Denne protokol beskriver en metode til vurdering af funktionen af mekanisk aktiverede ionkanaler i native urothelceller ved hjælp af den fluorescerende Ca2+ sensor GCaMP5G.
Mekanisk aktiverede ionkanaler er biologiske transducere, der konverterer mekaniske stimuli såsom stræk- eller forskydningskræfter til elektriske og biokemiske signaler. Hos pattedyr er mekanisk aktiverede kanaler afgørende for påvisning af eksterne og interne stimuli i processer så forskellige som berøringsfornemmelse, hørelse, regulering af røde blodlegemer, regulering af basalt blodtryk og følelsen af urinblærens fylde. Mens funktionen af mekanisk aktiverede ionkanaler er blevet grundigt undersøgt in vitro-indstillingen ved hjælp af patch-clamp-teknikken, er det stadig en vanskelig opgave at vurdere deres funktion i deres oprindelige miljø, ofte på grund af begrænset adgang til disse kanalers ekspressionssteder (f.eks. afferente terminaler, Merkelceller, baroreceptorer og nyretubuli) eller vanskeligheder med at anvende patch-clamp-teknikken (f.eks. de apikale overflader af urotheliale paraplyceller). Denne protokol beskriver en procedure til vurdering af mekanisk fremkaldteCa2 +-transienter ved hjælp af fluorescerende sensor GCaMP5G i et ex vivo urothelialt præparat, en teknik, der let kan tilpasses til undersøgelse af mekanisk fremkaldte Ca2+ -hændelser i andre native vævspræparater.
Epitelceller i urinvejene udsættes for mekaniske kræfter, når urinfiltratet bevæger sig gennem nefronerne, og urinen pumpes ud af nyrebækkenet og bevæger sig gennem urinlederne, der skal opbevares i urinblæren. Det har længe været anerkendt, at mekaniske kræfter (fx forskydningsspænding og strækning), der udøves af væsker på epitelcellerne, der styrer urinvejen, regulerer reabsorptionen af protein i det proksimale rør og af opløste stoffer i den distale nefron: 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13, samt opbevaring af urin i urinblæren og mikturering14,15,16,17.
Omdannelsen af mekaniske stimuli til elektriske og biokemiske signaler, en proces kaldet mekanotransduktion, medieres af proteiner, der reagerer på deformation af cellulære strukturer eller den tilhørende ekstracellulære matrix 18,19,20,21. Mekanisk aktiverede ionkanaler er unikke i den forstand, at de overgår fra en lukket tilstand til en åben permeabel tilstand som reaktion på ændringer i membranspænding, tryk eller forskydningsspænding 18,19,20,21,22. Derudover kan Ca 2+ transienter initieres ved integrinmedieret mekanotransduktion eller ved aktivering af mekanoresponsive adhæsionssystemer ved celle-celle-krydsninger23,24,25,26. Ionkanalfunktionen vurderes normalt med patch-clamp-teknikken, som involverer dannelsen af en gigaohm forsegling mellem cellemembranen og plasterpipetten27. Imidlertid er celler placeret i dybe vævslag med en tæt ekstracellulær matrix (f.eks. Nyretubuli) eller omgivet af en fysisk barriere (f.eks. Glycocalyx) vanskelige at få adgang til med en glasmikropipette. På samme måde kan celler, der er indlejret, eller som er integrerede dele af væv med dårlig mekanisk stabilitet (f.eks. Urothelium), ikke let studeres med patch-clamp-teknikken. Fordi mange mekanisk aktiverede ionkanaler er gennemtrængelige for Ca 2+, er en alternativ tilgang at vurdere deres aktivitet ved fluorescerende mikroskopi ved hjælp af et Ca2+-følsomt farvestof eller genetisk kodede calciumindikatorer (GECI’er) såsom GCaMP. Nylige bestræbelser inden for proteinteknik har signifikant øget det dynamiske område, følsomhed og respons af GECI’er28,29,30, og fremskridt inden for genetik har tilladt deres ekspression i specifikke cellepopulationer, hvilket gør dem ideelle til at studere mekanotransduktion.
Urothelium, det stratificerede epitel, der dækker det indre af urinblæren, fungerer som en barriere, der forhindrer diffusion af urinopløste stoffer i blæreinterstitium, men fungerer også som en transducer, der registrerer blærefylde og kommunikerer disse begivenheder til de underliggende nerver og muskulatur16. Tidligere undersøgelser har vist, at kommunikationen mellem urothelium og underliggende væv kræver de mekanisk aktiverede ionkanaler Piezo1 og Piezo231. For at vurdere mekanisk inducerede Ca 2+ transienter i urothelceller blev der udviklet en ny teknik, der bruger adenoviral genoverførsel til at udtrykke Ca2+ sensoren GCaMP5G i urothelceller . Denne teknik anvender et slimhindearkpræparat, der giver nem adgang til det yderste paraplycellelag og et computerassisteret system til samtidig mekanisk stimulering af individuelle celler med en lukket glasmikropipette og registrering af ændringer i fluorescens over tid.
Alle organismer, og tilsyneladende de fleste celletyper, udtrykker ionkanaler, der reagerer på mekaniske stimuli 20,33,34,35,36,37. Funktionen af disse mekanisk aktiverede kanaler er overvejende blevet vurderet med patch-clamp-teknikken. På grund af tilgængelighedsproblemer har patch-clamp-undersøgelser af mekanisk aktive…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af NIH-tilskud R01DK119183 (til G.A. og MDC) og S10OD028596 (til G.A.) og af Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores fra Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307).
20x Objective | Olympus | UMPlanFL N | |
24 G ¾” catheter | Medline | Suresite IV slide | |
4x Objective | Olympus | UPlanFL N | |
Analog/digital converter | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
Anti-GFP antibody | Abcam | Ab6556 | |
Beam splitter | Chroma | T495lpxr | |
Bipolar temperature controller | Warner Instruments | TC-344B | |
CaCl2 | Fluka | 21114-1L | 1 M solution |
cellSens software | Olympus | Imaging software | |
CMOS camera | Hamamatsu | ORCA fusion | |
Donkey anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | |
Excel | Microsoft Corporation | ||
Filter | Chroma | ET470/40X | |
Glass capillaries Corning 8250 glass | Warner Instruments | G85150T-4 | |
Glucose | Sigma | G8270 | |
HEPES | Sigma | H4034 | |
Inline heater | Warner Instruments | SH-27B | |
KCl | Sigma | 793590 | |
Light source | Sutter Instruments | Lambda XL | |
Manifold pump tubing | Fisherbrand | 14-190-510 | ID 1.52 mm |
Manifold pump tubing | Fisherbrand | 14-190-533 | ID 2.79 mm |
MgCl2 | Sigma | M9272 | |
Mice | Jackson Lab | 664 | 2-4 months old female C57BL/6J |
Microforge | Narishige | MF-830 | |
Micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | |
Microscope | Olympus | BX51W | |
Mounting media with DAPI | Invitrogen | S36964 | Slowfade Diamond Antifade with DAPI |
NaCl | Sigma | S7653 | |
pClamp software | Molecular Devices | Version 10.4 | Patch-clamp electrophysiology data acquisition and analysis software |
Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | |
Piezoelectric actuator | Thorlabs | PAS005 | |
Pipette holder | World Precision Instruments | ||
Pipette puller | Narishige | PP-830 | |
Quick exchange heated base with perfusion and adapter ring kit | Warner Instruments | QE-1 | Quick exchange platform fits 35 mm dish |
Rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | |
Sigma-Plot | Systat Software Inc | Version 14.0 | Scientific graphing and data analysis software |
Silicone elastomer | Dow | Sylgard 184 | |
Single channel open-loop piezo controller | Thorlabs | MDT694B | |
Square grid holder pad | Ted Pella | 10520 | |
Suture | AD Surgical | S-S618R13 | 6-0 Sylk |
Teflon mounting rod | Custom made | Use to mount the piezoelectric actuator in the micromanipulator | |
Tubing | Fisher Scientific | 14171129 | Tygon S3 ID 1/16 IN, OD 1/8 IN |
USB Digital I/O device | National Instruments | NI USB-6501 |