Ex Vivo Analyse van mechanisch geactiveerde Ca2+ transiënten in urotheelcellen
Summary
Dit protocol beschrijft een methodologie om de functie van mechanisch geactiveerde ionkanalen in inheemse urotheliale cellen te beoordelen met behulp van de fluorescerende Ca2+ sensor GCaMP5G.
Abstract
Mechanisch geactiveerde ionkanalen zijn biologische transducers die mechanische stimuli zoals rek- of schuifkrachten omzetten in elektrische en biochemische signalen. Bij zoogdieren zijn mechanisch geactiveerde kanalen essentieel voor de detectie van externe en interne stimuli in processen die zo divers zijn als tastsensatie, gehoor, volumeregulatie van rode bloedcellen, basale bloeddrukregulatie en het gevoel van volheid van de urineblaas. Hoewel de functie van mechanisch geactiveerde ionkanalen uitgebreid is bestudeerd in de in vitro setting met behulp van de patch-clamp-techniek, blijft het beoordelen van hun functie in hun oorspronkelijke omgeving een moeilijke taak, vaak vanwege beperkte toegang tot de expressieplaatsen van deze kanalen (bijv. Afferente terminals, Merkel-cellen, baroreceptoren en niertubuli) of moeilijkheden bij het toepassen van de patch-clamp-techniek (bijv. de apicale oppervlakken van urotheliale paraplucellen). Dit protocol beschrijft een procedure om mechanisch opgewekte Ca 2+ transiënten te beoordelen met behulp van de fluorescerende sensor GCaMP5G in een ex vivo urotheliaal preparaat, een techniek die gemakkelijk kan worden aangepast voor de studie van mechanisch opgewekte Ca2+ gebeurtenissen in andere inheemse weefselpreparaten.
Introduction
Epitheelcellen in de urinewegen worden onderworpen aan mechanische krachten terwijl het urinefiltraat door de nefronen reist en urine uit het nierbekken wordt gepompt en door de urineleiders reist om in de urineblaas te worden opgeslagen. Het is al lang bekend dat mechanische krachten (bijv. schuifspanning en rek) uitgeoefend door vloeistoffen op de epitheelcellen die de urinewegen bekleden, de reabsorptie van eiwit in de proximale tubulus en van opgeloste stoffen in het distale nefron 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 reguleren, 12,13, evenals de opslag van urine in de urineblaas en mictie14,15,16,17.
De omzetting van mechanische stimuli in elektrische en biochemische signalen, een proces dat mechanotransductie wordt genoemd, wordt gemedieerd door eiwitten die reageren op de vervorming van cellulaire structuren of de bijbehorende extracellulaire matrix 18,19,20,21. Mechanisch geactiveerde ionkanalen zijn uniek in de zin dat ze overgaan van een gesloten toestand naar een open permeabele toestand als reactie op veranderingen in membraanspanning, druk of schuifspanning 18,19,20,21,22. Daarnaast kunnen Ca 2+ transiënten worden geïnitieerd door integrine-gemedieerde mechanotransductie of door activering van mechanoresponsieve adhesiesystemen bij cel-cel juncties23,24,25,26. De ionkanaalfunctie wordt meestal beoordeeld met de patch-clamp-techniek, waarbij een gigaohm-afdichting wordt gevormd tussen het celmembraan en de patchpipet27. Cellen in diepe weefsellagen met een dichte extracellulaire matrix (bijv. Niertubuli) of omgeven door een fysieke barrière (bijv. Glycocalyx) zijn echter moeilijk toegankelijk met een glazen micropipette. Evenzo kunnen cellen die zijn ingebed of die integraal deel uitmaken van weefsels met een slechte mechanische stabiliteit (bijvoorbeeld het urothelium) niet gemakkelijk worden bestudeerd met de patch-clamp-techniek. Omdat veel mechanisch geactiveerde ionkanalen doorlaatbaar zijn voor Ca 2+, is een alternatieve benadering om hun activiteit te beoordelen door middel van fluorescerende microscopie met behulp van een Ca2+-gevoelige kleurstof of genetisch gecodeerde calciumindicatoren (GECIs) zoals GCaMP. Recente inspanningen op het gebied van eiwittechnologie hebben het dynamische bereik, de gevoeligheid en de respons van GECI’s28,29,30 aanzienlijk verhoogd en de vooruitgang in de genetica heeft hun expressie in specifieke celpopulaties mogelijk gemaakt, waardoor ze bij uitstek geschikt zijn om mechanotransductie te bestuderen.
Het urothelium, het gestratificeerde epitheel dat het binnenste van de urineblaas bedekt, functioneert als een barrière, voorkomt de diffusie van urine-opgeloste stoffen in het blaasinterstitium, maar functioneert ook als een transducer, die de volheid van de blaas waarneemt en deze gebeurtenissen communiceert met de onderliggende zenuwen en spieren16. Eerdere studies hebben aangetoond dat de communicatie tussen het urotheel en onderliggende weefsels de mechanisch geactiveerde ionkanalen Piezo1 en Piezo231 vereist. Om mechanisch geïnduceerde Ca 2+ transiënten in urotheliale cellen te beoordelen, werd een nieuwe techniek ontwikkeld die adenovirale genoverdracht gebruikt om de Ca2+ sensor GCaMP5G in urotheliale cellen tot expressie te brengen. Deze techniek maakt gebruik van een mucosale plaatvoorbereiding die gemakkelijke toegang biedt tot de buitenste paraplucellaag en een computerondersteund systeem voor de gelijktijdige mechanische stimulatie van individuele cellen met een gesloten glazen micropipette en registratie van veranderingen in fluorescentie in de loop van de tijd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alle organismen, en schijnbaar de meeste celtypen, drukken ionkanalen uit die reageren op mechanische stimuli 20,33,34,35,36,37. De functie van deze mechanisch geactiveerde kanalen is voornamelijk beoordeeld met de patch-clamp techniek. Vanwege toegankelijkheidsproblemen zijn patchklemstudies van mechanisch geactiveerde ionka…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies R01DK119183 (aan G.A. en M.D.C.) en S10OD028596 (aan G.A.) en door de Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores van het Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307).
Materials
| 20x Objective | Olympus | UMPlanFL N | |
| 24 G ¾” catheter | Medline | Suresite IV slide | |
| 4x Objective | Olympus | UPlanFL N | |
| Analog/digital converter | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Anti-GFP antibody | Abcam | Ab6556 | |
| Beam splitter | Chroma | T495lpxr | |
| Bipolar temperature controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| CaCl2 | Fluka | 21114-1L | 1 M solution |
| cellSens software | Olympus | Imaging software | |
| CMOS camera | Hamamatsu | ORCA fusion | |
| Donkey anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| Filter | Chroma | ET470/40X | |
| Glass capillaries Corning 8250 glass | Warner Instruments | G85150T-4 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Inline heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| KCl | Sigma | 793590 | |
| Light source | Sutter Instruments | Lambda XL | |
| Manifold pump tubing | Fisherbrand | 14-190-510 | ID 1.52 mm |
| Manifold pump tubing | Fisherbrand | 14-190-533 | ID 2.79 mm |
| MgCl2 | Sigma | M9272 | |
| Mice | Jackson Lab | 664 | 2-4 months old female C57BL/6J |
| Microforge | Narishige | MF-830 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | |
| Microscope | Olympus | BX51W | |
| Mounting media with DAPI | Invitrogen | S36964 | Slowfade Diamond Antifade with DAPI |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| pClamp software | Molecular Devices | Version 10.4 | Patch-clamp electrophysiology data acquisition and analysis software |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | |
| Piezoelectric actuator | Thorlabs | PAS005 | |
| Pipette holder | World Precision Instruments | ||
| Pipette puller | Narishige | PP-830 | |
| Quick exchange heated base with perfusion and adapter ring kit | Warner Instruments | QE-1 | Quick exchange platform fits 35 mm dish |
| Rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| Sigma-Plot | Systat Software Inc | Version 14.0 | Scientific graphing and data analysis software |
| Silicone elastomer | Dow | Sylgard 184 | |
| Single channel open-loop piezo controller | Thorlabs | MDT694B | |
| Square grid holder pad | Ted Pella | 10520 | |
| Suture | AD Surgical | S-S618R13 | 6-0 Sylk |
| Teflon mounting rod | Custom made | Use to mount the piezoelectric actuator in the micromanipulator | |
| Tubing | Fisher Scientific | 14171129 | Tygon S3 ID 1/16 IN, OD 1/8 IN |
| USB Digital I/O device | National Instruments | NI USB-6501 |
References
- Kunau, R. T., Webb, H. L., Borman, S. C. Characteristics of the relationship between the flow rate of tubular fluid and potassium transport in the distal tubule of the rat. Journal of Clinical Investigation. 54 (6), 1488-1495 (1974).
- Engbretson, B. G., Stoner, L. C. Flow-dependent potassium secretion by rabbit cortical collecting tubule in vitro. American Journal of Physiology. 253 (5), 896-903 (1987).
- Satlin, L. M., Sheng, S., Woda, C. B., Kleyman, T. R. Epithelial Na(+) channels are regulated by flow. American Journal of Physiology Renal Physiology. 280 (6), 1010-1018 (2001).
- Woda, C. B., et al. Ontogeny of flow-stimulated potassium secretion in rabbit cortical collecting duct: functional and molecular aspects. American Journal of Physiology Renal Physiology. 285 (4), 629-639 (2003).
- Malnic, G., Berliner, R. W., Giebisch, G. Flow dependence of K+ secretion in cortical distal tubules of the rat. American Journal of Physiology. 256 (5), 932-941 (1989).
- Khuri, R. N., Strieder, W. N., Giebisch, G. Effects of flow rate and potassium intake on distal tubular potassium transfer. American Journal of Physiology. 228 (4), 1249-1261 (1975).
- Good, D. W., Wright, F. S. Luminal influences on potassium secretion: sodium concentration and fluid flow rate. American Journal of Physiology. 236 (2), 192-205 (1979).
- Wong, K. R., Berry, C. A., Cogan, M. G. Flow dependence of chloride transport in rat S1 proximal tubules. American Journal of Physiology. 269 (6), 870-875 (1995).
- Garvin, J. L. Glucose absorption by isolated perfused rat proximal straight tubules. American Journal of Physiology. 259 (4), 580-586 (1990).
- Malnic, G., Klose, R. M., Giebisch, G. Micropuncture study of renal potassium excretion in the rat. American Journal of Physiology. 206 (4), 674-686 (1964).
- Malnic, G., Klose, R. M., Giebisch, G. Micropuncture study of distal tubular potassium and sodium transport in rat nephron. American Journal of Physiology. 211 (3), 529-547 (1966).
- Cabral, P. D., Garvin, J. L. Luminal flow regulates NO and O2(-) along the nephron. American Journal of Physiology. 300 (5), 1047-1053 (2011).
- Raghavan, V., Rbaibi, Y., Pastor-Soler, N. M., Carattino, M. D., Weisz, O. A. Shear stress-dependent regulation of apical endocytosis in renal proximal tubule cells mediated by primary cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8506-8511 (2014).
- Lewis, S. A., de Moura, J. L. Apical membrane area of rabbit urinary bladder increases by fusion of intracellular vesicles: an electrophysiological study. The Journal of Membrane Biology. 82 (2), 123-136 (1984).
- Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C. The neural control of micturition. Nature Reviews Neuroscience. 9 (6), 453-466 (2008).
- Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The urothelium: life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).
- Khandelwal, P., Abraham, S. N., Apodaca, G. Cell biology and physiology of the uroepithelium. American Journal of Physiology Renal Physiology. 297 (6), 1477-1501 (2009).
- Sachs, F. Stretch-activated ion channels: what are they. Physiology. 25 (1), 50-56 (2010).
- Martinac, B. Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction. Journal of Cell Science. 117 (12), 2449-2460 (2004).
- Ranade, S. S., Syeda, R., Patapoutian, A. Mechanically activated ion channels. Neuron. 87 (6), 1162-1179 (2015).
- Cox, C. D., Bavi, N., Martinac, B. Biophysical principles of ion-channel-mediated mechanosensory transduction. Cell Reports. 29 (1), 1-12 (2019).
- Carattino, M. D., Sheng, S., Kleyman, T. R. Epithelial Na+ channels are activated by laminar shear stress. Journal of Biological Chemistry. 279 (6), 4120-4126 (2004).
- Ross, T. D., et al. Integrins in mechanotransduction. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 613-618 (2013).
- Dieterle, M. P., Husari, A., Rolauffs, B., Steinberg, T., Tomakidi, P. Integrins, cadherins and channels in cartilage mechanotransduction: perspectives for future regeneration strategies. Expert Reviews in Molecular Medicine. 23, 14 (2021).
- Huveneers, S., de Rooij, J. Mechanosensitive systems at the cadherin-F-actin interface. Journal of Cell Science. 126, 403-413 (2013).
- Sun, Z., Guo, S. S., Fässler, R. Integrin-mediated mechanotransduction. Journal of Cell Biology. 215 (4), 445-456 (2016).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Archiv. European Journal of Physiology. 391 (2), 85-100 (1981).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2 (2013).
- Sun, X. R., et al. Fast GCaMPs for improved tracking of neuronal activity. Nature Communications. 4, 2170 (2013).
- Dalghi, M. G., et al. Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception. JCI Insight. 6 (19), 152984 (2021).
- Durnin, L., et al. An ex vivo bladder model with detrusor smooth muscle removed to analyse biologically active mediators released from the suburothelium. The Journal of Physiology. 597 (6), 1467-1485 (2019).
- Delmas, P., Coste, B. Mechano-gated ion channels in sensory systems. Cell. 155 (2), 278-284 (2013).
- Tavernarakis, N., Driscoll, M. Degenerins. At the core of the metazoan mechanotransducer. Annals of the New York Academy of Sciences. 940 (1), 28-41 (2001).
- Peyronnet, R., Tran, D., Girault, T., Frachisse, J. M. Mechanosensitive channels: feeling tension in a world under pressure. Frontiers in Plant Science. 5, 558 (2014).
- Blount, P., Iscla, I. Life with bacterial mechanosensitive channels, from discovery to physiology to pharmacological target. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 84 (1), 00055 (2020).
- Booth, I. R., Miller, S., Müller, A., Lehtovirta-Morley, L. The evolution of bacterial mechanosensitive channels. Cell Calcium. 57 (3), 140-150 (2015).
