Автофлуоресцентная визуализация для оценки физиологии красных водорослей
Summary
Настоящий протокол описывает пошаговую автофлуоресцентную визуализацию и оценку изменений фикобилипротеина у красных водорослей на основе спектрального анализа. Это безымянный и неразрушающий метод оценки клеточной адаптации к экстремальным местам обитания, когда доступен только дефицитный материал, а клетки растут медленно или вообще не растут в лабораторных условиях.
Abstract
Красные водоросли (Rhodophyta) содержат фикобилипротеины и колонизируют места обитания с тусклым светом, однако некоторые (например, некоторые виды Chroothece ) также могут развиваться при полном солнечном свете. Большинство родофитов красные, однако некоторые из них могут казаться голубоватыми, в зависимости от пропорции синих и красных билипротеинов (фикоцианина и фикоэритрина). Различные фикобилипротеины могут улавливать свет на разных длинах волн и передавать его хлорофиллу а, что делает возможным фотосинтез при самых разных условиях освещения. Эти пигменты реагируют на изменения среды обитания в свете, и их автофлуоресценция может помочь в изучении биологических процессов. Используя Chroothece mobilis в качестве модельного организма и режим спектрального лямбда-сканирования в конфокальном микроскопе, адаптация фотосинтетических пигментов к различным монохроматическим источникам света была изучена на клеточном уровне, чтобы угадать оптимальные условия роста вида. Результаты показали, что даже когда исследуемый штамм был изолирован из пещеры, он адаптировался как к тусклому, так и к среднему освещению. Представленный метод особенно полезен для изучения фотосинтезирующих организмов, которые не растут или растут очень медленно в лабораторных условиях, что обычно имеет место для тех, кто живет в экстремальных средах обитания.
Introduction
Красные водоросли, такие как род Chroothece, могут расти в экстремальных местах обитания, где им часто приходится справляться с заметными изменениями окружающей среды1. Наводнения и засухи часты в полузасушливых регионах, где можно найти этот род, а некоторые виды были зарегистрированы в ручьях, скалах, пещерах или даже в термальных водах2. Однако в большинстве случаев биологические переменные, такие как конкуренция или выпас скота, низводят виды до неоптимальных условий для их роста. Поскольку эти организмы часто трудно культивировать и они либо не растут, либо растут очень медленно в лабораторных условиях, одним из основных ограничений является доступный размер выборки. Поэтому очень важно следовать неразрушающим методам или методам, которые предполагают минимальные манипуляции с образцом 3,4.
Физиологические навыки, необходимые для выживания в этих суровых условиях, можно контролировать, следя за изменениями в их фотосинтетических системах. Метаболические механизмы, эффективность фотосинтеза и чувствительность к свету или условиям культуры могут быть выявлены с помощью профилей излучения флуоресценции пигментов из-за точных изменений в их передаче энергии или улавливании 5,6,7,8.
Аутофлуоресценция клеточных соединений может быть использована в качестве маркера для цитодиагностики или в качестве естественного индикатора клеточного состояния или метаболизма в ответ на внешние и внутренние сигналы посредством изменений излучения9. Он также может быть использован для различения таксономически различных групп фотосинтезирующих организмов10. В зависимости от филогенетического положения фототрофных микроорганизмов можно обнаружить различные особенности флуоресценции in vivo. Таким образом, таксономическая идентификация, основанная на характеристиках фототрофной флуоресценции in vivo (включая спектры поглощения флуоресценции и излучения), была предпринята несколько раз11,12. Из-за разнообразия вспомогательных пигментов среди таксонов фитопланктона различия в длинах волн, на которых стимулируется флуоресценция хлорофилла a (Chl a), или различия в спектрах излучения могут быть использованы для выводатаксономии 13. Спектры возбуждения и излучения флуоресценции in vivo этих образцов зависят не только от типа водорослей, но и от адаптации фотосистемы14. Эффективность передачи энергии к Chl a, или отношение Chl a к вспомогательным пигментам, и содержание клеточного пигмента чувствительны к условиям роста5.
Красные водоросли, особенно Chroothece, имеют несколько дополнительных флуоресцентных пигментов – фикобилипротеинов и каротиноидов; Первые концентрируются в фикобилисомах, прикрепленных к тилакоидам хлоропластов. Фикобилипротеины (фикоцианин, фикоэритрин и аллофикоцианин) могут улавливать свет на разных длинах волн и передавать его Chl a, что делает возможным фотосинтез в самых разных условиях света и культуры15. Например, виды Chroothece могут расти внутри пещер или почти появляться в слегка соленых известковых ручьях2.
Монохроматические огни влияют на рост и пигментный состав фотосинтезирующих организмов и были изучены для предотвращения или контроля роста фотосинтезирующих организмов в пещерах. Mulec et al. показали, что освещение, обогащенное красным цветом, способствует росту цианобактерий, водорослей и растений16. В предыдущих исследованиях также сообщалось, что зеленый свет влияет на пигментный состав цианобактерий17, в то время как другие показали, что зеленый свет предотвращает рост большинства фотосинтезирующих организмов, а некоторые цианобактерии демонстрируют снижение тилакоидов и более слабую среднюю интенсивность флуоресценции18.
Чтобы понять способность Chroothece как модельного организма преодолевать суровые условия, культивируемые клетки подвергались воздействию увеличения интенсивности света и монохроматического света (зеленого или красного)15, чтобы увидеть, как он справляется с тусклыми условиями пещер (где преобладает красный свет). Протокол, представленный в настоящем описании, воспроизводит влияние вышеупомянутых переменных на фикобилипротеины Chroothece на клеточном уровне с использованием собственной автофлуоресценции.
В настоящее время флуоресценция широко используется в качестве инструмента для изучения физиологических реакций сосудистых растений, микроводорослей, макроводорослей и цианобактерий13,14,16. Спектральная конфокальная флуоресцентная микроскопия является превосходным инструментом для исследований in vivo для оценки физиологии фотосинтезирующих образцов на уровне отдельных клеток 10,17,18,19,20, избегая проблем, связанных с низкой скоростью роста в лаборатории и трудностями с получением достаточного количества биомассы для соответствующей экстракции и биохимических методов8 . После обработки клеток в различных условиях культивирования в течение 2 недель профиль лямбда-сканирования можно измерить in vivo. Хотя существует несколько публикаций, в которых использовались различные длины волн возбуждения с помощью конфокальной визуализации 3,4,10,17, большинство фикобилипротеинов и Chl a могут быть обнаружены с использованием линии возбуждения с длиной волны 561 нм, а обнаруженное излучение колеблется от 570 до 760 нм. Эти критерии были основаны на анализе, ранее проведенном 10 с коммерческими чистыми пигментами (таблица 1) с помощью конфокальной визуализации, и полученных результатах на различных видах водорослей20,21,22.
| Пигменты | λflmax (нм) | λ exc (нм) | |||||||
| 351 | 364 | 458 | 476 | 488 | 514 | 543 | 633 | ||
| Chl a | 660.9-678.1 | 43,4 ± 1,8 | 11.2 ± 0.2 | 1.8 ± 0.05 | 2.0 ± 0.08 | 12.2 ± 0.7 | 6.0 ± 0.3 | 4.2 ± 0.16 | 80,7 ± 1,5 |
| Р-ПЭ | 569.2-583.3 | 5.9 ± 0.6 | 5.9 ± 0.16 | 11.1 ± 0.04 | 42.2 ± 0.3 | 100.0 ± 0 | 90,0 ± 0,3 | 99.2 ± 0.08 | – |
| 652.1-668.6 | – | – | 1.5 ± 0.01 | 3.7 ± 0.04 | 26.7 ± 0.5 | 8.7 ± 0.16 | 11.1 ± 0.16 | 11.3 ± 0.2 | |
| С-ПК | 636.2-676.4 | 2.3 ± 0.04 | 1.0 ± 0.01 | 0,6 ± 0,004 | 0,7 ± 0,008 | 2.0 ± 0.08 | 2.0 ± 0.04 | 3.3 ± 0.16 | 33.6 ± 0.9 |
| БТР-XL | 667.3-683.8 | 15.1 ± 1.5 | 9.6 ± 0.98 | 1.0 ± 0.04 | 1.2 ± 0.08 | 5.9 ± 0.7 | 4.1 ± 0.5 | 23.2 ± 3.5 | 91,4 ± 2,3 |
Таблица 1: Информация о чистом пигменте, используемая для выполнения анализа лямбда-сканирования. В этой таблице показаны пики излучения и максимумы плеч / полос флуоресценции различных флуорохромов/пигментов с помощью спектрофотометрии конфокальной визуализации для всех длин волн возбуждения, а также процент светового излучения пигментов/флуорохромов. Значения рассчитывались по формуле: = MFI*100/255. Каждое значение является средним значением ± SE (среднее ± стандартной ошибки от среднего). Чистые пигменты были использованы для калибровки конфокального сканирующего лазерного микроскопа следующим образом: 1,2,10. Хлорофилл а был получен из Spinacia oleracea, R-фикоэритрин (R-PE) из Porphyra tenera и C-фикоцианин (C-PE) из Spirulina sp. Все виды растворяли в фильтрованной дистиллированной воде. Аллофикоцианин-XL (APC-XL) был получен из Mastigocladus laminosus, который растворяли в сульфате аммония (60%) и фосфате калия (pH = 7) для достижения концентрации 38 мМ. Сканирование проводили с 400 мкл каждого пигментного раствора (концентрация 1 мг / мл) с использованием 8-лунной стеклянной нижней камеры.
Изучение одной длины волны возбуждения является весьма полезным первым приближением. В этом случае, однако, необходимо выяснить относительный вклад различных комплексов в сигнал флуоресценции, что рекомендуется для выполнения коэффициента флуоресценции или спектрального анализа на нескольких длинах волн, среди других методов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Некоторые одноклеточные или колониальные красные водоросли, такие как Chroothece, медленно растут in vitro, но содержат несколько автофлуоресцентных соединений, которые могут быть проанализированы с помощью спектрального анализа под конфокальным микроскопом, где могут быть обнаруж…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было проведено в рамках проектов TIN2015-68454-R и 20961/PI/18, финансируемых Министерством экономики и конкурентоспособности Испании и Фондом Сенека региона Мурсия. Ирен Эрнандес Мартинес и Франсиско Хавьер Ибаньес Лопес из Секции статистической поддержки научно-исследовательской области Университета Мурсии (Sección de Apoyo Estadístico (SAE), Área Científica y de Investigación (ACTI), Universidad de Murcia, (рис. 1 ) были нарисованы с использованием рисунков из Servier Medical Art. Servier Medical Art by Servier лицензируется лицензией Creative Commons Attribution 3.0 Unported License (https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/)
Materials
| µ-Dish 35 mm, high Glass Bottom | Ibidi | 81158 | – |
| 24 black well plate | Ibidi | 82406 | flat and clear bottom for high throughput microscopy |
| Algae Incubator | Panasonic | MLR-352-PE | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | SP8 TCS | – |
| Flask | Fisher Scientific | 15380591 | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| green filter | PNTA, LEE filters | – | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| HC PL APO 63X/1.30 GLYC CORR CS2 | Leica Microsystems | 506353 | Glycerol immersion lens |
| Image acquisition software. LAS X | Leica Microsystems | SP8 TCS | – |
| Light source | Panasonic | FL40SSENW/37MLR-352-PE | |
| Quantum photoradiometer | DeltaOhm | DO 9721 | – |
| R software | R Core Team, 2020 | 4.0.2. | – |
| red filter | PNTA, LEE filters | – | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| SWES medium | University of Murcia | – | – |
| Type G Immersion liquid | Leica Microsystems | 11513910 | Glycerol |
Riferimenti
- Vis, M. L., Necchi, O. . Freshwater Red Algae: Phylogeny, Taxonomy and Biogeography. , (2021).
- Aboal, M., et al. Diversity of Chroothece (Rhodophyta, Stylonematales) including two new species. European Journal of Phycology. 53 (2), 189-197 (2018).
- Millach, L., Obiol, A., Solé, A., Esteve, I. A novel method to analyse in vivo the physiological state and cell viability of phototrophic microorganisms by confocal laser scanning microscopy using a dual laser. Journal of Microscopy. 268 (1), 53-65 (2017).
- Millach, L., Villagrasa, E., Solé, A., Esteve, I. Combined confocal laser scanning microscopy techniques for a rapid assessment of the effect and cell viability of Scenedesmus sp. DE2009 under metal stress. Microscopy and Microanalysis. 25 (4), 998-1003 (2019).
- Poryvkina, L., Babichenko, S., Leeben, A. Analysis of phytoplankton pigments by excitation spectra of fluorescence. Proceedings of EARSeL-SIG-Workshop LIDAR. , (2000).
- Beutler, M., et al. A fluorometric method for the differentiation of algal populations in vivo and in situ. Photosynthesis Research. 72 (1), 39-53 (2002).
- Grigoryeva, N., Chistyakova, L. Fluorescence microscopic spectroscopy for investigation and monitoring of biological diversity and physiological state of cyanobacterial cultures. Cyanobacteria. , (2018).
- Grigoryeva, N. . Fluorescence Methods for Investigation of Living Cells and Microorganisms. , (2020).
- Roshchina, V. V. Vital autofluorescence: application to the study of plant living cells. International Journal of Spectroscopy. 2012, 5-18 (2012).
- Roldán, M., Thomas, F., Castel, S., Quesada, A., Hernández-Mariné, M. Noninvasive pigment identification in single cells from living phototrophic biofilms by confocal imaging spectrofluorometry. Applied and Environmental Microbiology. 70 (6), 3745-3750 (2004).
- Hense, B. A., Gais, P., Jütting, U., Scherb, H., Rodenacker, K. Use of fluorescence information for automated phytoplankton investigation by image analysis. Journal of Plankton Research. 30 (5), 587-606 (2008).
- Millie, D. F., Schofield, O. M., Kirkpatrick, G. J., Johnsen, G., Evens, T. J. Using absorbance and fluorescence spectra to discriminate microalgae. European Journal of Phycology. 37 (3), 313-322 (2002).
- Richardson, T. L., et al. Spectral fluorometric characterization of phytoplankton community composition using the Algae Online Analyser. Water Research. 44 (8), 2461-2472 (2010).
- Kieleck, C., Bousquet, B., Le Brun, G., Cariou, J., Lotrian, J. Laser induced fluorescence imaging: application to groups of macroalgae identification. Journal of Physics D: Applied Physics. 34 (16), 2561-2571 (2001).
- Coronado-Parra, T., Roldán, M., Aboal, M. Confocal microscopy in ecophysiological studies of algae: a door to understanding autofluorescence in red algae. Microscopy and Microanalysis. 28 (1), 218-226 (2022).
- Mulec, J., Kosi, G. Lampenflora algae and methods of growth control. Journal of Cave and Karst Studies. 71 (2), 109-115 (2009).
- Nelissen, B., De Baere, R., Wilmotte, A., De Wachter, R. Phylogenetic relationships of nonaxenic filamentous cyanobacterial strains based on 16S rRNA sequence analysis. Journal of Molecular Evolution. 42 (2), 194-200 (1996).
- Roldán, M., Oliva, F., Gónzalez Del Valle, M. A., Saiz-Jimenez, C., Hernández-Mariné, M. Does green light influence the fluorescence properties and structure of phototrophic biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 72 (4), 3026-3031 (2006).
- Topinka, J. A., Bellows, W. K., Yentsch, C. S. Characterization of marine macroalgae by fluorescence signatures. International Journal of Remote Sensing. 11 (12), 2329-2335 (1990).
- Roldán, M., Ascaso, C., Wierzchos, J. Fluorescent fingerprints of endolithic phototrophic cyanobacteria living within halite rocks in the atacama desert. Applied and Environmental Microbiology. 80 (10), 2998-3006 (2014).
- Solé, A., Diestra, E., Esteve, I. Confocal laser scanning microscopy image analysis for cyanobacterial biomass determined at microscale level in different microbial mats. Microbial Ecology. 57 (4), 649-656 (2009).
- Ramírez, O., García, A., Rojas, R., Couve, A., Härtel, S. Confined displacement algorithm determines true and random colocalization in fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 239 (3), 173-183 (2010).
- Universität Gottingen-Georg-August. SAG Culture Collection of Algae. Universität Gottingen-Georg-August. , (2022).
- Zhang, M., et al. Improvement of cell counting method for Neubauer counting chamber. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 34 (1), 23024 (2020).
- Wolf, E., Schüßler, A. Phycobiliprotein fluorescence of Nostoc punctiforme changes during the life cycle and chromatic adaptation: Characterization by spectral confocal laser scanning microscopy and spectral unmixing. Plant, Cell and Environment. 28 (4), 480-491 (2005).
- Zucker, R. M., Rigby, P., Clements, I., Salmon, W., Chua, M. Reliability of confocal microscopy spectral imaging systems: Use of multispectral beads. Cytometry Part A. 71 (3), 174-189 (2007).
- Field, A. M. . Discovering Statistics Using R. , (2013).
- Linnet, K. Limitations of the paired t-test for evaluation of method comparison data. Clinical Chemistry. 45 (2), 314-315 (1999).
- Rosner, B., Grove, D. Use of the Mann-Whitney U-test for clustered data. Statistics in Medicine. 18 (11), 1387-1400 (1999).
- Colin, L., et al. Imaging the living plant cell: from probes to quantification. The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).
- Borlinghaus, R. The white confical: continuous spectral tuning in excitation and emission. Optical Fluorescence Microscopy. , (2011).
