest Hint-1'in spektral imzaları arasındaki normalleştirilmiş spektral farklılıkları gösterir.
T-hücresi reseptör stimülasyonunu takiben kalsiyum yanıtlarını değerlendirmek için, Hint-1 floresansı, Şekil 4'te gösterildiği gibi, ilgilenilen hücre popülasyonlarına geçit verdikten sonra değerlendirilir. İlk olarak, akışkan stabilitesini değerlendirmek için yan saçılmaya karşı bir zaman grafiği (SSC-A) incelenir; zaman ekseni boyunca kararlı tutarlı bir sinyal kararlılığı gösterir (Şekil 4A). Daha sonra, ileri ve yan saçılma (FSC-A ve SSC-A) görselleştirilir ve lenfosit popülasyonu gösterildiği gibi (Şekil 4B) geçitlenir. Lenfosit kapısından sonra, alana karşı yan saçılma yüksekliği grafiği oluşturularak tek bir hücre ayrım kapısı uygulanır (SSC-H ve SSC-A) ve diyagonal üzerine düşen singlet'lar Şekil 4C'de gösterildiği gibi geçitlenir. Singlet'lar daha sonra canlılık boyası ile boyama incelenerek ve negatif popülasyon üzerinde geçit verilerek canlılık açısından değerlendirilir (Şekil 4D). Son olarak, T-hücrelerini analiz etmek için, CD19-negatif popülasyon üzerinde geçit verilerek bir B-hücresi dökümü / iç negatif kontrol kapısı uygulanır (Şekil 4E). CD19-negatif popülasyon daha sonra CD4 ve CD8'e karşı antikorlar kullanılarak T-hücresi alt kümeleri için değerlendirilir (Şekil 4F); Gösterilen örnek, zamana karşı Hint-1 (kalsiyuma bağlı) floresansı görselleştirerek kalsiyum yanıtları için CD4 + T hücrelerini inceler (Şekil 4G). Bir zaman diliminde geçit yaptıktan sonra, Hint-1 (kalsiyumsuz) ve Hint-1 (kalsiyuma bağlı) grafiği de oluşturulabilir (Şekil 4H). Bu analiz daha sonra Hint-1 oranını türetmek için kullanılacaktır (bkz. akış sitometri analiz yazılımında kalsiyum akışı eğrisi analizi yöntemleri).
Analizin bu noktasında, Hint-1'in (kalsiyuma bağlı) iki boyutlu grafiği içindeki anları, ilgilenilen bireysel hücre popülasyonlarındaki zamana karşı analiz etmek yararlı olabilir. En uygun zaman noktaları, TCR stimülasyonundan önce Hint-1'e bağlı temel kalsiyumu, pik yanıtı, hücre içi kalsiyum seviyeleri azaldıkça tepe yanıtından birkaç dakika sonra bir zaman noktasını ve son olarak iyonomisin eklenerek ortaya çıkan kalsiyum yanıtını içerir (Şekil 5A). Anti-CD3 antikor ilavesinden önceki temel numunede, zayıf bir Hint-1 (kalsiyuma bağlı) sinyali tespit edilir. Tepe tepkisi sırasında, hücreler güçlü bir Hint-1 (kalsiyuma bağlı) sinyal ve Hint-1'in (kalsiyumsuz) floresansının azaldığını gösterir. Zirveden 5 dakika sonra, Hint-1 floresansı neredeyse taban çizgisine geri döndü. Numuneye iyonomisin eklendikten sonra, hücrelerin yeterli boya yüklemesini sağlayan sağlam bir Hint-1 (kalsiyuma bağlı) sinyali görselleştirilebilir. Nadir hücre popülasyonları (% <1) türev analizi için zor olabilir; Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, nadir popülasyonların analizi, CD4 + hücreleri, TCRb + hücreleri, TCRyg + hücreleri, CD25 + hücreleri, iNKT hücreleri ve CD19 + hücreleri gibi ilgilenilen her popülasyona geçit verdikten sonra Hint-1'e (kalsiyuma bağlı) karşı Hint-1'i (kalsiyumsuz) çizerek yapılabilir (Şekil 5B, C). TCRγδ + T hücrelerinde ve iNKT hücrelerinde (CD1d / α-galcer +) kolayca tespit edilebilen kalsiyum yanıtına dikkat edin. Karışık bir murin T-hücresi popülasyonu içindeki yüzey proteinlerinin karşılaştırılması için, ilgilenilen alt kümeleri gösteren iki boyutlu grafikler oluşturuldu. Aşağıda, her bir alt küme için tüm zaman boyunca kalsiyum yanıtının analizi gösterilmektedir (Şekil 5C).
Bu tahlil aynı zamanda T hücrelerinde vahşi tipten gen hedefli farelere karşı biyolojik farklılıklar belirlemek için veya tedavi edilmeyen T hücrelerinde farmakolojik inhibitörlerle tedavi edilmeye karşı kullanılabilir. Şekil 6'da gösterilen örnekte, T hücreleri, T hücresi tirozin kinazların, ITK ve RLK 9,10'un küçük bir molekül inhibitörü olan PRN694 ile tedavi edildi. ITK / RLK'nın inhibisyonu, T-hücresi reseptör sinyalini sönümleyerek T-hücresi reseptör stimülasyonunu takiben kalsiyum yanıtının azalmasına neden olur11 (Şekil 6A). ITK / RLK inhibisyonunun etkilerini ölçmek için, Hint-1 (kalsiyuma bağlı) ile Hint-1 (kalsiyum içermeyen) floresan oranını gösteren eğriler daha sonra eğrinin altındaki alan (AUC) veya her koşul için eğrinin eğimi için analiz edilebilir (Şekil 6B, C). Bu niceleme, kalsiyum yanıtının zaman seyrini ayrı segmentlere ayırarak (Şekil 6A) ve gösterildiği gibi her segment için eğrinin altındaki alanı veya eğrinin eğimini değerlendirerek gerçekleştirilir (Şekil 6B, C). Genel olarak, bu protokol, tam spektrumlu akış sitometrisinin, araştırılan bağışıklık hücresi popülasyonlarında çoklu hücre yüzey belirteçleri ile birlikte kalsiyum akışını ölçmek için kullanılabileceğini göstermektedir. Bu sonuçlar, toplam popülasyonun% 1'inden fazlasını temsil eden hücre alt kümelerinin zaman içinde kalsiyum akışı için değerlendirilebileceğini göstermektedir. Buna karşılık, daha az miktarda hücre alt kümeleri, zaman anlarını kullanarak alternatif analiz gerektirir.
Kalsiyum yanıt verilerinin istatistiksel analizi, deneysel soruya ve yapılmakta olan biyolojik testlere özgüdür. Makalede sunulan verilerde, deneysel doğruluğu ve metodolojinin sağlamlığını sağlamak için replikalarla deneyler yapılmıştır; Bununla birlikte, farklı günlerde farklı biyolojik örnekler üzerinde çoklu deneyler yapılmamıştır. Bu nedenle sunulan veriler üzerinde istatistiksel analizlerin yapılması uygun olmayacaktır.
Şekil 1: Kalsiyum tahlili iş akışının şeması. Hint-1 ester kalsiyum gösterge boyasının kullanımı, bağışıklık hücrelerinde ve alt popülasyonlarında kalsiyum akışını görselleştirmek için bir araç sağlar. Bu şematik, murin dalak T hücrelerinde kalsiyum yanıtlarının analizi için iş akışını özetlemektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: PMT dalga boylarının APD kanallarına dönüşümü. Tam spektrumlu akış sitometresi, UV lazer tarafından uyarıldıktan sonra floresan emisyonlarını tespit etmek için 16 dedektöre sahiptir. Her dedektörün özellikleri tabloda belirtilmiştir. Vurgulanan, tek lekeli kontroller kullanılarak ampirik olarak belirlendiği gibi, Hint-1 floresansının değerlendirilmesi için kullanılan iki dedektördür. APD dalga boyuna dönüşümler ve spektral akış sitometresi için kullanım kılavuzu mevcuttur11. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Hint-1 spektral imzasının görselleştirilmesi. (A) Üst: İyonomisin girişini takiben CD8 + T-hücrelerinde Hint-1 floresansının spektral imzası, sağlam bir kalsiyum akışı ortaya çıkarır. Hint-1'in zirvesi (kalsiyuma bağlı) UV1'de görselleştirilebilir. Alt: UV7'deki tepe floresansını gösteren Hint-1'in (kalsiyumsuz) spektral imzası. Bu kontrol örneği, herhangi bir hücre dışı serbest kalsiyumu şelatlamak için Hint-1 yüklü hücrelerin EGTA12 ile muamele edilmesiyle oluşturulmuştur. (B) Hint-1 imzasının birleştirilmiş beş lazer spektrum bindirmesi, solda ham spektral MFI'yi ve sağda serbest Hint-1'e karşı Hint-1'e bağlı normalleştirilmiş spektrumları gösterir. Turuncu renkteki Hint-1'den (kalsiyumsuz) mavi renkteki Hint-1'e (kalsiyuma bağlı) geçişin görselleştirilmesi kolayca tespit edilebilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Kalsiyum yanıtlarının görselleştirilmesi için geçit stratejisi. Örneklerin sıralı geçit geçişi için iş akışı özetlenmiştir. (A) Akışkan stabilite, SSC-A kapısına karşı bir zaman kullanılarak incelenir. (B) FSC-A'ya karşı SSC-A, lenfositleri geçmek için kullanılır, böylece numunedeki hücre kalıntılarını ve artık kırmızı kan hücrelerini ortadan kaldırır. (C) Tek hücreler SSC-H ve SSC-A grafiği kullanılarak kapatılır. (D). Singlet kapısı daha sonra SSC-A'ya karşı canlı ölü Ghost540'ın bir arsasına uygulanır; Ghost540-negatif hücreler üzerindeki geçit, sonraki analizlerden canlı olmayan hücreleri ortadan kaldırır. (E) Canlı hücreler CD19 ve SSC-A için analiz edilir ve CD19-negatif hücreler (B olmayan hücreler) kapılıdır. (F) CD19-negatif hücreler CD4'e karşı CD8 boyaması açısından incelenir. (G) CD4 + hücreleri daha sonra Hint-1'e (kalsiyuma bağlı) karşı zamanı görselleştirmek için kapılıdır. (H) Hint-1 (kalsiyumsuz) ve Hint-1 (kalsiyuma bağlı) floresansı görselleştirilerek anti-CD3 antikor ilavesini takiben kalsiyum akışı yanıtının başlatılmasını temsil etmek üzere zaman içinde bir an seçilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Kalsiyum yanıtındaki ayrı zaman noktalarında murin timositlerin kapılı popülasyonlarında Hint-1 floresansının görselleştirilmesi. Total timositler anti-CD3 antikoru ile uyarıldı ve ardından örnek toplanmasından 6 dakika sonra iyonomisin takip edildi. Dört ayrı zaman noktasında, Hint-1'e (kalsiyuma bağlı) karşı iki boyutlu zaman çizelgelerinde özetlenen dikdörtgen kutularda belirtildiği gibi, kalsiyum yanıtları için timositlerin farklı alt popülasyonları incelendi. (A) Temel Hint-1 sinyali, tepe tepkisi, pik sonrası 5 dakika tepkisi ve iyonomisine verilen yanıt için geçit gösteren iki boyutlu grafikler. Her grafiğin altında CD4'e karşı CD8 boyama (solda) ve kapılı CD4 tek pozitif (SP) timositlerde Hint-1'e (kalsiyumsuz) karşı Hint-1 (kalsiyuma bağlı) grafiği gösterilmiştir. (B) Timositlerin kapılı alt kümeleri üzerindeki Hint-1 (kalsiyum içermeyen) ve Hint-1 (kalsiyuma bağlı) grafikleri, (A)'da gösterilen geçit stratejisi kullanılarak dört zaman noktasının her birinde gösterilir. (C) Toplam timositlerin belirtilen antikorlarla boyanmasını gösteren iki boyutlu grafikler oluşturuldu. Spesifik alt kümeler kapılı (üst sıra) açıldı ve zamana karşı kalsiyum yanıtları açısından incelendi (altta). Açık mavi (SP) CD8+ popülasyonu, en büyük kalsiyum akışını sergileyen kırmızı (SP) CD4 popülasyonu, turuncu CD4+CD8+ çift pozitif timositler, koyu yeşil iNKT hücreleri, açık yeşil CD25+, mor TCRγδ+ T-hücreleri ve siyah CD19+ B hücreleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Küçük moleküllü bir ITK / RLK inhibitörü ile tedavi edilen CD8 + T hücrelerinde kalsiyum yanıtının inhibisyonu. Hint-1 boya yüklemesi sırasında, splenositler iki doz PRN694, 100 nM (koyu gri) ve 200 nM (açık gri) ile tedavi edildi. (A) Hint-1 oranı (kalsiyuma bağlı/kalsiyumsuz), tedavi edilmemiş hücreler (kırmızı) ve PRN694 ile tedavi edilen hücreler için zamana karşı gösterilmiştir. Eğriler, kapılı CD8 + T hücrelerinin kalsiyum tepkisini gösterir. Siyah çizgi, Hint-1 ile yüklü ve yüzey boyalı, ancak anti-CD3 antikoru ile uyarılmayan splenositlerin negatif kontrolünü temsil eder. (B,C) Veriler, (A) 'da gösterilen zaman eksenini, siyah noktalı çizgilerle görselleştirilen sekiz parçaya bölerek ve yanıtın her zaman aralığında eğrinin (AUC) (B) altındaki alanı veya her eğrinin (eğim) (C) eğimini hesaplayarak analiz edilebilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, tam spektrumlu akış sitometrisi 7,8 kullanarak titre edilmiş Hint-1 oranmetrik indikatör boyası ile yüklenen primer murin T-hücrelerinde kalsiyum yanıtlarını ölçmek için tasarlanmış optimize edilmiş bir tahlili açıklamaktadır. Tam spektrumlu akış sitometrisi kullanarak kalsiyum akısı testleri yapmanın avantajı, Indo-1 floresansının değerlendirilmesi ile birlikte yüzey hücresi belirteci boyamasını çoklama yeteneğidir. Tam spektrumlu akış sitometrisi, yüksek oranda örtüşen boyaların kullanılmasına izin verme avantajına sahiptir, böylece bir panelde kullanılabilecek belirteçlerin sayısını arttırır. Bunun nedeni, tam spektrumlu akış sitometresinin, bir florokroma adanmış bir dedektöre sahip olmak yerine, analiz edilen her numune için bir dizi dedektör boyunca yayılan tüm lazer ışığını toplamasıdır. Her florun tüm spektrumunun kullanılması, tahlilin daha yüksek hassasiyetine izin verir ve bir bant geçişli akış sitometresinde toplanırsa örtüşen sinyallere sahip olacak spektral olarak benzersiz florokromları tanımlamak için bir araç sağlar. Bu aynı zamanda incelenen bir hücre alt kümesinin ön izolasyonu ihtiyacını da ortadan kaldırır.
Bu çalışmada, bir hücre yüzey belirteçleri paneli florokrom konjuge antikorlarla değerlendirildi. Bu panelde αCD4-APC-Cy7, αCD8-FITC, αCD19-PE, αTCRβ-PerCP-Cy5.5, α-TCRδ-PE-Cy5, αCD25-PE-Cy7 ve CD1d-αgal-cer tetramer-APC; Buna ek olarak, panelde canlı ölü Ghost540 boyası da yer aldı. Bu florokromların her birini tespit etmek için en uygun kanal, tam spektrumlu akış sitometresi kullanım kılavuzu13'te mevcuttur. Buna karşılık, Hint-1 (kalsiyumsuz) ve Hint-1'in (kalsiyuma bağlı) tespiti ampirik olarak belirlendi, ancak her bir floresan imzasının tespiti için yaklaşık bir tepe kanalı, iki Hint-1 formu için bilinen tepe emisyon dalga boylarına dayanarak tahmin edildi. Geleneksel akış sitometrelerinde kullanılan ve nm cinsinden ölçülen bandpass filtre dalga boylarından pik emisyon dalga boylarını, tam spektrumlu akış sitometresi tarafından kullanılan Avalanche Photo Diode (APD) dedektörlerinde ilgili kanallarına dönüştürmek de mümkündür; Bu aynı zamanda sırasıyla Hint-1 (kalsiyum içermeyen) ve Hint-1'i (kalsiyuma bağlı) tespit etmek için en uygun kanalların bir tahminini sağlayabilir. Her floresan etiketi için tek boyalı kontroller dahil edildiğinden, karıştırma işlemi floresan imzalarını dekonvolute ederek her florokromun yoğunluğunun her numunedeki hücreler üzerinde görselleştirilmesini sağlar. Bu yöntemde açıklandığı gibi, veri analizi, ilgilenilen hücre alt kümelerine geçit vererek ve tespit edilen Hint-1 (kalsiyumsuz) ve Hint-1'in (kalsiyuma bağlı) zamana oranını görselleştirerek gerçekleştirilebilir.
Bu tahlilin sınırlamaları vardır. Örneğin, 3 μM'nin altındaki Hint-1 konsantrasyonları, T hücrelerinde kalsiyum akışı tepkisinin başarılı bir şekilde görselleştirilmesine izin vermedi. Bu tahlil aynı zamanda tam spektrumlu akış sitometrisi kullanılarak heterojen hücre popülasyonları üzerinde çoklu hücre yüzey belirteçlerinin analizi ile kalsiyum yanıtının çoğullama ölçümlerini de içerdiğinden, tek boyalı kontroller için kullanılanlar da dahil olmak üzere kullanılan floresan etiketli tüm antikorları dikkatlice titre etmek zorunludur. Bu, son derece hassas doğrusal karıştırma çözme algoritması14'ün başarılı bir şekilde uygulanması için önemlidir. Ek olarak, analiz edilen toplam popülasyonun% 1'inden azını temsil eden hücre alt kümeleri için kalsiyum akışının tam bir zaman seyri görselleştirilemedi. Bunun yerine, bu nadir alt kümelerdeki kalsiyum yanıtının değerlendirilmesi,zaman 15'teki anları kullanarak alternatif bir analiz stratejisi gerektirdi. Zaman analizindeki anlar, yanıtın tüm zaman seyrinden ziyade, kalsiyum yanıtının ayrı aşamalarında Hint-1'e (kalsiyum bağlı) karşı Hint-1'in (kalsiyum bağımlı) floresan sinyallerinin anlık görüntülerini sağlar. Son olarak, T hücrelerinin alt kümelerini tanımlamak için tek yüzey belirteçleri kullanmanın sınırlamalarını tanımak da önemlidir. Örneğin, timositlerin α-CD25 antikoru ile boyanması, CD4 + düzenleyici T hücrelerini diğer tüm timosit popülasyonlarından ayırt etmek için yeterli değildir. Bunun nedeni, erken timosit progenitör (CD4-CD8-) hücrelerinin çoğunluğunun CD2516'yı da eksprese etmesidir. Bunun, kapılı CD4 + CD25 + timositlerde saptanabilir bir kalsiyum akışı yanıtının bulunmamasını açıklaması muhtemeldir.
Bu protokolün optimizasyonu, tahlil başarısının anahtarı olan çeşitli değişkenlerin dikkatli bir şekilde değerlendirilmesini gerektiriyordu. Bunlar, kullanılan anti-CD3 antikorunun spesifik klonunun optimizasyonunu, bu antikorun optimal konsantrasyonunun titrasyonunu ve geleneksel biyotin / streptavidin sistemini kullanarak antikor çapraz bağlama ihtiyacını içerir. Murin T-hücreleri için, 500 μL'lik bir hacimde 6 x 106 hücre için 30 μg / numune konsantrasyonunun, optimal kalsiyum yanıtları için gerekli minimum antikor miktarı olduğu bulunmuştur. İlginç bir şekilde, anti-CD3 antikor klonu 17A2 ile sağlam kalsiyum yanıtları gözlendi, ancak klon 145-2C11 ile gözlenmedi; Ayrıca, klon 17A2 kullanırken, ikincil bir çapraz bağlama reaktifi eklemek gereksizdi17. Streptavidin içeren veya içermeyen biyotinile anti-CD3 klonu 17A2 kullanılarak yapılan testler, streptavidin çapraz bağlanması varlığında kalsiyum yanıtında herhangi bir artış göstermedi. Bu antikorun agregaları içermesi ve bu agregaların, açık çapraz bağlanmanın yokluğunda antikorun stimülasyon etkinliğini hesaba katması mümkündür. Bununla birlikte, bu deneyler aylar boyunca bu anti-CD3 antikorunun farklı şişeleriyle gerçekleştirildiğinden, elde edilen sonuçlar oldukça tekrarlanabilirdi; Bu nedenle, bu antikorun T hücrelerini uyarma yeteneğinin kullanıcılar arasında değişmesi muhtemel değildir.
Birincil T hücrelerindeki sağlam kalsiyum yanıtları, numune alımı boyunca hücrelerin 37 ° C'lik biyolojik sıcaklıkta tutulmasını gerektirir; Buna karşılık, birincil B hücreleri oda sıcaklığında anti-IgM antikoruna kalsiyum yanıtı gösterecektir. T hücresi kalsiyum tepkisinin sıcaklığa duyarlılığına bağlı olarak, her numunenin aynı şekilde muamele görmesini sağlamak kritik öneme sahiptir; Örneğin, her numune aynı yöntem kullanılarak ve aynı süre boyunca 37 ° C'ye ısıtılmalıdır. Bu tutarlılığın yokluğunda, kalsiyum yanıtlarındaki değişiklikler gözlenebilir, ancak numuneler arasındaki biyolojik olarak ilgili farklılıkların göstergesi olmayabilir.
Özetle, bu protokol, multipleks yüzey hücresi belirteci boyaması ile kombinasyon halinde tam spektrumlu akış sitometrisi kullanılarak Indo-1 floresansının değerlendirilmesine dayanan kalsiyum akısı testlerinin gerçekleştirilmesinin ayrıntılarını açıklamaktadır. Bu yöntem, araştırmacıların kalsiyum boya etiketlemesinden önce belirli hücre popülasyonlarının izolasyonuna veya sınıflandırılmasına ihtiyaç duymamalarını sağlar. Ayrıca, bu protokol, farklı hücre alt popülasyonları içindeki zaman içinde ayrı anlarda kalsiyum tepkilerini görselleştirmek için kullanılan ek bir analiz metodolojisini özetlemektedir. Zaman analizindeki momentler, kalsiyum yanıt eğrisinin tamamını değerlendirirken başka türlü tespit edilemeyen nadir (toplamın% <1'i) hücre popülasyonlarına başarıyla uygulanabilir. Gelecekte, bu tahlil, tam spektrumlu akış sitometresinin kapsamlı yeteneklerinden yararlanarak, ek florokrom-konjuge antikorların kullanımına genişletilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların beyan edecekleri rakip çıkarları yoktur.
Acknowledgments
R01AI132419, CU | AMC İmmünomikro Akış Sitometrisi Paylaşılan Kaynak, RRID: SCR_021321, Aurora ve SpectroFlo yazılımı üzerinde tam spektral sitometrik analizin sürekli tartışmaları için Cytek'teki meslektaşlarımıza çok teşekkür ederiz. Figürler BioRender.com ile oluşturulmuştur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 well TC treated plates | Cell Treat | 229111 | |
| 50 mL conical | Greiner Bio1 | 41-12-17-03 | 50 mL Polypropylene centrifuge tubes with cap |
| 5mL polysterene flow tubes | Corning | 352052 | |
| 5mL syringe | BD syringe | 309646 | plunger only is used sheith is discarded |
| 70uM filter | Greiner bio1 | 542070 | |
| aCD3 (17A2) | Biolegend | 100202 | |
| AKC lysis Buffer | Gibco | A1049201 | |
| Aurora Spectral Flowcytometer | https://cytekbio.com/pages/aurora | ||
| Bath Beads | coleparmer | Item # UX-06274-52 | |
| CD19 PE | Tonbo | 50-0193-U100 | |
| CD1d Tetramer APC | NIH | ||
| CD25 PECy7 | ebioscience | 15-0251 | |
| CD4 APC Cy7 | Tonbo | 25-0042-U100 | |
| CD8a FITC | ebioscience | 11-0081-85 | |
| Cell Incubator | Formal Scientific | ||
| Dissection Tools forceps | McKesson | #487593 | Tissue Forceps McKesson Adson 4-3/4 Inch Length Office Grade Stainless Steel NonSterile NonLocking Thumb Handle 1 X 2 Teeth |
| Dissection Tools Scissors | McKesson | #970135 | Operating Scissors McKesson Argent™ 4-1/2 Inch Surgical Grade Stainless Steel Finger Ring Handle Straight Sharp Tip / Sharp Tip |
| DPBS 1x | Gibco | 14190-136 | DPBS |
| EGTA | Fisher | NC1280093 | |
| FBS | Hyclond | SH30071.03 | lot AE29165301 |
| FlowJo Software | https://www.flowjo.com/ | ||
| Indo1-AM Ester Dye | ebioscience | 65-085-39 | Calcium Loading Dye |
| ionomycin | Millipore | 407951-1mg | |
| Live/Dead Ghost 540 | Tonbo | 13-0879-T100 | |
| Microcentrifuge tubes 1.7mL | Light Labs | A-7001 | |
| Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine | Gibco | 10378-016 | |
| PRN694 | Med Chem Express | Hy-12688 | |
| Purified Anti-Mouse CD16/CD32 (FC Shield) (2.4G2) | Tonbo | 70-0161-M001 | FC Block |
| RPMI | Gibco | 1875093 | + phenol red |
| RPMI phenol free | Gibco | 11835030 | -phenol red |
| Table top centrifuge | Beckman Coulter | Allegra612 | |
| TCRβ PerCP Cy5.5 | ebioscience | 45-5961-82 | |
| TCRγ/δ Pe Cy5 | ebioscience | 15-5961-82 | |
| Vi-Cell Blu Reagent Pack | Product No: C06019 | Includes Tripan | |
| Vi-Cell Blu | Beckman Coulter | ||
| Waterbath | Fisher Brand Dry bath |
References
- Weiss, A., Imboden, J., Shoback, D., Stobo, J. Role of T3 surface molecules in human T-cell activation: T3-dependent activation results in an increase in cytoplasmic free calcium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (13), 4169-4173 (1984).
- Huang, G. N. Cell calcium mobilization study (flow cytometry). Bio-Protocol. 2 (9), 171 (2012).
- June, C. H., Moore, J. S. Measurement of intracellular ions by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. , Chapter 5, Unit 5.5 (2004).
- Posey, A. D., Kawalekar, O. U., June, C. H. Measurement of intracellular ions by flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. 72, 1-21 (2015).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- McKinnon, K. M.
- Nolan, J. P., Condello, D.
- Bonilla, D. L., Reinin, G., Chua, E. Full spectrum flow cytometry as a powerful technology for cancer immunotherapy research. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 612801 (2021).
- Zhong, Y., et al. Targeting Interleukin-2-inducible T-cell Kinase (ITK) and Resting Lymphocyte Kinase (RLK) using a novel covalent inhibitor PRN694. The Journal of Biological Chemistry. 290 (10), 5960-5978 (2015).
- Gallagher, M. P., et al. Hierarchy of signaling thresholds downstream of the T-cell receptor and the Tec kinase ITK. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (35), 2025825118 (2021).
- Andreotti, A. H., Schwartzberg, P. L., Joseph, R. E., Berg, L. J. T-Cell signaling regulated by the tec family kinase, Itk. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (7), 002287 (2010).
- Nakamura, Y. EGTA can inhibit vesicular release in the nanodomain of single Ca2+ channels. Frontiers in Synaptic Neurosciene. 11, 26 (2019).
- Cytek Aurora Users Guide. Cytek. , Available from: https://depts.washington.edu/flowlab/Cell%20Analysis%20Facility/Aurora%20User%20Guide.pdf (2022).
- SpctroFlo Software. Cytek. , Available from: https://cytekbio.com/pages/spectro-flo (2022).
- FlowJo Software. Becton-Dickinson. , Available from: https://www.flowjo.com/solutions/flowjo (2022).
- Godfrey, D. I., Zlotnik, A. Control points in early T-cell development. Immunology Today. 14 (11), 547-553 (1993).
- Vossen, A. C., et al. Fc receptor binding of anti-CD3 monoclonal antibodies is not essential for immunosuppression, but triggers cytokine-related side effects. European Journal of Immunology. 25 (6), 1492-1496 (1995).
