Autofluorescensavbildning för att utvärdera rödalgernas fysiologi
Summary
Detta protokoll beskriver steg-för-steg autofluorescensavbildning och utvärdering av fykobiliproteinförändringar i röda alger baserat på spektralanalys. Detta är en etikettfri och icke-destruktiv metod för att utvärdera cellulär anpassning till extrema livsmiljöer, när endast knappa material är tillgängligt och celler växer långsamt, eller inte alls, under laboratorieförhållanden.
Abstract
Röda alger (Rhodophyta) innehåller phycobiliproteiner och koloniserar livsmiljöer med svagt ljus, men vissa (t.ex. vissa Chroothece-arter ) kan också utvecklas i fullt solsken. De flesta rodofyter är röda, men vissa kan verka blåaktiga, beroende på andelen blå och röda biliproteiner (phycocyanin och phycoerythrin). Olika fykobiliproteiner kan fånga ljus vid olika våglängder och överföra det till klorofyll a, vilket möjliggör fotosyntes under mycket olika ljusförhållanden. Dessa pigment svarar på livsmiljöförändringar i ljus, och deras autofluorescens kan hjälpa till att studera biologiska processer. Med Chroothece mobilis som modellorganism och spektral lambdaskanningsmetod i ett konfokalmikroskop studerades anpassningen av fotosyntetiska pigment till olika monokromatiska ljus på cellulär nivå för att gissa artens optimala tillväxtförhållanden. Resultaten visade att även när den studerade stammen isolerades från en grotta, anpassade den sig till både svaga och medelhöga ljusintensiteter. Den presenterade metoden är särskilt användbar för att studera fotosyntetiska organismer som inte växer eller växer mycket långsamt under laboratorieförhållanden, vilket vanligtvis är fallet för dem som lever i extrema livsmiljöer.
Introduction
Röda alger, som släktet Chroothece, kan växa i extrema livsmiljöer, där de ofta måste hantera markanta miljöförändringar1. Översvämningar och torka är vanliga i halvtorra regioner där detta släkte kan hittas, och vissa arter har rapporterats i bäckar, klippor, grottor eller till och med termiskt vatten2. Men för det mesta förvisar biologiska variabler, såsom konkurrens eller bete, arter till icke-optimala förhållanden för deras tillväxt. Eftersom dessa organismer ofta är svåra att odla och antingen inte växer eller växer mycket långsamt under laboratorieförhållanden, är en stor begränsning den tillgängliga provstorleken. Därför är det mycket viktigt att följa icke-destruktiva metoder eller metoder som involverar minimal provmanipulation 3,4.
De fysiologiska färdigheter som behövs för att överleva i dessa hårda miljöer kan övervakas genom att följa förändringar i deras fotosyntetiska system. Metaboliska mekanismer, fotosyntetisk effektivitet och känslighet för ljus- eller odlingsförhållanden kan avslöjas av pigmentfluorescensemissionsprofiler på grund av exakta förändringar i deras energiöverföring eller fångst 5,6,7,8.
Autofluorescens av cellulära föreningar kan användas som en markör för cytodiagnos eller som en naturlig indikator på cellulärt tillstånd eller metabolism som svar på externa och interna signaler genom förändringar i emission9. Det kan också användas för att taxonomiskt diskriminera olika grupper av fotosyntetiska organismer10. Beroende på den fylogenetiska positionen för fototrofa mikroorganismer kan man hitta olika fluorescensegenskaper in vivo. Därför har en taxonomisk identifiering baserad på in vivo-egenskaperna hos fototrofisk fluorescens (inklusive fluorescensabsorption och emissionsspektra) gjorts vid flera tillfällen11,12. På grund av mångfalden i accessoriska pigment bland fytoplanktontaxa kan skillnader i våglängderna vid vilka klorofyll a (Chl a) fluorescens stimuleras, eller skillnader i emissionsspektra, användas för att härleda taxonomi13. In vivo fluorescensexcitation och emissionsspektra för dessa prover förlitar sig inte bara på algens fyla utan också på fotosystemanpassning14. Effektiviteten av energiöverföring till Chl a, eller förhållandet mellan Chl a och tillbehörspigment, och cellulärt pigmentinnehåll är känsliga för tillväxtförhållanden5.
Röda alger, särskilt Chroothece, har flera accessoriska fluorescerande pigment-fykobiliproteiner och karotenoider; Det förra koncentreras i phycobilisomes bundna till tylakoiderna av kloroplaster. Phycobiliproteins (phycocyanin, phycoerytrin och allophycocyanin) kan fånga ljus vid olika våglängder och överföra det till Chl a, vilket möjliggör fotosyntes i mycket olika ljus- och odlingsförhållanden15. Till exempel kan Chroothece-arter växa inuti grottor eller nästan dyka upp i lätt salthaltiga kalkhaltiga strömmar2.
Monokromatiska ljus påverkar tillväxten och pigmentsammansättningen hos fotosyntetiska organismer och har studerats för att förhindra eller kontrollera tillväxten av fotosyntetiska organismer i grottor. Mulec et al. visade att röd berikad belysning främjar tillväxten av cyanobakterier, alger och växter16. Tidigare studier har också rapporterat att grönt ljus påverkar pigmentsammansättningen av cyanobakterier17, medan andra har visat att grönt ljus förhindrar tillväxten av de flesta fotosyntetiska organismer och vissa cyanobakterier uppvisar en minskning av tylakoider och svagare genomsnittlig fluorescensintensitet18.
För att förstå Chrootheces förmåga som modellorganism att övervinna svåra förhållanden har odlade celler utsatts för ökande ljusintensiteter och monokromatiskt ljus (grönt eller rött)15, för att se hur det klarar de svaga förhållandena i grottor (där rött ljus dominerar). Protokollet som presenteras här återger effekten av de ovan nämnda variablerna på Chrootheces fykobiliproteiner på cellulär nivå med hjälp av sin egen autofluorescens.
Numera används fluorescens ofta som ett verktyg för att studera de fysiologiska svaren hos kärlväxter, mikroalger, makroalger och cyanobakterier13,14,16. Spektral konfokal fluorescensmikroskopi är ett utmärkt verktyg för in vivo-studier för att utvärdera fotosyntetiska provers fysiologi på encellsnivå 10,17,18,19,20, genom att undvika problem i samband med den låga tillväxthastigheten i laboratoriet och svårigheterna med att erhålla tillräckligt med biomassa för tillhörande extraktion och biokemiska metoder8 . När cellerna har behandlats under olika odlingsförhållanden i 2 veckor kan lambdaskanningsprofilen mätas in vivo. Även om det finns flera publikationer där olika våglängder av excitation genom konfokal avbildning har använts 3,4,10,17, kan de flesta fykobiliproteiner och Chl a detekteras med hjälp av en 561 nm våglängds excitationslinje, och den detekterade emissionen sträcker sig från 570 till 760 nm våglängd. Dessa kriterier har baserats på en analys som tidigare utförts 10 med kommersiella rena pigment (tabell 1) genom konfokal avbildning och de erhållna resultaten i olika algarter20,21,22.
| Pigment | λFLmax (Nm) | λ exc (nm) | |||||||
| 351 | 364 | 458 | 476 | 488 | 514 | 543 | 633 | ||
| Chl a | 660.9-678.1 | 43,4 ± 1,8 | 11.2 ± 0.2 | 1.8 ± 0.05 | 2.0 ± 0.08 | 12.2 ± 0.7 | 6.0 ± 0.3 | 4.2 ± 0.16 | 80,7 ± 1,5 |
| R-PE | 569.2-583.3 | 5.9 ± 0.6 | 5.9 ± 0.16 | 11,1 ± 0,04 | 42,2 ± 0,3 | 100.0 ± 0 | 90,0 ± 0,3 | 99,2 ± 0,08 | – |
| 652.1-668.6 | – | – | 1,5 ± 0,01 | 3.7 ± 0.04 | 26.7 ± 0.5 | 8.7 ± 0.16 | 11.1 ± 0.16 | 11,3 ± 0,2 | |
| C-PC | 636.2-676.4 | 2.3 ± 0.04 | 1.0 ± 0.01 | 0,6 ± 0,004 | 0,7 ± 0,008 | 2.0 ± 0.08 | 2.0 ± 0.04 | 3.3 ± 0.16 | 33,6 ± 0,9 |
| APC-XL | 667.3-683.8 | 15.1 ± 1.5 | 9.6 ± 0.98 | 1.0 ± 0.04 | 1.2 ± 0.08 | 5.9 ± 0.7 | 4.1 ± 0.5 | 23.2 ± 3.5 | 91,4 ± 2,3 |
Tabell 1: Den rena pigmentinformation som används för att utföra lambdaskanningsanalysen. Denna tabell visar emissionstoppar och bogar/fluorescensbandsmaxima för olika fluorokromer/pigment med konfokal avbildningsspektrofotometri för alla excitationsvåglängder och procentandelen ljusemission av pigment/fluorokromer. Värdena beräknades med formeln: = MFI * 100/255. Varje värde är medelvärdet ± SE (medelvärde ± standardfel från medelvärdet). Rena pigment användes för kalibrering av det konfokala skanningslasermikroskopet enligt följande: 1,2,10. Klorofyll a erhölls från Spinacia oleracea, R-phycoerythrin (R-PE) från Porphyra tenera och C-phycocyanin (C-PE) från Spirulina sp. Alla arter löstes i filtrerat destillerat vatten. Allophycocyanin-XL (APC-XL) erhölls från Mastigocladus laminosus, som löstes i ammoniumsulfat (60%) och kaliumfosfat (pH = 7) för att uppnå en koncentration av 38 mM. Skanningarna utfördes med 400 μL av varje pigmentlösning (koncentration av 1 mg / ml) med användning av en 8-väl täckt glasbottenkammare.
Studien av en enda excitationsvåglängd är en ganska användbar första approximation. I detta fall är det emellertid nödvändigt att belysa det relativa bidraget från de olika komplexen i fluorescenssignalen, vilket rekommenderas att utföra ett fluorescensförhållande eller spektrumanalys vid flera våglängder, bland andra metoder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vissa encelliga eller koloniala röda alger, såsom Chroothece, växer långsamt in vitro, men innehåller flera autofluorescerande föreningar som kan analyseras genom spektralanalys under ett konfokalmikroskop, där skillnader i pigmentemissionstoppar kan detekteras. Spektral konfokal fluorescensmikroskopi har gjort det möjligt för oss att genomföra in vivo-studier för att utvärdera anpassningen eller acklimatiseringen av fotosyntetiska organismer 8,10,17,18,19,20.</sup…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning genomfördes som en del av projekten TIN2015-68454-R och 20961/PI/18, finansierade av det spanska ministeriet för ekonomi och konkurrenskraft och Séneca-stiftelsen i Murcia-regionen. Irene Hernández Martínez och Francisco Javier Ibáñez López från avdelningen för statistiskt stöd vid det vetenskapliga och forskningsområdet vid Murcia University (Sección de Apoyo Estadístico (SAE), Área Científica y de Investigación (ACTI), Universidad de Murcia, (figur 1 ritades med hjälp av bilder från Servier Medical Art. Servier Medical Art by Servier är licensierat med en Creative Commons Attribution 3.0 Unported-licens (https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/)
Materials
| µ-Dish 35 mm, high Glass Bottom | Ibidi | 81158 | – |
| 24 black well plate | Ibidi | 82406 | flat and clear bottom for high throughput microscopy |
| Algae Incubator | Panasonic | MLR-352-PE | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | SP8 TCS | – |
| Flask | Fisher Scientific | 15380591 | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| green filter | PNTA, LEE filters | – | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| HC PL APO 63X/1.30 GLYC CORR CS2 | Leica Microsystems | 506353 | Glycerol immersion lens |
| Image acquisition software. LAS X | Leica Microsystems | SP8 TCS | – |
| Light source | Panasonic | FL40SSENW/37MLR-352-PE | |
| Quantum photoradiometer | DeltaOhm | DO 9721 | – |
| R software | R Core Team, 2020 | 4.0.2. | – |
| red filter | PNTA, LEE filters | – | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| SWES medium | University of Murcia | – | – |
| Type G Immersion liquid | Leica Microsystems | 11513910 | Glycerol |
Riferimenti
- Vis, M. L., Necchi, O. . Freshwater Red Algae: Phylogeny, Taxonomy and Biogeography. , (2021).
- Aboal, M., et al. Diversity of Chroothece (Rhodophyta, Stylonematales) including two new species. European Journal of Phycology. 53 (2), 189-197 (2018).
- Millach, L., Obiol, A., Solé, A., Esteve, I. A novel method to analyse in vivo the physiological state and cell viability of phototrophic microorganisms by confocal laser scanning microscopy using a dual laser. Journal of Microscopy. 268 (1), 53-65 (2017).
- Millach, L., Villagrasa, E., Solé, A., Esteve, I. Combined confocal laser scanning microscopy techniques for a rapid assessment of the effect and cell viability of Scenedesmus sp. DE2009 under metal stress. Microscopy and Microanalysis. 25 (4), 998-1003 (2019).
- Poryvkina, L., Babichenko, S., Leeben, A. Analysis of phytoplankton pigments by excitation spectra of fluorescence. Proceedings of EARSeL-SIG-Workshop LIDAR. , (2000).
- Beutler, M., et al. A fluorometric method for the differentiation of algal populations in vivo and in situ. Photosynthesis Research. 72 (1), 39-53 (2002).
- Grigoryeva, N., Chistyakova, L. Fluorescence microscopic spectroscopy for investigation and monitoring of biological diversity and physiological state of cyanobacterial cultures. Cyanobacteria. , (2018).
- Grigoryeva, N. . Fluorescence Methods for Investigation of Living Cells and Microorganisms. , (2020).
- Roshchina, V. V. Vital autofluorescence: application to the study of plant living cells. International Journal of Spectroscopy. 2012, 5-18 (2012).
- Roldán, M., Thomas, F., Castel, S., Quesada, A., Hernández-Mariné, M. Noninvasive pigment identification in single cells from living phototrophic biofilms by confocal imaging spectrofluorometry. Applied and Environmental Microbiology. 70 (6), 3745-3750 (2004).
- Hense, B. A., Gais, P., Jütting, U., Scherb, H., Rodenacker, K. Use of fluorescence information for automated phytoplankton investigation by image analysis. Journal of Plankton Research. 30 (5), 587-606 (2008).
- Millie, D. F., Schofield, O. M., Kirkpatrick, G. J., Johnsen, G., Evens, T. J. Using absorbance and fluorescence spectra to discriminate microalgae. European Journal of Phycology. 37 (3), 313-322 (2002).
- Richardson, T. L., et al. Spectral fluorometric characterization of phytoplankton community composition using the Algae Online Analyser. Water Research. 44 (8), 2461-2472 (2010).
- Kieleck, C., Bousquet, B., Le Brun, G., Cariou, J., Lotrian, J. Laser induced fluorescence imaging: application to groups of macroalgae identification. Journal of Physics D: Applied Physics. 34 (16), 2561-2571 (2001).
- Coronado-Parra, T., Roldán, M., Aboal, M. Confocal microscopy in ecophysiological studies of algae: a door to understanding autofluorescence in red algae. Microscopy and Microanalysis. 28 (1), 218-226 (2022).
- Mulec, J., Kosi, G. Lampenflora algae and methods of growth control. Journal of Cave and Karst Studies. 71 (2), 109-115 (2009).
- Nelissen, B., De Baere, R., Wilmotte, A., De Wachter, R. Phylogenetic relationships of nonaxenic filamentous cyanobacterial strains based on 16S rRNA sequence analysis. Journal of Molecular Evolution. 42 (2), 194-200 (1996).
- Roldán, M., Oliva, F., Gónzalez Del Valle, M. A., Saiz-Jimenez, C., Hernández-Mariné, M. Does green light influence the fluorescence properties and structure of phototrophic biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 72 (4), 3026-3031 (2006).
- Topinka, J. A., Bellows, W. K., Yentsch, C. S. Characterization of marine macroalgae by fluorescence signatures. International Journal of Remote Sensing. 11 (12), 2329-2335 (1990).
- Roldán, M., Ascaso, C., Wierzchos, J. Fluorescent fingerprints of endolithic phototrophic cyanobacteria living within halite rocks in the atacama desert. Applied and Environmental Microbiology. 80 (10), 2998-3006 (2014).
- Solé, A., Diestra, E., Esteve, I. Confocal laser scanning microscopy image analysis for cyanobacterial biomass determined at microscale level in different microbial mats. Microbial Ecology. 57 (4), 649-656 (2009).
- Ramírez, O., García, A., Rojas, R., Couve, A., Härtel, S. Confined displacement algorithm determines true and random colocalization in fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 239 (3), 173-183 (2010).
- Universität Gottingen-Georg-August. SAG Culture Collection of Algae. Universität Gottingen-Georg-August. , (2022).
- Zhang, M., et al. Improvement of cell counting method for Neubauer counting chamber. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 34 (1), 23024 (2020).
- Wolf, E., Schüßler, A. Phycobiliprotein fluorescence of Nostoc punctiforme changes during the life cycle and chromatic adaptation: Characterization by spectral confocal laser scanning microscopy and spectral unmixing. Plant, Cell and Environment. 28 (4), 480-491 (2005).
- Zucker, R. M., Rigby, P., Clements, I., Salmon, W., Chua, M. Reliability of confocal microscopy spectral imaging systems: Use of multispectral beads. Cytometry Part A. 71 (3), 174-189 (2007).
- Field, A. M. . Discovering Statistics Using R. , (2013).
- Linnet, K. Limitations of the paired t-test for evaluation of method comparison data. Clinical Chemistry. 45 (2), 314-315 (1999).
- Rosner, B., Grove, D. Use of the Mann-Whitney U-test for clustered data. Statistics in Medicine. 18 (11), 1387-1400 (1999).
- Colin, L., et al. Imaging the living plant cell: from probes to quantification. The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).
- Borlinghaus, R. The white confical: continuous spectral tuning in excitation and emission. Optical Fluorescence Microscopy. , (2011).
