Autofluorescentie beeldvorming om de fysiologie van rode algen te evalueren
Summary
Het huidige protocol beschrijft stapsgewijze autofluorescentiebeeldvorming en evaluatie van fycobiliproteïneveranderingen in rode algen op basis van spectrale analyse. Dit is een labelvrije en niet-destructieve methode om cellulaire aanpassing aan extreme habitats te evalueren, wanneer alleen schaars materiaal beschikbaar is en cellen langzaam of helemaal niet groeien onder laboratoriumomstandigheden.
Abstract
Rode algen (Rhodophyta) bevatten fycobiliproteïnen en koloniseren habitats met weinig licht, maar sommige (bijvoorbeeld sommige Chroothece-soorten ) kunnen zich ook in de volle zon ontwikkelen. De meeste rhodofyten zijn rood, maar sommige kunnen blauwachtig lijken, afhankelijk van de verhouding blauwe en rode biliproteïnen (phycocyanine en phycoerythrin). Verschillende fycobiliproteïnen kunnen licht op verschillende golflengten opvangen en doorgeven aan chlorofyl a, wat fotosynthese onder zeer verschillende lichtomstandigheden mogelijk maakt. Deze pigmenten reageren op habitatveranderingen in licht en hun autofluorescentie kan helpen bij het bestuderen van biologische processen. Met behulp van Chroothece mobilis als modelorganisme en de spectrale lambda-scanmodus in een confocale microscoop, werd de aanpassing van fotosynthetische pigmenten aan verschillende monochromatische lichten op cellulair niveau bestudeerd om de optimale groeiomstandigheden van de soort te raden. De resultaten toonden aan dat, zelfs wanneer de bestudeerde soort uit een grot werd geïsoleerd, deze zich aanpaste aan zowel zwakke als gemiddelde lichtintensiteiten. De gepresenteerde methode is vooral nuttig voor het bestuderen van fotosynthetische organismen die niet of zeer langzaam groeien onder laboratoriumomstandigheden, wat meestal het geval is voor mensen die in extreme habitats leven.
Introduction
Rode algen, zoals het geslacht Chroothece, kunnen groeien in extreme habitats, waar ze vaak te maken hebben met duidelijke veranderingen in het milieu1. Overstromingen en droogtes komen vaak voor in semi-aride gebieden waar dit geslacht te vinden is, en sommige soorten zijn gemeld in kreken, kliffen, grotten of zelfs thermaal water2. Meestal degraderen biologische variabelen, zoals competitie of begrazing, soorten echter naar niet-optimale omstandigheden voor hun groei. Omdat deze organismen vaak moeilijk te kweken zijn en niet of zeer langzaam groeien onder laboratoriumomstandigheden, is een belangrijke beperking de beschikbare steekproefgrootte. Daarom is het erg belangrijk om niet-destructieve methoden of methoden te volgen die minimale monstermanipulatie inhouden 3,4.
De fysiologische vaardigheden die nodig zijn om te overleven in deze ruwe omgevingen kunnen worden gecontroleerd door veranderingen in hun fotosynthetische systemen te volgen. Metabole mechanismen, fotosynthetische efficiëntie en gevoeligheid voor licht of kweekomstandigheden kunnen worden onthuld door pigmentfluorescentie-emissieprofielen, als gevolg van nauwkeurige veranderingen in hun energieoverdracht of het vangenvan 5,6,7,8.
Autofluorescentie van cellulaire verbindingen kan worden gebruikt als een marker voor cytodiagnostiek of als een natuurlijke indicator van cellulaire toestand of metabolisme in reactie op externe en interne signalen door veranderingen in emissie9. Het kan ook worden gebruikt om taxonomisch verschillende groepen fotosynthetische organismen te onderscheiden10. Afhankelijk van de fylogenetische positie van fototrofe micro-organismen, kan men verschillende in vivo fluorescentiekenmerken vinden. Daarom is bij verschillende gelegenheden geprobeerd een taxonomische identificatie te maken op basis van de in vivo kenmerken van fototrofe fluorescentie (met inbegrip van fluorescentieabsorptie en emissiespectra)11,12. Vanwege de diversiteit in accessoire pigmenten tussen fytoplanktontaxa, kunnen verschillen in de golflengten waarbij chlorofyl a (Chl a) fluorescentie wordt gestimuleerd, of verschillen in emissiespectra, worden gebruikt om taxonomie13 af te leiden. De in vivo fluorescentie-excitatie en emissiespectra van deze exemplaren zijn niet alleen afhankelijk van de phyla van algen, maar ook van fotosysteemaanpassing14. De efficiëntie van energieoverdracht naar Chl a, of de verhouding van Chl a tot accessoire pigmenten, en het cellulaire pigmentgehalte zijn gevoelig voor groeiomstandigheden5.
Rode algen, met name Chroothece, hebben verschillende accessoire fluorescerende pigmenten-phycobiliproteïnen en carotenoïden; Het eerste concentraat in fycobilisomen gehecht aan de thylakoïden van chloroplasten. Phycobiliproteïnen (phycocyanine, phycoerythrin en allophycocyanine) kunnen licht op verschillende golflengten opvangen en doorgeven aan Chl a, wat fotosynthese in zeer verschillende licht- en kweekomstandigheden mogelijk maakt15. Chroothece-soorten kunnen bijvoorbeeld in grotten groeien of bijna opduiken in licht zoute kalkhoudende beken2.
Monochromatische lichten beïnvloeden de groei en pigmentsamenstelling van fotosynthetische organismen en zijn bestudeerd om de groei van fotosynthetische organismen in grotten te voorkomen of te beheersen. Mulec et al. toonden aan dat rood verrijkte verlichting de groei van cyanobacteriën, algen en planten bevordert16. Eerdere studies hebben ook gemeld dat groen licht de pigmentsamenstelling van cyanobacteriënbeïnvloedt 17, terwijl anderen hebben aangetoond dat groen licht de groei van de meeste fotosynthetische organismen voorkomt en sommige cyanobacteriën vertonen een vermindering van thylakoïden en een zwakkere gemiddelde fluorescentie-intensiteit18.
Om het vermogen van Chroothece als modelorganisme om zware omstandigheden te overwinnen te begrijpen, zijn gekweekte cellen blootgesteld aan toenemende lichtintensiteiten en monochroom licht (groen of rood)15, om te zien hoe het omgaat met de schemerige omstandigheden van grotten (waar rood licht overheerst). Het hierin gepresenteerde protocol reproduceert het effect van de bovengenoemde variabelen op Chroothece’s phycobiliproteïnen op cellulair niveau met behulp van zijn eigen autofluorescentie.
Tegenwoordig wordt fluorescentie vaak gebruikt als een hulpmiddel om de fysiologische reacties van vaatplanten, microalgen, macroalgen en cyanobacteriën te bestuderen13,14,16. Spectrale confocale fluorescentiemicroscopie is een uitstekend hulpmiddel voor in vivo studies om de fysiologie van fotosynthetische monsters op eencellig niveau 10,17,18,19,20 te evalueren, door problemen in verband met de lage groeisnelheid in het laboratorium en de moeilijkheden bij het verkrijgen van voldoende biomassa voor de bijbehorende extractie en biochemische methodente vermijden 8 . Zodra cellen gedurende 2 weken onder verschillende kweekomstandigheden zijn behandeld, kan het lambdasscanprofiel in vivo worden gemeten. Hoewel er verschillende publicaties zijn waarin verschillende golflengten van excitatie door confocale beeldvorming zijn gebruikt 3,4,10,17, kunnen de meeste fycobiliproteïnen en Chl a worden gedetecteerd met behulp van een excitatielijn met een golflengte van 561 nm en de gedetecteerde emissie varieert van 570 tot 760 nm golflengte. Deze criteria zijn gebaseerd op een analyse die eerder is uitgevoerd 10 met commerciële zuivere pigmenten (tabel 1) door confocale beeldvorming en de verkregen resultaten bij verschillende algensoorten20,21,22.
| Pigmenten | λflmax (nm) | λ exc (nm) | |||||||
| 351 | 364 | 458 | 476 | 488 | 514 | 543 | 633 | ||
| Chl een | 660.9-678.1 | 43,4 ± 1,8 | 11,2 ± 0,2 | 1,8 ± 0,05 | 2,0 ± 0,08 | 12,2 ± 0,7 | 6,0 ± 0,3 | 4,2 ± 0,16 | 80,7 ± 1,5 |
| R-PE | 569.2-583.3 | 5,9 ± 0,6 | 5,9 ± 0,16 | 11,1 ± 0,04 | 42,2 ± 0,3 | 100,0 ± 0 | 90,0 ± 0,3 | 99,2 ± 0,08 | – |
| 652.1-668.6 | – | – | 1,5 ± 0,01 | 3,7 ± 0,04 | 26,7 ± 0,5 | 8,7 ± 0,16 | 11,1 ± 0,16 | 11,3 ± 0,2 | |
| C-pc | 636.2-676.4 | 2,3 ± 0,04 | 1,0 ± 0,01 | 0,6 ± 0,004 | 0,7 ± 0,008 | 2,0 ± 0,08 | 2,0 ± 0,04 | 3,3 ± 0,16 | 33,6 ± 0,9 |
| APC-XL | 667.3-683.8 | 15,1 ± 1,5 | 9,6 ± 0,98 | 1,0 ± 0,04 | 1,2 ± 0,08 | 5,9 ± 0,7 | 4,1 ± 0,5 | 23,2 ± 3,5 | 91,4 ± 2,3 |
Tabel 1: De zuivere pigmentinformatie die wordt gebruikt om de lambdasscananalyse uit te voeren. Deze tabel toont emissiepieken en schouders/fluorescentiebandmaxima van verschillende fluorochromen/pigmenten door confocale beeldvormingsspectrofotometrie voor alle excitatiegolflengten, en het percentage lichtemissie door pigmenten/fluorochromen. De waarden werden berekend met de formule: = MFI*100/255. Elke waarde is het gemiddelde ± SE (gemiddelde ± standaardfout ten opzichte van het gemiddelde). Zuivere pigmenten werden gebruikt voor het kalibreren van de confocale scanning laser microscoop als volgt 1,2,10. Chlorofyl a werd verkregen uit Spinacia oleracea, R-phycoerythrin (R-PE) uit Porphyra tenera en C-phycocyanine (C-PE) uit Spirulina sp. Alle soorten werden opgelost in gefilterd gedestilleerd water. Allophycocyanine-XL (APC-XL) werd verkregen uit Mastigocladus laminosus, dat werd opgelost in ammoniumsulfaat (60%) en kaliumfosfaat (pH = 7) om een concentratie van 38 mM te bereiken. De scans werden uitgevoerd met 400 μL van elke pigmentoplossing (concentratie van 1 mg / ml) met behulp van een 8-goed bedekte glazen bodemkamer.
De studie van een enkele excitatiegolflengte is een vrij nuttige eerste benadering. In dit geval is het echter noodzakelijk om de relatieve bijdrage van de verschillende complexen in het fluorescentiesignaal op te helderen, wat wordt aanbevolen om onder andere een fluorescentieverhouding of spectrumanalyse op verschillende golflengten uit te voeren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sommige eencellige of koloniale rode algen, zoals Chroothece, groeien langzaam in vitro, maar bevatten meerdere autofluorescente verbindingen die kunnen worden geanalyseerd door spectrale analyse onder een confocale microscoop, waar verschillen in pigmentemissiepieken kunnen worden gedetecteerd. Spectrale confocale fluorescentiemicroscopie heeft ons in staat gesteld om in vivo studies uit te voeren om de aanpassing of acclimatisatie van fotosynthetische organismen te evalueren 8,10,17,18,19,20….
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd uitgevoerd in het kader van de projecten TIN2015-68454-R en 20961/PI/18, gefinancierd door het Spaanse ministerie van Economie en Concurrentievermogen en de Séneca Foundation van de regio Murcia. Irene Hernández Martínez en Francisco Javier Ibáñez López van de afdeling Statistische Ondersteuning van het Wetenschappelijk en Onderzoeksgebied van de Universiteit van Murcia (Sección de Apoyo Estadístico (SAE), Área Científica y de Investigación (ACTI), Universidad de Murcia, (Figuur 1 werd getekend met behulp van afbeeldingen van Servier Medical Art. Servier Medical Art by Servier is gelicentieerd met een Creative Commons Attribution 3.0 Unported License (https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/)
Materials
| µ-Dish 35 mm, high Glass Bottom | Ibidi | 81158 | – |
| 24 black well plate | Ibidi | 82406 | flat and clear bottom for high throughput microscopy |
| Algae Incubator | Panasonic | MLR-352-PE | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | SP8 TCS | – |
| Flask | Fisher Scientific | 15380591 | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| green filter | PNTA, LEE filters | – | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| HC PL APO 63X/1.30 GLYC CORR CS2 | Leica Microsystems | 506353 | Glycerol immersion lens |
| Image acquisition software. LAS X | Leica Microsystems | SP8 TCS | – |
| Light source | Panasonic | FL40SSENW/37MLR-352-PE | |
| Quantum photoradiometer | DeltaOhm | DO 9721 | – |
| R software | R Core Team, 2020 | 4.0.2. | – |
| red filter | PNTA, LEE filters | – | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| SWES medium | University of Murcia | – | – |
| Type G Immersion liquid | Leica Microsystems | 11513910 | Glycerol |
Riferimenti
- Vis, M. L., Necchi, O. . Freshwater Red Algae: Phylogeny, Taxonomy and Biogeography. , (2021).
- Aboal, M., et al. Diversity of Chroothece (Rhodophyta, Stylonematales) including two new species. European Journal of Phycology. 53 (2), 189-197 (2018).
- Millach, L., Obiol, A., Solé, A., Esteve, I. A novel method to analyse in vivo the physiological state and cell viability of phototrophic microorganisms by confocal laser scanning microscopy using a dual laser. Journal of Microscopy. 268 (1), 53-65 (2017).
- Millach, L., Villagrasa, E., Solé, A., Esteve, I. Combined confocal laser scanning microscopy techniques for a rapid assessment of the effect and cell viability of Scenedesmus sp. DE2009 under metal stress. Microscopy and Microanalysis. 25 (4), 998-1003 (2019).
- Poryvkina, L., Babichenko, S., Leeben, A. Analysis of phytoplankton pigments by excitation spectra of fluorescence. Proceedings of EARSeL-SIG-Workshop LIDAR. , (2000).
- Beutler, M., et al. A fluorometric method for the differentiation of algal populations in vivo and in situ. Photosynthesis Research. 72 (1), 39-53 (2002).
- Grigoryeva, N., Chistyakova, L. Fluorescence microscopic spectroscopy for investigation and monitoring of biological diversity and physiological state of cyanobacterial cultures. Cyanobacteria. , (2018).
- Grigoryeva, N. . Fluorescence Methods for Investigation of Living Cells and Microorganisms. , (2020).
- Roshchina, V. V. Vital autofluorescence: application to the study of plant living cells. International Journal of Spectroscopy. 2012, 5-18 (2012).
- Roldán, M., Thomas, F., Castel, S., Quesada, A., Hernández-Mariné, M. Noninvasive pigment identification in single cells from living phototrophic biofilms by confocal imaging spectrofluorometry. Applied and Environmental Microbiology. 70 (6), 3745-3750 (2004).
- Hense, B. A., Gais, P., Jütting, U., Scherb, H., Rodenacker, K. Use of fluorescence information for automated phytoplankton investigation by image analysis. Journal of Plankton Research. 30 (5), 587-606 (2008).
- Millie, D. F., Schofield, O. M., Kirkpatrick, G. J., Johnsen, G., Evens, T. J. Using absorbance and fluorescence spectra to discriminate microalgae. European Journal of Phycology. 37 (3), 313-322 (2002).
- Richardson, T. L., et al. Spectral fluorometric characterization of phytoplankton community composition using the Algae Online Analyser. Water Research. 44 (8), 2461-2472 (2010).
- Kieleck, C., Bousquet, B., Le Brun, G., Cariou, J., Lotrian, J. Laser induced fluorescence imaging: application to groups of macroalgae identification. Journal of Physics D: Applied Physics. 34 (16), 2561-2571 (2001).
- Coronado-Parra, T., Roldán, M., Aboal, M. Confocal microscopy in ecophysiological studies of algae: a door to understanding autofluorescence in red algae. Microscopy and Microanalysis. 28 (1), 218-226 (2022).
- Mulec, J., Kosi, G. Lampenflora algae and methods of growth control. Journal of Cave and Karst Studies. 71 (2), 109-115 (2009).
- Nelissen, B., De Baere, R., Wilmotte, A., De Wachter, R. Phylogenetic relationships of nonaxenic filamentous cyanobacterial strains based on 16S rRNA sequence analysis. Journal of Molecular Evolution. 42 (2), 194-200 (1996).
- Roldán, M., Oliva, F., Gónzalez Del Valle, M. A., Saiz-Jimenez, C., Hernández-Mariné, M. Does green light influence the fluorescence properties and structure of phototrophic biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 72 (4), 3026-3031 (2006).
- Topinka, J. A., Bellows, W. K., Yentsch, C. S. Characterization of marine macroalgae by fluorescence signatures. International Journal of Remote Sensing. 11 (12), 2329-2335 (1990).
- Roldán, M., Ascaso, C., Wierzchos, J. Fluorescent fingerprints of endolithic phototrophic cyanobacteria living within halite rocks in the atacama desert. Applied and Environmental Microbiology. 80 (10), 2998-3006 (2014).
- Solé, A., Diestra, E., Esteve, I. Confocal laser scanning microscopy image analysis for cyanobacterial biomass determined at microscale level in different microbial mats. Microbial Ecology. 57 (4), 649-656 (2009).
- Ramírez, O., García, A., Rojas, R., Couve, A., Härtel, S. Confined displacement algorithm determines true and random colocalization in fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 239 (3), 173-183 (2010).
- Universität Gottingen-Georg-August. SAG Culture Collection of Algae. Universität Gottingen-Georg-August. , (2022).
- Zhang, M., et al. Improvement of cell counting method for Neubauer counting chamber. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 34 (1), 23024 (2020).
- Wolf, E., Schüßler, A. Phycobiliprotein fluorescence of Nostoc punctiforme changes during the life cycle and chromatic adaptation: Characterization by spectral confocal laser scanning microscopy and spectral unmixing. Plant, Cell and Environment. 28 (4), 480-491 (2005).
- Zucker, R. M., Rigby, P., Clements, I., Salmon, W., Chua, M. Reliability of confocal microscopy spectral imaging systems: Use of multispectral beads. Cytometry Part A. 71 (3), 174-189 (2007).
- Field, A. M. . Discovering Statistics Using R. , (2013).
- Linnet, K. Limitations of the paired t-test for evaluation of method comparison data. Clinical Chemistry. 45 (2), 314-315 (1999).
- Rosner, B., Grove, D. Use of the Mann-Whitney U-test for clustered data. Statistics in Medicine. 18 (11), 1387-1400 (1999).
- Colin, L., et al. Imaging the living plant cell: from probes to quantification. The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).
- Borlinghaus, R. The white confical: continuous spectral tuning in excitation and emission. Optical Fluorescence Microscopy. , (2011).
