Bu protokol, floresan Ca2+ sensörü GCaMP5G kullanılarak doğal ürotelyal hücrelerde mekanik olarak aktive edilmiş iyon kanallarının işlevini değerlendirmek için bir metodolojiyi açıklamaktadır.
Mekanik olarak aktive edilen iyon kanalları, gerilme veya kesme kuvvetleri gibi mekanik uyaranları elektriksel ve biyokimyasal sinyallere dönüştüren biyolojik dönüştürücülerdir. Memelilerde, mekanik olarak aktive edilmiş kanallar, dokunma hissi, işitme, kırmızı kan hücresi hacminin düzenlenmesi, bazal kan basıncı regülasyonu ve idrar kesesi dolgunluğu hissi gibi çeşitli süreçlerde dış ve iç uyaranların tespiti için gereklidir. Mekanik olarak aktive edilmiş iyon kanallarının işlevi, yama-kelepçe tekniği kullanılarak in vitro ortamda kapsamlı bir şekilde incelenmiş olsa da, doğal ortamlarındaki işlevlerini değerlendirmek, genellikle bu kanalların ekspresyon bölgelerine (örneğin, afferent terminaller, Merkel hücreleri, baroreseptörler ve böbrek tübülleri) sınırlı erişim veya yama kelepçesi tekniğinin uygulanmasındaki zorluklar nedeniyle zor bir görev olmaya devam etmektedir. ürotelyal şemsiye hücrelerinin apikal yüzeyleri). Bu protokol, ex vivo ürotelyal preparatta floresan sensör GCaMP5G kullanılarak mekanik olarak uyarlanan Ca 2 + geçicileri değerlendirmek için bir prosedürü açıklamaktadır; bu, diğer doğal doku preparatlarında mekanik olarak uyarlanmış Ca2 + olaylarının incelenmesi için kolayca uyarlanabilecek bir tekniktir.
İdrar yollarındaki epitel hücreleri, idrar filtrasyonu nefronlardan geçerken mekanik kuvvetlere maruz kalır ve idrar renal pelvisten dışarı pompalanır ve idrar kesesinde depolanacak üreterlerden geçer. İdrar yolunu kaplayan epitel hücreleri üzerindeki sıvılar tarafından uygulanan mekanik kuvvetlerin (örneğin, kesme stresi ve gerilmesi), proksimal tübüldeki proteinin ve distal nefron 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11’deki çözünenlerin yeniden emilimini düzenlediği uzun zamandır bilinmektedir. 12,13, idrarın idrar kesesinde depolanması ve miksiyon14,15,16,17.
Mekanik uyaranların mekanik ve biyokimyasal sinyallere dönüştürülmesine, mekanotransdüksiyon olarak adlandırılan bir süreç, hücresel yapıların deformasyonuna veya ilişkili hücre dışı matrise yanıt veren proteinler aracılık eder 18,19,20,21. Mekanik olarak aktive edilen iyon kanalları, membran gerilimi, basıncı veya kayma gerilmesindeki değişikliklere yanıt olarak kapalı bir durumdan açık geçirgen bir duruma geçmeleri anlamında benzersizdir 18,19,20,21,22. Ek olarak, Ca 2+ geçicileri integrin aracılı mekanotransdüksiyon veya hücre-hücre kavşaklarında mekanoduyarlı yapışma sistemlerinin aktivasyonu ile başlatılabilir23,24,25,26. İyon kanalı fonksiyonu genellikle hücre zarı ile yama pipeti27 arasında bir gigaohm conta oluşumunu içeren yama-kelepçe tekniği ile değerlendirilir. Bununla birlikte, yoğun bir hücre dışı matrise (örneğin, böbrek tübülleri) sahip derin doku katmanlarında bulunan veya fiziksel bir bariyerle (örneğin, glikokaliks) çevrili hücrelere cam mikropipet ile erişmek zordur. Benzer şekilde, gömülü veya zayıf mekanik stabiliteye sahip dokuların ayrılmaz parçaları olan hücreler (örneğin, ürotelyum) yama-kelepçe tekniği ile kolayca çalışılamaz. Mekanik olarak aktive edilmiş birçok iyon kanalı Ca 2 + ‘ya geçirgen olduğundan, alternatif bir yaklaşım, Ca2 + ‘ya duyarlı bir boya veya GCaMP gibi genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (GECI’ler) kullanarak floresan mikroskopi ile aktivitelerini değerlendirmektir. Protein mühendisliğindeki son çabalar, GECI’lerin28,29,30’unun dinamik aralığını, duyarlılığını ve tepkisini önemli ölçüde artırdı ve genetikteki ilerlemeler, belirli hücre popülasyonlarında ekspresyonlarına izin vererek onları mekanotransdüksiyonu incelemek için ideal hale getirdi.
İdrar kesesinin içini kaplayan tabakalı epitel olan ürotelyum, idrar solutlarının mesane interstisyumuna difüzyonunu önleyen bir bariyer olarak işlev görür, aynı zamanda bir dönüştürücü olarak işlev görür, mesane dolgunluğunu algılar ve bu olayları altta yatan sinirlere ve kas sistemineiletir16. Önceki çalışmalar, ürotelyum ve altta yatan dokular arasındaki iletişimin mekanik olarak aktive edilmiş iyon kanalları Piezo1 ve Piezo231’i gerektirdiğini göstermiştir. Ürotelyal hücrelerde mekanik olarak indüklenen Ca 2+ geçicileri değerlendirmek için, ürotelyal hücrelerde Ca2+ sensörü GCaMP5G’yi eksprese etmek için adenoviral gen transferini kullanan yeni bir teknik geliştirilmiştir. Bu teknik, en dıştaki şemsiye hücre tabakasına kolay erişim sağlayan bir mukozal tabaka preparatı ve kapalı bir cam mikropipet ile bireysel hücrelerin eşzamanlı mekanik uyarımı ve zaman içinde floresandaki değişikliklerin kaydedilmesi için bilgisayar destekli bir sistem kullanır.
Tüm organizmalar ve görünüşte çoğu hücre tipi, mekanik uyaranlara cevap veren iyon kanallarını eksprese eder 20,33,34,35,36,37. Mekanik olarak aktive edilen bu kanalların işlevi ağırlıklı olarak yama-kelepçe tekniği ile değerlendirilmiştir. Bununla birlikte, erişilebilirlik sorunları nedeniyle, mekanik o…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, NIH hibeleri R01DK119183 (G.A. ve MDC’ye) ve S10OD028596 (GA’ya) ve Pittsburgh Böbrek Araştırma Merkezi’nin Hücre Fizyolojisi ve Model Organizmaları Böbrek Görüntüleme Çekirdekleri (P30DK079307) tarafından desteklenmiştir.
20x Objective | Olympus | UMPlanFL N | |
24 G ¾” catheter | Medline | Suresite IV slide | |
4x Objective | Olympus | UPlanFL N | |
Analog/digital converter | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
Anti-GFP antibody | Abcam | Ab6556 | |
Beam splitter | Chroma | T495lpxr | |
Bipolar temperature controller | Warner Instruments | TC-344B | |
CaCl2 | Fluka | 21114-1L | 1 M solution |
cellSens software | Olympus | Imaging software | |
CMOS camera | Hamamatsu | ORCA fusion | |
Donkey anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | |
Excel | Microsoft Corporation | ||
Filter | Chroma | ET470/40X | |
Glass capillaries Corning 8250 glass | Warner Instruments | G85150T-4 | |
Glucose | Sigma | G8270 | |
HEPES | Sigma | H4034 | |
Inline heater | Warner Instruments | SH-27B | |
KCl | Sigma | 793590 | |
Light source | Sutter Instruments | Lambda XL | |
Manifold pump tubing | Fisherbrand | 14-190-510 | ID 1.52 mm |
Manifold pump tubing | Fisherbrand | 14-190-533 | ID 2.79 mm |
MgCl2 | Sigma | M9272 | |
Mice | Jackson Lab | 664 | 2-4 months old female C57BL/6J |
Microforge | Narishige | MF-830 | |
Micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | |
Microscope | Olympus | BX51W | |
Mounting media with DAPI | Invitrogen | S36964 | Slowfade Diamond Antifade with DAPI |
NaCl | Sigma | S7653 | |
pClamp software | Molecular Devices | Version 10.4 | Patch-clamp electrophysiology data acquisition and analysis software |
Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | |
Piezoelectric actuator | Thorlabs | PAS005 | |
Pipette holder | World Precision Instruments | ||
Pipette puller | Narishige | PP-830 | |
Quick exchange heated base with perfusion and adapter ring kit | Warner Instruments | QE-1 | Quick exchange platform fits 35 mm dish |
Rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | |
Sigma-Plot | Systat Software Inc | Version 14.0 | Scientific graphing and data analysis software |
Silicone elastomer | Dow | Sylgard 184 | |
Single channel open-loop piezo controller | Thorlabs | MDT694B | |
Square grid holder pad | Ted Pella | 10520 | |
Suture | AD Surgical | S-S618R13 | 6-0 Sylk |
Teflon mounting rod | Custom made | Use to mount the piezoelectric actuator in the micromanipulator | |
Tubing | Fisher Scientific | 14171129 | Tygon S3 ID 1/16 IN, OD 1/8 IN |
USB Digital I/O device | National Instruments | NI USB-6501 |