Eski Vivo Ürotelyal Hücrelerde Mekanik Olarak Aktive Edilmiş Ca2+ Geçicilerinin Analizi
Summary
Bu protokol, floresan Ca2+ sensörü GCaMP5G kullanılarak doğal ürotelyal hücrelerde mekanik olarak aktive edilmiş iyon kanallarının işlevini değerlendirmek için bir metodolojiyi açıklamaktadır.
Abstract
Mekanik olarak aktive edilen iyon kanalları, gerilme veya kesme kuvvetleri gibi mekanik uyaranları elektriksel ve biyokimyasal sinyallere dönüştüren biyolojik dönüştürücülerdir. Memelilerde, mekanik olarak aktive edilmiş kanallar, dokunma hissi, işitme, kırmızı kan hücresi hacminin düzenlenmesi, bazal kan basıncı regülasyonu ve idrar kesesi dolgunluğu hissi gibi çeşitli süreçlerde dış ve iç uyaranların tespiti için gereklidir. Mekanik olarak aktive edilmiş iyon kanallarının işlevi, yama-kelepçe tekniği kullanılarak in vitro ortamda kapsamlı bir şekilde incelenmiş olsa da, doğal ortamlarındaki işlevlerini değerlendirmek, genellikle bu kanalların ekspresyon bölgelerine (örneğin, afferent terminaller, Merkel hücreleri, baroreseptörler ve böbrek tübülleri) sınırlı erişim veya yama kelepçesi tekniğinin uygulanmasındaki zorluklar nedeniyle zor bir görev olmaya devam etmektedir. ürotelyal şemsiye hücrelerinin apikal yüzeyleri). Bu protokol, ex vivo ürotelyal preparatta floresan sensör GCaMP5G kullanılarak mekanik olarak uyarlanan Ca 2 + geçicileri değerlendirmek için bir prosedürü açıklamaktadır; bu, diğer doğal doku preparatlarında mekanik olarak uyarlanmış Ca2 + olaylarının incelenmesi için kolayca uyarlanabilecek bir tekniktir.
Introduction
İdrar yollarındaki epitel hücreleri, idrar filtrasyonu nefronlardan geçerken mekanik kuvvetlere maruz kalır ve idrar renal pelvisten dışarı pompalanır ve idrar kesesinde depolanacak üreterlerden geçer. İdrar yolunu kaplayan epitel hücreleri üzerindeki sıvılar tarafından uygulanan mekanik kuvvetlerin (örneğin, kesme stresi ve gerilmesi), proksimal tübüldeki proteinin ve distal nefron 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11’deki çözünenlerin yeniden emilimini düzenlediği uzun zamandır bilinmektedir. 12,13, idrarın idrar kesesinde depolanması ve miksiyon14,15,16,17.
Mekanik uyaranların mekanik ve biyokimyasal sinyallere dönüştürülmesine, mekanotransdüksiyon olarak adlandırılan bir süreç, hücresel yapıların deformasyonuna veya ilişkili hücre dışı matrise yanıt veren proteinler aracılık eder 18,19,20,21. Mekanik olarak aktive edilen iyon kanalları, membran gerilimi, basıncı veya kayma gerilmesindeki değişikliklere yanıt olarak kapalı bir durumdan açık geçirgen bir duruma geçmeleri anlamında benzersizdir 18,19,20,21,22. Ek olarak, Ca 2+ geçicileri integrin aracılı mekanotransdüksiyon veya hücre-hücre kavşaklarında mekanoduyarlı yapışma sistemlerinin aktivasyonu ile başlatılabilir23,24,25,26. İyon kanalı fonksiyonu genellikle hücre zarı ile yama pipeti27 arasında bir gigaohm conta oluşumunu içeren yama-kelepçe tekniği ile değerlendirilir. Bununla birlikte, yoğun bir hücre dışı matrise (örneğin, böbrek tübülleri) sahip derin doku katmanlarında bulunan veya fiziksel bir bariyerle (örneğin, glikokaliks) çevrili hücrelere cam mikropipet ile erişmek zordur. Benzer şekilde, gömülü veya zayıf mekanik stabiliteye sahip dokuların ayrılmaz parçaları olan hücreler (örneğin, ürotelyum) yama-kelepçe tekniği ile kolayca çalışılamaz. Mekanik olarak aktive edilmiş birçok iyon kanalı Ca 2 + ‘ya geçirgen olduğundan, alternatif bir yaklaşım, Ca2 + ‘ya duyarlı bir boya veya GCaMP gibi genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (GECI’ler) kullanarak floresan mikroskopi ile aktivitelerini değerlendirmektir. Protein mühendisliğindeki son çabalar, GECI’lerin28,29,30’unun dinamik aralığını, duyarlılığını ve tepkisini önemli ölçüde artırdı ve genetikteki ilerlemeler, belirli hücre popülasyonlarında ekspresyonlarına izin vererek onları mekanotransdüksiyonu incelemek için ideal hale getirdi.
İdrar kesesinin içini kaplayan tabakalı epitel olan ürotelyum, idrar solutlarının mesane interstisyumuna difüzyonunu önleyen bir bariyer olarak işlev görür, aynı zamanda bir dönüştürücü olarak işlev görür, mesane dolgunluğunu algılar ve bu olayları altta yatan sinirlere ve kas sistemineiletir16. Önceki çalışmalar, ürotelyum ve altta yatan dokular arasındaki iletişimin mekanik olarak aktive edilmiş iyon kanalları Piezo1 ve Piezo231’i gerektirdiğini göstermiştir. Ürotelyal hücrelerde mekanik olarak indüklenen Ca 2+ geçicileri değerlendirmek için, ürotelyal hücrelerde Ca2+ sensörü GCaMP5G’yi eksprese etmek için adenoviral gen transferini kullanan yeni bir teknik geliştirilmiştir. Bu teknik, en dıştaki şemsiye hücre tabakasına kolay erişim sağlayan bir mukozal tabaka preparatı ve kapalı bir cam mikropipet ile bireysel hücrelerin eşzamanlı mekanik uyarımı ve zaman içinde floresandaki değişikliklerin kaydedilmesi için bilgisayar destekli bir sistem kullanır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tüm organizmalar ve görünüşte çoğu hücre tipi, mekanik uyaranlara cevap veren iyon kanallarını eksprese eder 20,33,34,35,36,37. Mekanik olarak aktive edilen bu kanalların işlevi ağırlıklı olarak yama-kelepçe tekniği ile değerlendirilmiştir. Bununla birlikte, erişilebilirlik sorunları nedeniyle, mekanik o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, NIH hibeleri R01DK119183 (G.A. ve MDC’ye) ve S10OD028596 (GA’ya) ve Pittsburgh Böbrek Araştırma Merkezi’nin Hücre Fizyolojisi ve Model Organizmaları Böbrek Görüntüleme Çekirdekleri (P30DK079307) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 20x Objective | Olympus | UMPlanFL N | |
| 24 G ¾” catheter | Medline | Suresite IV slide | |
| 4x Objective | Olympus | UPlanFL N | |
| Analog/digital converter | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Anti-GFP antibody | Abcam | Ab6556 | |
| Beam splitter | Chroma | T495lpxr | |
| Bipolar temperature controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| CaCl2 | Fluka | 21114-1L | 1 M solution |
| cellSens software | Olympus | Imaging software | |
| CMOS camera | Hamamatsu | ORCA fusion | |
| Donkey anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| Filter | Chroma | ET470/40X | |
| Glass capillaries Corning 8250 glass | Warner Instruments | G85150T-4 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Inline heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| KCl | Sigma | 793590 | |
| Light source | Sutter Instruments | Lambda XL | |
| Manifold pump tubing | Fisherbrand | 14-190-510 | ID 1.52 mm |
| Manifold pump tubing | Fisherbrand | 14-190-533 | ID 2.79 mm |
| MgCl2 | Sigma | M9272 | |
| Mice | Jackson Lab | 664 | 2-4 months old female C57BL/6J |
| Microforge | Narishige | MF-830 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | |
| Microscope | Olympus | BX51W | |
| Mounting media with DAPI | Invitrogen | S36964 | Slowfade Diamond Antifade with DAPI |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| pClamp software | Molecular Devices | Version 10.4 | Patch-clamp electrophysiology data acquisition and analysis software |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | |
| Piezoelectric actuator | Thorlabs | PAS005 | |
| Pipette holder | World Precision Instruments | ||
| Pipette puller | Narishige | PP-830 | |
| Quick exchange heated base with perfusion and adapter ring kit | Warner Instruments | QE-1 | Quick exchange platform fits 35 mm dish |
| Rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| Sigma-Plot | Systat Software Inc | Version 14.0 | Scientific graphing and data analysis software |
| Silicone elastomer | Dow | Sylgard 184 | |
| Single channel open-loop piezo controller | Thorlabs | MDT694B | |
| Square grid holder pad | Ted Pella | 10520 | |
| Suture | AD Surgical | S-S618R13 | 6-0 Sylk |
| Teflon mounting rod | Custom made | Use to mount the piezoelectric actuator in the micromanipulator | |
| Tubing | Fisher Scientific | 14171129 | Tygon S3 ID 1/16 IN, OD 1/8 IN |
| USB Digital I/O device | National Instruments | NI USB-6501 |
References
- Kunau, R. T., Webb, H. L., Borman, S. C. Characteristics of the relationship between the flow rate of tubular fluid and potassium transport in the distal tubule of the rat. Journal of Clinical Investigation. 54 (6), 1488-1495 (1974).
- Engbretson, B. G., Stoner, L. C. Flow-dependent potassium secretion by rabbit cortical collecting tubule in vitro. American Journal of Physiology. 253 (5), 896-903 (1987).
- Satlin, L. M., Sheng, S., Woda, C. B., Kleyman, T. R. Epithelial Na(+) channels are regulated by flow. American Journal of Physiology Renal Physiology. 280 (6), 1010-1018 (2001).
- Woda, C. B., et al. Ontogeny of flow-stimulated potassium secretion in rabbit cortical collecting duct: functional and molecular aspects. American Journal of Physiology Renal Physiology. 285 (4), 629-639 (2003).
- Malnic, G., Berliner, R. W., Giebisch, G. Flow dependence of K+ secretion in cortical distal tubules of the rat. American Journal of Physiology. 256 (5), 932-941 (1989).
- Khuri, R. N., Strieder, W. N., Giebisch, G. Effects of flow rate and potassium intake on distal tubular potassium transfer. American Journal of Physiology. 228 (4), 1249-1261 (1975).
- Good, D. W., Wright, F. S. Luminal influences on potassium secretion: sodium concentration and fluid flow rate. American Journal of Physiology. 236 (2), 192-205 (1979).
- Wong, K. R., Berry, C. A., Cogan, M. G. Flow dependence of chloride transport in rat S1 proximal tubules. American Journal of Physiology. 269 (6), 870-875 (1995).
- Garvin, J. L. Glucose absorption by isolated perfused rat proximal straight tubules. American Journal of Physiology. 259 (4), 580-586 (1990).
- Malnic, G., Klose, R. M., Giebisch, G. Micropuncture study of renal potassium excretion in the rat. American Journal of Physiology. 206 (4), 674-686 (1964).
- Malnic, G., Klose, R. M., Giebisch, G. Micropuncture study of distal tubular potassium and sodium transport in rat nephron. American Journal of Physiology. 211 (3), 529-547 (1966).
- Cabral, P. D., Garvin, J. L. Luminal flow regulates NO and O2(-) along the nephron. American Journal of Physiology. 300 (5), 1047-1053 (2011).
- Raghavan, V., Rbaibi, Y., Pastor-Soler, N. M., Carattino, M. D., Weisz, O. A. Shear stress-dependent regulation of apical endocytosis in renal proximal tubule cells mediated by primary cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8506-8511 (2014).
- Lewis, S. A., de Moura, J. L. Apical membrane area of rabbit urinary bladder increases by fusion of intracellular vesicles: an electrophysiological study. The Journal of Membrane Biology. 82 (2), 123-136 (1984).
- Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C. The neural control of micturition. Nature Reviews Neuroscience. 9 (6), 453-466 (2008).
- Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The urothelium: life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).
- Khandelwal, P., Abraham, S. N., Apodaca, G. Cell biology and physiology of the uroepithelium. American Journal of Physiology Renal Physiology. 297 (6), 1477-1501 (2009).
- Sachs, F. Stretch-activated ion channels: what are they. Physiology. 25 (1), 50-56 (2010).
- Martinac, B. Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction. Journal of Cell Science. 117 (12), 2449-2460 (2004).
- Ranade, S. S., Syeda, R., Patapoutian, A. Mechanically activated ion channels. Neuron. 87 (6), 1162-1179 (2015).
- Cox, C. D., Bavi, N., Martinac, B. Biophysical principles of ion-channel-mediated mechanosensory transduction. Cell Reports. 29 (1), 1-12 (2019).
- Carattino, M. D., Sheng, S., Kleyman, T. R. Epithelial Na+ channels are activated by laminar shear stress. Journal of Biological Chemistry. 279 (6), 4120-4126 (2004).
- Ross, T. D., et al. Integrins in mechanotransduction. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 613-618 (2013).
- Dieterle, M. P., Husari, A., Rolauffs, B., Steinberg, T., Tomakidi, P. Integrins, cadherins and channels in cartilage mechanotransduction: perspectives for future regeneration strategies. Expert Reviews in Molecular Medicine. 23, 14 (2021).
- Huveneers, S., de Rooij, J. Mechanosensitive systems at the cadherin-F-actin interface. Journal of Cell Science. 126, 403-413 (2013).
- Sun, Z., Guo, S. S., Fässler, R. Integrin-mediated mechanotransduction. Journal of Cell Biology. 215 (4), 445-456 (2016).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Archiv. European Journal of Physiology. 391 (2), 85-100 (1981).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2 (2013).
- Sun, X. R., et al. Fast GCaMPs for improved tracking of neuronal activity. Nature Communications. 4, 2170 (2013).
- Dalghi, M. G., et al. Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception. JCI Insight. 6 (19), 152984 (2021).
- Durnin, L., et al. An ex vivo bladder model with detrusor smooth muscle removed to analyse biologically active mediators released from the suburothelium. The Journal of Physiology. 597 (6), 1467-1485 (2019).
- Delmas, P., Coste, B. Mechano-gated ion channels in sensory systems. Cell. 155 (2), 278-284 (2013).
- Tavernarakis, N., Driscoll, M. Degenerins. At the core of the metazoan mechanotransducer. Annals of the New York Academy of Sciences. 940 (1), 28-41 (2001).
- Peyronnet, R., Tran, D., Girault, T., Frachisse, J. M. Mechanosensitive channels: feeling tension in a world under pressure. Frontiers in Plant Science. 5, 558 (2014).
- Blount, P., Iscla, I. Life with bacterial mechanosensitive channels, from discovery to physiology to pharmacological target. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 84 (1), 00055 (2020).
- Booth, I. R., Miller, S., Müller, A., Lehtovirta-Morley, L. The evolution of bacterial mechanosensitive channels. Cell Calcium. 57 (3), 140-150 (2015).
