التصوير الذاتي لتقييم فسيولوجيا الطحالب الحمراء
Summary
يصف هذا البروتوكول التصوير الذاتي خطوة بخطوة وتقييم تغيرات البروتين النباتي في الطحالب الحمراء بناء على التحليل الطيفي. هذه طريقة خالية من الملصقات وغير مدمرة لتقييم التكيف الخلوي مع الموائل المتطرفة ، عندما تتوفر المواد النادرة فقط وتنمو الخلايا ببطء ، أو لا تنمو على الإطلاق ، في ظل ظروف المختبر.
Abstract
تحتوي الطحالب الحمراء (Rhodophyta) على بروتينات نباتية وتستعمر الموائل ذات الضوء الخافت ، ولكن بعضها (على سبيل المثال ، بعض أنواع Chroothece ) يمكن أن تتطور أيضا تحت أشعة الشمس الكاملة. معظم نباتات الرهودوفيت حمراء ، ولكن بعضها يمكن أن يبدو مزرقا ، اعتمادا على نسبة البروتينات الصفراوية الزرقاء والحمراء (phycocyanin و phycoerythrin). يمكن للبروتينات الفيزيائية المختلفة التقاط الضوء بأطوال موجية متنوعة ونقله إلى الكلوروفيل أ ، مما يجعل عملية البناء الضوئي في ظل ظروف ضوئية مختلفة جدا ممكنة. تستجيب هذه الصبغات لتغيرات الموائل في الضوء ، ويمكن أن يساعد تألقها الذاتي في دراسة العمليات البيولوجية. باستخدام Chroothece mobilis ككائن نموذجي ووضع مسح لامدا الطيفي في مجهر متحد البؤر ، تمت دراسة تكيف أصباغ التمثيل الضوئي مع أضواء أحادية اللون مختلفة على المستوى الخلوي لتخمين ظروف النمو المثلى للأنواع. أظهرت النتائج أنه حتى عندما تم عزل السلالة المدروسة من كهف ، فقد تكيفت مع شدة الضوء الخافتة والمتوسطة. الطريقة المقدمة مفيدة بشكل خاص لدراسة الكائنات الحية التي لا تنمو أو تنمو ببطء شديد في ظل ظروف المختبر ، وهو ما يحدث عادة بالنسبة لأولئك الذين يعيشون في الموائل القصوى.
Introduction
يمكن أن تنمو الطحالب الحمراء ، مثل جنس Chroothece ، في الموائل القاسية ، حيث يتعين عليها في كثير من الأحيان التعامل مع التغيرات البيئية الملحوظة1. تتكرر الفيضانات والجفاف في المناطق شبه القاحلة حيث يمكن العثور على هذا الجنس ، وقد تم الإبلاغ عن بعض الأنواع في الجداول أو المنحدرات أو الكهوف أو حتى المياه الحرارية2. ومع ذلك ، في معظم الأحيان ، تؤدي المتغيرات البيولوجية ، مثل المنافسة أو الرعي ، إلى إبعاد الأنواع إلى ظروف غير مثالية لنموها. وبما أن هذه الكائنات غالبا ما يكون من الصعب استزراعها، وإما أنها لا تنمو أو تنمو ببطء شديد في ظل ظروف المختبر، فإن أحد القيود الرئيسية هو حجم العينة المتاح. لذلك ، من المهم جدا اتباع الأساليب غير المدمرة أو الأساليب التي تنطوي على الحد الأدنى من معالجة العينات 3,4.
يمكن مراقبة المهارات الفسيولوجية اللازمة للبقاء على قيد الحياة في هذه البيئات القاسية من خلال اتباع التغييرات في أنظمة التمثيل الضوئي الخاصة بهم. يمكن الكشف عن آليات التمثيل الغذائي وكفاءة التمثيل الضوئي والحساسية للضوء أو ظروف الثقافة من خلال ملامح انبعاث مضان الصباغ ، بسبب التغيرات الدقيقة في نقل الطاقة أو محاصرة5،6،7،8.
يمكن استخدام التألق الذاتي للمركبات الخلوية كعلامة للتشخيص الخلوي أو كمؤشر طبيعي للحالة الخلوية أو التمثيل الغذائي استجابة للإشارات الخارجية والداخلية من خلال التغيرات في الانبعاثات9. ويمكن استخدامه أيضا للتمييز بين المجموعات المختلفة تصنيفيا من الكائنات الحية التي تقوم بعملية البناء الضوئي10. اعتمادا على الموقف التطوري للكائنات الحية الدقيقة الضوئية ، يمكن للمرء أن يجد ميزات مضان مختلفة في الجسم الحي. لذلك ، تمت محاولة تحديد تصنيفي يعتمد على الخصائص في الجسم الحي للتألق الضوئي (بما في ذلك امتصاص التألق وأطياف الانبعاث) في عدة مناسبات11,12. بسبب التنوع في الأصباغ الملحقة بين أصناف العوالق النباتية ، يمكن استخدام الاختلافات في الأطوال الموجية التي يتم فيها تحفيز مضان الكلوروفيل أ (Chl a) ، أو الاختلافات في أطياف الانبعاثات ، لاستنتاج التصنيف13. لا تعتمد أطياف الإثارة والانبعاث الفلورية في الجسم الحي لهذه العينات على شعب الطحالب فحسب ، بل تعتمد أيضا على تكيف النظام الضوئي14. كفاءة نقل الطاقة إلى Chl a ، أو نسبة Chl a إلى أصباغ الملحقات ، ومحتوى الصباغ الخلوي حساس لظروف النمو5.
الطحالب الحمراء ، وخاصة Chroothece ، لديها العديد من أصباغ الفلورسنت الملحقات – البروتينات الفيزيائية والكاروتينات. يركز الأول في phycobilisomes المرتبطة بالثايلاكويدات من البلاستيدات الخضراء. يمكن للبروتينات الفيزيائية (phycocyanin و phycoerythrinو allophycocyanin) التقاط الضوء بأطوال موجية مختلفة ونقله إلى Chl a ، مما يجعل التمثيل الضوئي في ظروف الضوء والثقافة المختلفة جداممكنا 15. على سبيل المثال ، يمكن أن تنمو أنواع Chroothece داخل الكهوف أو تظهر تقريبا في تيارات جيرية مالحة قليلا2.
تؤثر الأضواء أحادية اللون على نمو الكائنات الحية الضوئية وتكوينها الصباغي ، وقد تمت دراستها لمنع أو التحكم في نمو الكائنات الحية الضوئية في الكهوف. أظهر Mulec et al. أن الإضاءة الحمراء المخصبة تعزز نمو البكتيريا الزرقاء والطحالب والنباتات16. أفادت الدراسات السابقة أيضا أن الضوء الأخضر يؤثر على تكوين صبغة البكتيريا الزرقاء17 ، بينما كشفت دراسات أخرى أن الضوء الأخضر يمنع نمو معظم الكائنات الحية التي تقوم بعملية التمثيل الضوئي وأن بعض البكتيريا الزرقاء تظهر انخفاضا في الثايلاكويدات وأضعف متوسط شدةمضان 18.
لفهم قدرة Chroothece ككائن نموذجي للتغلب على الظروف القاسية ، تعرضت الخلايا المستزرعة لشدة الضوء المتزايدة والضوء أحادي اللون (أخضر أو أحمر)15 ، لمعرفة كيفية تكيفها مع الظروف المعتمة للكهوف (حيث يسود الضوء الأحمر). يستنسخ البروتوكول المقدم هنا تأثير المتغيرات المذكورة أعلاه على البروتينات الفيزيائية ل Chroothece على المستوى الخلوي باستخدام التألق الذاتي الخاص به.
في الوقت الحاضر ، يستخدم التألق بشكل شائع كأداة لدراسة الاستجابات الفسيولوجية للنباتات الوعائية والطحالب الدقيقة والطحالب الكبيرة والبكتيريا الزرقاء13،14،16. يعد الفحص المجهري الفلوري الطيفي متحد البؤر أداة رائعة للدراسات في الجسم الحي لتقييم فسيولوجيا عينات التمثيل الضوئي على مستوى الخلية الواحدة 10،17،18،19،20 ، من خلال تجنب المشاكل المرتبطة بمعدل النمو المنخفض في المختبر والصعوبات في الحصول على كتلة حيوية كافية للاستخراج المرتبط وطرق الكيمياء الحيوية8 . بمجرد معالجة الخلايا في ظل ظروف ثقافة مختلفة لمدة 2 أسابيع ، يمكن قياس ملف مسح لامدا في الجسم الحي. على الرغم من وجود العديد من المنشورات التي تم فيها استخدام أطوال موجية مختلفة من الإثارة عن طريق التصوير متحد البؤر3،4،10،17 ، يمكن اكتشاف معظم البروتينات الفيزيائية و Chl a باستخدام خط إثارة الطول الموجي 561 نانومتر ، ويتراوح الانبعاث المكتشف من 570 إلى 760 نانومتر الطول الموجي. استندت هذه المعايير إلى تحليل تم إجراؤه سابقا10 مع أصباغ نقية تجارية (الجدول 1) عن طريق التصوير متحد البؤر والنتائج التي تم الحصول عليها في أنواع الطحالب المختلفة20،21،22.
| اصباغ | λفلوريداماكس (نانومتر) | λ EX (نانومتر) | |||||||
| 351 | 364 | 458 | 476 | 488 | 514 | 543 | 633 | ||
| تشل أ | 660.9-678.1 | 43.4 ± 1.8 | 11.2 ± 0.2 | 1.8 ± 0.05 | 2.0 ± 0.08 | 12.2 ± 0.7 | 6.0 ± 0.3 | 4.2 ± 0.16 | 80.7 ± 1.5 |
| آر بي | 569.2-583.3 | 5.9 ± 0.6 | 5.9 ± 0.16 | 11.1 ± 0.04 | 42.2 ± 0.3 | 100.0 ± 0 | 90.0 ± 0.3 | 99.2 ± 0.08 | – |
| 652.1-668.6 | – | – | 1.5 ± 0.01 | 3.7 ± 0.04 | 26.7 ± 0.5 | 8.7 ± 0.16 | 11.1 ± 0.16 | 11.3 ± 0.2 | |
| سي بي سي | 636.2-676.4 | 2.3 ± 0.04 | 1.0 ± 0.01 | 0.6 ± 0.004 | 0.7 ± 0.008 | 2.0 ± 0.08 | 2.0 ± 0.04 | 3.3 ± 0.16 | 33.6 ± 0.9 |
| APC-XL | 667.3-683.8 | 15.1 ± 1.5 | 9.6 ± 0.98 | 1.0 ± 0.04 | 1.2 ± 0.08 | 5.9 ± 0.7 | 4.1 ± 0.5 | 23.2 ± 3.5 | 91.4 ± 2.3 |
الجدول 1: معلومات الصباغ النقي المستخدمة لتشغيل تحليل مسح لامدا. يوضح هذا الجدول قمم الانبعاث والكتفين / الحد الأقصى لنطاق التألق لمختلف الفلوروكرومات / الأصباغ عن طريق القياس الطيفي للتصوير متحد البؤر لجميع الأطوال الموجية للإثارة ، والنسبة المئوية لانبعاث الضوء بواسطة الأصباغ / الفلوروكرومات. تم حساب القيم بالصيغة: = MFI * 100/255. كل قيمة هي المتوسط ± SE (يعني ± الخطأ القياسي من المتوسط). تم استخدام أصباغ نقية لمعايرة مجهر ليزر المسح البؤري على النحو التالي1،2،10. تم الحصول على الكلوروفيل أ من السبانخية أوليراسيا ، R-phycoerythrin (R-PE) من Porphyra tenera ، و C-phycocyanin (C-PE) من Spirulina sp. تم إذابة جميع الأنواع في الماء المقطر المصفى. تم الحصول على Allophycocyanin-XL (APC-XL) من Mastigocladus laminosus ، الذي تم إذابته في كبريتات الأمونيوم (60٪) وفوسفات البوتاسيوم (الرقم الهيدروجيني = 7) لتحقيق تركيز 38 mM. تم إجراء عمليات المسح باستخدام 400 ميكرولتر من كل محلول صبغي (تركيز 1 مجم / مل) باستخدام غرفة سفلية زجاجية مغطاة ب 8 آبار.
تعد دراسة الطول الموجي للإثارة الواحدة تقريبية أولى مفيدة. ومع ذلك ، في هذه الحالة ، من الضروري توضيح المساهمة النسبية للمجمعات المختلفة في إشارة التألق ، والتي يوصى بإجراء نسبة مضان أو تحليل الطيف عند عدة أطوال موجية ، من بين طرق أخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
تنمو بعض الطحالب الحمراء أحادية الخلية أو الاستعمارية ، مثل Chroothece ، ببطء في المختبر ، ولكنها تحتوي على مركبات ذاتية متعددة يمكن تحليلها عن طريق التحليل الطيفي تحت مجهر متحد البؤر ، حيث يمكن اكتشاف الاختلافات في قمم انبعاث الصباغ. سمح لنا الفحص المجهري الفلوري الطيفي متحد البؤر ب…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم إجراء هذا البحث كجزء من المشروعين TIN2015-68454-R و 20961 / PI / 18 ، بتمويل من وزارة الاقتصاد والقدرة التنافسية الإسبانية ومؤسسة Séneca في منطقة مورسيا. إيرين هيرنانديز مارتينيز وفرانسيسكو خافيير إيبانيز لوبيز من قسم الدعم الإحصائي في المجال العلمي والبحثي بجامعة مورسيا (Sección de Apoyo Estadístico (SAE) ، Área Científica y de Investigación (ACTI) ، جامعة مورسيا ، (الشكل 1 تم رسمها باستخدام صور من Servier Medical Art. تم ترخيص Servier Medical Art by Servier برخصة المشاع الإبداعي نسب المصنف 3.0 Unported (https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/)
Materials
| µ-Dish 35 mm, high Glass Bottom | Ibidi | 81158 | – |
| 24 black well plate | Ibidi | 82406 | flat and clear bottom for high throughput microscopy |
| Algae Incubator | Panasonic | MLR-352-PE | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | SP8 TCS | – |
| Flask | Fisher Scientific | 15380591 | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| green filter | PNTA, LEE filters | – | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| HC PL APO 63X/1.30 GLYC CORR CS2 | Leica Microsystems | 506353 | Glycerol immersion lens |
| Image acquisition software. LAS X | Leica Microsystems | SP8 TCS | – |
| Light source | Panasonic | FL40SSENW/37MLR-352-PE | |
| Quantum photoradiometer | DeltaOhm | DO 9721 | – |
| R software | R Core Team, 2020 | 4.0.2. | – |
| red filter | PNTA, LEE filters | – | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| SWES medium | University of Murcia | – | – |
| Type G Immersion liquid | Leica Microsystems | 11513910 | Glycerol |
Riferimenti
- Vis, M. L., Necchi, O. . Freshwater Red Algae: Phylogeny, Taxonomy and Biogeography. , (2021).
- Aboal, M., et al. Diversity of Chroothece (Rhodophyta, Stylonematales) including two new species. European Journal of Phycology. 53 (2), 189-197 (2018).
- Millach, L., Obiol, A., Solé, A., Esteve, I. A novel method to analyse in vivo the physiological state and cell viability of phototrophic microorganisms by confocal laser scanning microscopy using a dual laser. Journal of Microscopy. 268 (1), 53-65 (2017).
- Millach, L., Villagrasa, E., Solé, A., Esteve, I. Combined confocal laser scanning microscopy techniques for a rapid assessment of the effect and cell viability of Scenedesmus sp. DE2009 under metal stress. Microscopy and Microanalysis. 25 (4), 998-1003 (2019).
- Poryvkina, L., Babichenko, S., Leeben, A. Analysis of phytoplankton pigments by excitation spectra of fluorescence. Proceedings of EARSeL-SIG-Workshop LIDAR. , (2000).
- Beutler, M., et al. A fluorometric method for the differentiation of algal populations in vivo and in situ. Photosynthesis Research. 72 (1), 39-53 (2002).
- Grigoryeva, N., Chistyakova, L. Fluorescence microscopic spectroscopy for investigation and monitoring of biological diversity and physiological state of cyanobacterial cultures. Cyanobacteria. , (2018).
- Grigoryeva, N. . Fluorescence Methods for Investigation of Living Cells and Microorganisms. , (2020).
- Roshchina, V. V. Vital autofluorescence: application to the study of plant living cells. International Journal of Spectroscopy. 2012, 5-18 (2012).
- Roldán, M., Thomas, F., Castel, S., Quesada, A., Hernández-Mariné, M. Noninvasive pigment identification in single cells from living phototrophic biofilms by confocal imaging spectrofluorometry. Applied and Environmental Microbiology. 70 (6), 3745-3750 (2004).
- Hense, B. A., Gais, P., Jütting, U., Scherb, H., Rodenacker, K. Use of fluorescence information for automated phytoplankton investigation by image analysis. Journal of Plankton Research. 30 (5), 587-606 (2008).
- Millie, D. F., Schofield, O. M., Kirkpatrick, G. J., Johnsen, G., Evens, T. J. Using absorbance and fluorescence spectra to discriminate microalgae. European Journal of Phycology. 37 (3), 313-322 (2002).
- Richardson, T. L., et al. Spectral fluorometric characterization of phytoplankton community composition using the Algae Online Analyser. Water Research. 44 (8), 2461-2472 (2010).
- Kieleck, C., Bousquet, B., Le Brun, G., Cariou, J., Lotrian, J. Laser induced fluorescence imaging: application to groups of macroalgae identification. Journal of Physics D: Applied Physics. 34 (16), 2561-2571 (2001).
- Coronado-Parra, T., Roldán, M., Aboal, M. Confocal microscopy in ecophysiological studies of algae: a door to understanding autofluorescence in red algae. Microscopy and Microanalysis. 28 (1), 218-226 (2022).
- Mulec, J., Kosi, G. Lampenflora algae and methods of growth control. Journal of Cave and Karst Studies. 71 (2), 109-115 (2009).
- Nelissen, B., De Baere, R., Wilmotte, A., De Wachter, R. Phylogenetic relationships of nonaxenic filamentous cyanobacterial strains based on 16S rRNA sequence analysis. Journal of Molecular Evolution. 42 (2), 194-200 (1996).
- Roldán, M., Oliva, F., Gónzalez Del Valle, M. A., Saiz-Jimenez, C., Hernández-Mariné, M. Does green light influence the fluorescence properties and structure of phototrophic biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 72 (4), 3026-3031 (2006).
- Topinka, J. A., Bellows, W. K., Yentsch, C. S. Characterization of marine macroalgae by fluorescence signatures. International Journal of Remote Sensing. 11 (12), 2329-2335 (1990).
- Roldán, M., Ascaso, C., Wierzchos, J. Fluorescent fingerprints of endolithic phototrophic cyanobacteria living within halite rocks in the atacama desert. Applied and Environmental Microbiology. 80 (10), 2998-3006 (2014).
- Solé, A., Diestra, E., Esteve, I. Confocal laser scanning microscopy image analysis for cyanobacterial biomass determined at microscale level in different microbial mats. Microbial Ecology. 57 (4), 649-656 (2009).
- Ramírez, O., García, A., Rojas, R., Couve, A., Härtel, S. Confined displacement algorithm determines true and random colocalization in fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 239 (3), 173-183 (2010).
- Universität Gottingen-Georg-August. SAG Culture Collection of Algae. Universität Gottingen-Georg-August. , (2022).
- Zhang, M., et al. Improvement of cell counting method for Neubauer counting chamber. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 34 (1), 23024 (2020).
- Wolf, E., Schüßler, A. Phycobiliprotein fluorescence of Nostoc punctiforme changes during the life cycle and chromatic adaptation: Characterization by spectral confocal laser scanning microscopy and spectral unmixing. Plant, Cell and Environment. 28 (4), 480-491 (2005).
- Zucker, R. M., Rigby, P., Clements, I., Salmon, W., Chua, M. Reliability of confocal microscopy spectral imaging systems: Use of multispectral beads. Cytometry Part A. 71 (3), 174-189 (2007).
- Field, A. M. . Discovering Statistics Using R. , (2013).
- Linnet, K. Limitations of the paired t-test for evaluation of method comparison data. Clinical Chemistry. 45 (2), 314-315 (1999).
- Rosner, B., Grove, D. Use of the Mann-Whitney U-test for clustered data. Statistics in Medicine. 18 (11), 1387-1400 (1999).
- Colin, L., et al. Imaging the living plant cell: from probes to quantification. The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).
- Borlinghaus, R. The white confical: continuous spectral tuning in excitation and emission. Optical Fluorescence Microscopy. , (2011).
