Ex vivo Analyse af mekanisk aktiverede Ca2+ transienter i urothelceller
Summary
Denne protokol beskriver en metode til vurdering af funktionen af mekanisk aktiverede ionkanaler i native urothelceller ved hjælp af den fluorescerende Ca2+ sensor GCaMP5G.
Abstract
Mekanisk aktiverede ionkanaler er biologiske transducere, der konverterer mekaniske stimuli såsom stræk- eller forskydningskræfter til elektriske og biokemiske signaler. Hos pattedyr er mekanisk aktiverede kanaler afgørende for påvisning af eksterne og interne stimuli i processer så forskellige som berøringsfornemmelse, hørelse, regulering af røde blodlegemer, regulering af basalt blodtryk og følelsen af urinblærens fylde. Mens funktionen af mekanisk aktiverede ionkanaler er blevet grundigt undersøgt in vitro-indstillingen ved hjælp af patch-clamp-teknikken, er det stadig en vanskelig opgave at vurdere deres funktion i deres oprindelige miljø, ofte på grund af begrænset adgang til disse kanalers ekspressionssteder (f.eks. afferente terminaler, Merkelceller, baroreceptorer og nyretubuli) eller vanskeligheder med at anvende patch-clamp-teknikken (f.eks. de apikale overflader af urotheliale paraplyceller). Denne protokol beskriver en procedure til vurdering af mekanisk fremkaldteCa2 +-transienter ved hjælp af fluorescerende sensor GCaMP5G i et ex vivo urothelialt præparat, en teknik, der let kan tilpasses til undersøgelse af mekanisk fremkaldte Ca2+ -hændelser i andre native vævspræparater.
Introduction
Epitelceller i urinvejene udsættes for mekaniske kræfter, når urinfiltratet bevæger sig gennem nefronerne, og urinen pumpes ud af nyrebækkenet og bevæger sig gennem urinlederne, der skal opbevares i urinblæren. Det har længe været anerkendt, at mekaniske kræfter (fx forskydningsspænding og strækning), der udøves af væsker på epitelcellerne, der styrer urinvejen, regulerer reabsorptionen af protein i det proksimale rør og af opløste stoffer i den distale nefron: 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13, samt opbevaring af urin i urinblæren og mikturering14,15,16,17.
Omdannelsen af mekaniske stimuli til elektriske og biokemiske signaler, en proces kaldet mekanotransduktion, medieres af proteiner, der reagerer på deformation af cellulære strukturer eller den tilhørende ekstracellulære matrix 18,19,20,21. Mekanisk aktiverede ionkanaler er unikke i den forstand, at de overgår fra en lukket tilstand til en åben permeabel tilstand som reaktion på ændringer i membranspænding, tryk eller forskydningsspænding 18,19,20,21,22. Derudover kan Ca 2+ transienter initieres ved integrinmedieret mekanotransduktion eller ved aktivering af mekanoresponsive adhæsionssystemer ved celle-celle-krydsninger23,24,25,26. Ionkanalfunktionen vurderes normalt med patch-clamp-teknikken, som involverer dannelsen af en gigaohm forsegling mellem cellemembranen og plasterpipetten27. Imidlertid er celler placeret i dybe vævslag med en tæt ekstracellulær matrix (f.eks. Nyretubuli) eller omgivet af en fysisk barriere (f.eks. Glycocalyx) vanskelige at få adgang til med en glasmikropipette. På samme måde kan celler, der er indlejret, eller som er integrerede dele af væv med dårlig mekanisk stabilitet (f.eks. Urothelium), ikke let studeres med patch-clamp-teknikken. Fordi mange mekanisk aktiverede ionkanaler er gennemtrængelige for Ca 2+, er en alternativ tilgang at vurdere deres aktivitet ved fluorescerende mikroskopi ved hjælp af et Ca2+-følsomt farvestof eller genetisk kodede calciumindikatorer (GECI’er) såsom GCaMP. Nylige bestræbelser inden for proteinteknik har signifikant øget det dynamiske område, følsomhed og respons af GECI’er28,29,30, og fremskridt inden for genetik har tilladt deres ekspression i specifikke cellepopulationer, hvilket gør dem ideelle til at studere mekanotransduktion.
Urothelium, det stratificerede epitel, der dækker det indre af urinblæren, fungerer som en barriere, der forhindrer diffusion af urinopløste stoffer i blæreinterstitium, men fungerer også som en transducer, der registrerer blærefylde og kommunikerer disse begivenheder til de underliggende nerver og muskulatur16. Tidligere undersøgelser har vist, at kommunikationen mellem urothelium og underliggende væv kræver de mekanisk aktiverede ionkanaler Piezo1 og Piezo231. For at vurdere mekanisk inducerede Ca 2+ transienter i urothelceller blev der udviklet en ny teknik, der bruger adenoviral genoverførsel til at udtrykke Ca2+ sensoren GCaMP5G i urothelceller . Denne teknik anvender et slimhindearkpræparat, der giver nem adgang til det yderste paraplycellelag og et computerassisteret system til samtidig mekanisk stimulering af individuelle celler med en lukket glasmikropipette og registrering af ændringer i fluorescens over tid.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alle organismer, og tilsyneladende de fleste celletyper, udtrykker ionkanaler, der reagerer på mekaniske stimuli 20,33,34,35,36,37. Funktionen af disse mekanisk aktiverede kanaler er overvejende blevet vurderet med patch-clamp-teknikken. På grund af tilgængelighedsproblemer har patch-clamp-undersøgelser af mekanisk aktive…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af NIH-tilskud R01DK119183 (til G.A. og MDC) og S10OD028596 (til G.A.) og af Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores fra Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307).
Materials
| 20x Objective | Olympus | UMPlanFL N | |
| 24 G ¾” catheter | Medline | Suresite IV slide | |
| 4x Objective | Olympus | UPlanFL N | |
| Analog/digital converter | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Anti-GFP antibody | Abcam | Ab6556 | |
| Beam splitter | Chroma | T495lpxr | |
| Bipolar temperature controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| CaCl2 | Fluka | 21114-1L | 1 M solution |
| cellSens software | Olympus | Imaging software | |
| CMOS camera | Hamamatsu | ORCA fusion | |
| Donkey anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| Filter | Chroma | ET470/40X | |
| Glass capillaries Corning 8250 glass | Warner Instruments | G85150T-4 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Inline heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| KCl | Sigma | 793590 | |
| Light source | Sutter Instruments | Lambda XL | |
| Manifold pump tubing | Fisherbrand | 14-190-510 | ID 1.52 mm |
| Manifold pump tubing | Fisherbrand | 14-190-533 | ID 2.79 mm |
| MgCl2 | Sigma | M9272 | |
| Mice | Jackson Lab | 664 | 2-4 months old female C57BL/6J |
| Microforge | Narishige | MF-830 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | |
| Microscope | Olympus | BX51W | |
| Mounting media with DAPI | Invitrogen | S36964 | Slowfade Diamond Antifade with DAPI |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| pClamp software | Molecular Devices | Version 10.4 | Patch-clamp electrophysiology data acquisition and analysis software |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | |
| Piezoelectric actuator | Thorlabs | PAS005 | |
| Pipette holder | World Precision Instruments | ||
| Pipette puller | Narishige | PP-830 | |
| Quick exchange heated base with perfusion and adapter ring kit | Warner Instruments | QE-1 | Quick exchange platform fits 35 mm dish |
| Rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| Sigma-Plot | Systat Software Inc | Version 14.0 | Scientific graphing and data analysis software |
| Silicone elastomer | Dow | Sylgard 184 | |
| Single channel open-loop piezo controller | Thorlabs | MDT694B | |
| Square grid holder pad | Ted Pella | 10520 | |
| Suture | AD Surgical | S-S618R13 | 6-0 Sylk |
| Teflon mounting rod | Custom made | Use to mount the piezoelectric actuator in the micromanipulator | |
| Tubing | Fisher Scientific | 14171129 | Tygon S3 ID 1/16 IN, OD 1/8 IN |
| USB Digital I/O device | National Instruments | NI USB-6501 |
References
- Kunau, R. T., Webb, H. L., Borman, S. C. Characteristics of the relationship between the flow rate of tubular fluid and potassium transport in the distal tubule of the rat. Journal of Clinical Investigation. 54 (6), 1488-1495 (1974).
- Engbretson, B. G., Stoner, L. C. Flow-dependent potassium secretion by rabbit cortical collecting tubule in vitro. American Journal of Physiology. 253 (5), 896-903 (1987).
- Satlin, L. M., Sheng, S., Woda, C. B., Kleyman, T. R. Epithelial Na(+) channels are regulated by flow. American Journal of Physiology Renal Physiology. 280 (6), 1010-1018 (2001).
- Woda, C. B., et al. Ontogeny of flow-stimulated potassium secretion in rabbit cortical collecting duct: functional and molecular aspects. American Journal of Physiology Renal Physiology. 285 (4), 629-639 (2003).
- Malnic, G., Berliner, R. W., Giebisch, G. Flow dependence of K+ secretion in cortical distal tubules of the rat. American Journal of Physiology. 256 (5), 932-941 (1989).
- Khuri, R. N., Strieder, W. N., Giebisch, G. Effects of flow rate and potassium intake on distal tubular potassium transfer. American Journal of Physiology. 228 (4), 1249-1261 (1975).
- Good, D. W., Wright, F. S. Luminal influences on potassium secretion: sodium concentration and fluid flow rate. American Journal of Physiology. 236 (2), 192-205 (1979).
- Wong, K. R., Berry, C. A., Cogan, M. G. Flow dependence of chloride transport in rat S1 proximal tubules. American Journal of Physiology. 269 (6), 870-875 (1995).
- Garvin, J. L. Glucose absorption by isolated perfused rat proximal straight tubules. American Journal of Physiology. 259 (4), 580-586 (1990).
- Malnic, G., Klose, R. M., Giebisch, G. Micropuncture study of renal potassium excretion in the rat. American Journal of Physiology. 206 (4), 674-686 (1964).
- Malnic, G., Klose, R. M., Giebisch, G. Micropuncture study of distal tubular potassium and sodium transport in rat nephron. American Journal of Physiology. 211 (3), 529-547 (1966).
- Cabral, P. D., Garvin, J. L. Luminal flow regulates NO and O2(-) along the nephron. American Journal of Physiology. 300 (5), 1047-1053 (2011).
- Raghavan, V., Rbaibi, Y., Pastor-Soler, N. M., Carattino, M. D., Weisz, O. A. Shear stress-dependent regulation of apical endocytosis in renal proximal tubule cells mediated by primary cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8506-8511 (2014).
- Lewis, S. A., de Moura, J. L. Apical membrane area of rabbit urinary bladder increases by fusion of intracellular vesicles: an electrophysiological study. The Journal of Membrane Biology. 82 (2), 123-136 (1984).
- Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C. The neural control of micturition. Nature Reviews Neuroscience. 9 (6), 453-466 (2008).
- Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The urothelium: life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).
- Khandelwal, P., Abraham, S. N., Apodaca, G. Cell biology and physiology of the uroepithelium. American Journal of Physiology Renal Physiology. 297 (6), 1477-1501 (2009).
- Sachs, F. Stretch-activated ion channels: what are they. Physiology. 25 (1), 50-56 (2010).
- Martinac, B. Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction. Journal of Cell Science. 117 (12), 2449-2460 (2004).
- Ranade, S. S., Syeda, R., Patapoutian, A. Mechanically activated ion channels. Neuron. 87 (6), 1162-1179 (2015).
- Cox, C. D., Bavi, N., Martinac, B. Biophysical principles of ion-channel-mediated mechanosensory transduction. Cell Reports. 29 (1), 1-12 (2019).
- Carattino, M. D., Sheng, S., Kleyman, T. R. Epithelial Na+ channels are activated by laminar shear stress. Journal of Biological Chemistry. 279 (6), 4120-4126 (2004).
- Ross, T. D., et al. Integrins in mechanotransduction. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 613-618 (2013).
- Dieterle, M. P., Husari, A., Rolauffs, B., Steinberg, T., Tomakidi, P. Integrins, cadherins and channels in cartilage mechanotransduction: perspectives for future regeneration strategies. Expert Reviews in Molecular Medicine. 23, 14 (2021).
- Huveneers, S., de Rooij, J. Mechanosensitive systems at the cadherin-F-actin interface. Journal of Cell Science. 126, 403-413 (2013).
- Sun, Z., Guo, S. S., Fässler, R. Integrin-mediated mechanotransduction. Journal of Cell Biology. 215 (4), 445-456 (2016).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Archiv. European Journal of Physiology. 391 (2), 85-100 (1981).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2 (2013).
- Sun, X. R., et al. Fast GCaMPs for improved tracking of neuronal activity. Nature Communications. 4, 2170 (2013).
- Dalghi, M. G., et al. Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception. JCI Insight. 6 (19), 152984 (2021).
- Durnin, L., et al. An ex vivo bladder model with detrusor smooth muscle removed to analyse biologically active mediators released from the suburothelium. The Journal of Physiology. 597 (6), 1467-1485 (2019).
- Delmas, P., Coste, B. Mechano-gated ion channels in sensory systems. Cell. 155 (2), 278-284 (2013).
- Tavernarakis, N., Driscoll, M. Degenerins. At the core of the metazoan mechanotransducer. Annals of the New York Academy of Sciences. 940 (1), 28-41 (2001).
- Peyronnet, R., Tran, D., Girault, T., Frachisse, J. M. Mechanosensitive channels: feeling tension in a world under pressure. Frontiers in Plant Science. 5, 558 (2014).
- Blount, P., Iscla, I. Life with bacterial mechanosensitive channels, from discovery to physiology to pharmacological target. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 84 (1), 00055 (2020).
- Booth, I. R., Miller, S., Müller, A., Lehtovirta-Morley, L. The evolution of bacterial mechanosensitive channels. Cell Calcium. 57 (3), 140-150 (2015).
