Kırmızı Alg Fizyolojisini Değerlendirmek için Otofloresan Görüntüleme
Summary
Bu protokol, spektral analize dayalı olarak kırmızı alglerdeki fikobiliprotein değişikliklerinin adım adım otofloresan görüntülemesini ve değerlendirilmesini açıklamaktadır. Bu, yalnızca kıt materyalin mevcut olduğu ve hücrelerin laboratuvar koşullarında yavaş büyüdüğü veya hiç büyümediği aşırı habitatlara hücresel adaptasyonu değerlendirmek için etiketsiz ve tahribatsız bir yöntemdir.
Abstract
Kırmızı algler (Rhodophyta) fikobiliproteinler içerir ve habitatları loş ışıkla kolonileştirir, ancak bazıları (örneğin, bazı Chroothece türleri) tam güneş ışığında da gelişebilir. Çoğu rodofit kırmızıdır, ancak bazıları mavi ve kırmızı biliproteinlerin (fikosiyanin ve fikoeritrin) oranına bağlı olarak mavimsi görünebilir. Farklı fikobiliproteinler ışığı farklı dalga boylarında yakalayabilir ve çok farklı ışık koşulları altında fotosentezi mümkün kılan klorofil a’ya iletebilir. Bu pigmentler ışıktaki habitat değişikliklerine cevap verir ve otofloresanları biyolojik süreçleri incelemeye yardımcı olabilir. Chroothece mobilis’i model bir organizma olarak ve spektral lambda tarama modunu konfokal mikroskopta kullanarak, fotosentetik pigmentlerin farklı monokromatik ışıklara adaptasyonu, türlerin optimal büyüme koşullarını tahmin etmek için hücresel düzeyde incelenmiştir. Sonuçlar, incelenen suşun bir mağaradan izole edildiğinde bile, hem loş hem de orta ışık yoğunluklarına adapte olduğunu göstermiştir. Sunulan yöntem, laboratuvar koşullarında çok yavaş büyümeyen veya büyümeyen fotosentetik organizmaları incelemek için özellikle yararlıdır, bu genellikle aşırı habitatlarda yaşayanlar için geçerlidir.
Introduction
Chroothece cinsi gibi kırmızı algler, sıklıkla belirgin çevresel değişikliklerle başa çıkmak zorunda kaldıkları aşırı habitatlarda büyüyebilir1. Bu cinsin bulunabileceği yarı kurak bölgelerde sel ve kuraklıklar sık görülür ve bazı türler derelerde, uçurumlarda, mağaralarda ve hatta termal sularda bildirilmiştir2. Bununla birlikte, çoğu zaman, rekabet veya otlatma gibi biyolojik değişkenler, türleri büyümeleri için optimal olmayan koşullara yönlendirir. Bu organizmaların kültürlenmesi genellikle zor olduğundan ve laboratuvar koşullarında çok yavaş büyümediğinden veya çok yavaş büyüdüğünden, önemli bir sınırlama mevcut örneklem büyüklüğüdür. Bu nedenle, tahribatsız yöntemlerin veya minimum numune manipülasyonu içeren yöntemlerin izlenmesi çok önemlidir 3,4.
Bu zorlu ortamlarda hayatta kalmak için gereken fizyolojik beceriler, fotosentetik sistemlerindeki değişiklikleri takip ederek izlenebilir. Metabolik mekanizmalar, fotosentetik verimlilik ve ışığa veya kültür koşullarına duyarlılık, enerji transferlerindeki veya yakalamalarındaki doğru değişiklikler nedeniyle pigment floresan emisyon profilleri tarafından ortaya çıkarılabilir 5,6,7,8.
Hücresel bileşiklerin otofloresansı, sitodiagnostik için bir belirteç olarak veya emisyon9’daki değişiklikler yoluyla dış ve iç sinyallere yanıt olarak hücresel durumun veya metabolizmanın doğal bir göstergesi olarak kullanılabilir. Ayrıca taksonomik olarak farklı fotosentetik organizma gruplarını ayırt etmek için de kullanılabilir10. Fototrofik mikroorganizmaların filogenetik konumuna bağlı olarak, farklı in vivo floresan özellikleri bulunabilir. Bu nedenle, fototrofik floresanın in vivo özelliklerine (floresan absorpsiyonu ve emisyon spektrumları dahil) dayanan bir taksonomik tanımlama birkaç kez denenmiştir11,12. Fitoplankton taksonları arasındaki aksesuar pigmentlerindeki çeşitlilik nedeniyle, klorofil a (Chl a) floresansının uyarıldığı dalga boylarındaki farklılıklar veya emisyon spektrumlarındaki farklılıklar, taksonomi13’ü çıkarmak için kullanılabilir. Bu örneklerin in vivo floresan uyarımı ve emisyon spektrumları sadece alglerin filumuna değil, aynı zamanda fotosistem adaptasyonuna da bağlıdır14. Chl a’ya enerji transferinin etkinliği veya Chl a’nın aksesuar pigmentlere oranı ve hücresel pigment içeriği büyüme koşullarına duyarlıdır5.
Kırmızı algler, özellikle Chroothece, birkaç aksesuar floresan pigmente-fikobiliproteinler ve karotenoidlere sahiptir; kloroplastların tilakoidlerine bağlı fikobilizomlardaki eski konsantre. Fikobiliproteinler (fikosiyanin, fikoeritrin ve allofikoksiyanin) farklı dalga boylarında ışığı yakalayabilir ve Chl a’ya iletebilir, bu da çok farklı ışık ve kültür koşullarında fotosentezi mümkün kılar15. Örneğin, Chroothece türleri mağaraların içinde büyüyebilir veya hafif tuzlu kalkerli akarsularda neredeyse ortaya çıkabilir2.
Monokromatik ışıklar, fotosentetik organizmaların büyümesini ve pigment bileşimini etkiler ve mağaralarda fotosentetik organizmaların büyümesini önlemek veya kontrol etmek için çalışılmıştır. Mulec ve ark. kırmızı zenginleştirilmiş aydınlatmanın siyanobakterilerin, alglerin ve bitkilerin büyümesini desteklediğini göstermiştir16. Önceki çalışmalar ayrıca yeşil ışığın siyanobakterilerin pigment bileşimini etkilediğini bildirmiştir17, diğerleri ise yeşil ışığın çoğu fotosentetik organizmanın büyümesini önlediğini ve bazı siyanobakterilerin tilakoidlerde bir azalma gösterdiğini ve daha zayıf ortalama floresan yoğunluğu18 sergilediğini ortaya koymuştur.
Chroothece’nin zorlu koşulların üstesinden gelmek için model bir organizma olarak yeteneğini anlamak için, kültürlenmiş hücreler, mağaraların loş koşullarıyla (kırmızı ışığın baskın olduğu yerlerde) nasıl başa çıktığını görmek için artan ışık yoğunluklarına ve tek renkli ışığa (yeşil veya kırmızı)15 maruz kalmıştır. Burada sunulan protokol, yukarıda belirtilen değişkenlerin Chroothece’nin fikobiliproteinleri üzerindeki etkisini, kendi otofloresansını kullanarak hücresel düzeyde yeniden üretir.
Günümüzde, floresan yaygın olarak vasküler bitkilerin, mikroalglerin, makroalglerin ve siyanobakterilerin fizyolojik tepkilerini incelemek için bir araç olarak kullanılmaktadır13,14,16. Spektral konfokal floresan mikroskopi, fotosentetik örneklerin fizyolojisini tek hücre seviyesinde 10,17,18,19,20 olarak değerlendirmek için in vivo çalışmalar için, laboratuvardaki düşük büyüme hızıyla ilişkili sorunlardan ve ilgili ekstraksiyon ve biyokimyasal yöntemler için yeterli biyokütle elde etmedeki zorluklardan kaçınarak mükemmel bir araçtır8 . Hücreler 2 hafta boyunca farklı kültür koşulları altında tedavi edildikten sonra, lambda tarama profili in vivo olarak ölçülebilir. Konfokal görüntüleme ile farklı dalga boylarında uyarılmanın kullanıldığı birkaç yayın olmasına rağmen,çoğu fikobiliprotein ve Chl a, 561 nm dalga boyu uyarma çizgisi kullanılarak tespit edilebilir ve tespit edilen emisyon 570 ila 760 nm dalga boyu arasında değişir. Bu kriterler daha önce 10 ticari saf pigment ile konfokal görüntüleme ile yapılan bir analize (Tablo 1) ve farklı alg türlerinde elde edilen sonuçlara dayanmaktadır20,21,22.
| Pigmentler | λflmax (nm) | λ exc (nm) | |||||||
| 351 | 364 | 458 | 476 | 488 | 514 | 543 | 633 | ||
| Chl a | 660.9-678.1 | 43,4 ± 1,8 | 11.2 ± 0.2 | 1.8 ± 0.05 | 2.0 ± 0.08 | 12.2 ± 0.7 | 6.0 ± 0.3 | 4.2 ± 0.16 | 80,7 ± 1,5 |
| R-PE | 569.2-583.3 | 5.9 ± 0.6 | 5.9 ± 0.16 | 11.1 ± 0.04 | 42.2 ± 0.3 | 100,0 ± 0 | 90.0 ± 0.3 | 99.2 ± 0.08 | – |
| 652.1-668.6 | – | – | 1.5 ± 0.01 | 3.7 ± 0.04 | 26.7 ± 0.5 | 8.7 ± 0.16 | 11.1 ± 0.16 | 11.3 ± 0.2 | |
| C-PC | 636.2-676.4 | 2.3 ± 0.04 | 1.0 ± 0.01 | 0.6 ± 0.004 | 0.7 ± 0.008 | 2.0 ± 0.08 | 2.0 ± 0.04 | 3.3 ± 0.16 | 33.6 ± 0.9 |
| APC-XL | 667.3-683.8 | 15,1 ± 1,5 | 9.6 ± 0.98 | 1.0 ± 0.04 | 1.2 ± 0.08 | 5.9 ± 0.7 | 4.1 ± 0.5 | 23,2 ± 3,5 | 91,4 ± 2,3 |
Tablo 1: Lambda tarama analizini yürütmek için kullanılan saf pigment bilgileri. Bu tabloda, tüm uyarma dalga boyları için konfokal görüntüleme spektrofotometrisi ile farklı florokromların/pigmentlerin emisyon zirveleri ve omuz/floresan bant maksimumları ve pigmentler/florokromlar tarafından ışık emisyonunun yüzdesi gösterilmektedir. Değerler şu formülle hesaplanmıştır: = MFI*100/255. Her değer, SE’± ortalamasıdır (ortalamadan standart hata ±). Konfokal taramalı lazer mikroskobun kalibrasyonu için saf pigmentler aşağıdaki gibi kullanıldı 1,2,10. Klorofil a, Spinacia oleracea’dan, R-phycoerythrin (R-PE) Porphyra tenera’dan ve C-phycocyanin (C-PE) Spirulina sp’den elde edildi. Tüm türler filtrelenmiş damıtılmış suda çözüldü. Allophycocyanin-XL (APC-XL), 38 mM’lik bir konsantrasyon elde etmek için amonyum sülfat (% 60) ve potasyum fosfat (pH = 7) içinde çözünen Mastigocladus laminosus’tan elde edildi. Taramalar, her pigment çözeltisinin 400 μL’si (1 mg / mL konsantrasyonu) ile 8 iyi kaplanmış cam alt oda kullanılarak gerçekleştirildi.
Tek bir uyarma dalga boyunun incelenmesi oldukça yararlı bir ilk yaklaşımdır. Bununla birlikte, bu durumda, diğer yöntemlerin yanı sıra, birkaç dalga boyunda bir floresan oranı veya spektrum analizi yapılması önerilen floresan sinyalindeki farklı komplekslerin göreceli katkısını aydınlatmak gerekir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Chroothece gibi bazı tek hücreli veya kolonyal kırmızı algler in vitro olarak yavaş büyür, ancak pigment emisyon zirvelerindeki farklılıkların tespit edilebildiği konfokal mikroskop altında spektral analiz ile analiz edilebilen çoklu otofloresan bileşikler içerir. Spektral konfokal floresan mikroskopisi, fotosentetik organizmaların adaptasyonunu veya iklimlendirilmesini değerlendirmek için in vivo çalışmalar yapmamızı sağlamıştır 8,10,17,18,19,20.</…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma, İspanya Ekonomi ve Rekabet Edebilirlik Bakanlığı ve Murcia Bölgesi Séneca Vakfı tarafından finanse edilen TIN2015-68454-R ve 20961/PI/18 Projelerinin bir parçası olarak gerçekleştirilmiştir. Murcia Üniversitesi Bilimsel ve Araştırma Alanı İstatistiksel Destek Bölümü’nden Irene Hernández Martínez ve Francisco Javier Ibáñez López (Sección de Apoyo Estadístico (SAE), Área Científica y de Investigación (ACTI), Universidad de Murcia, (Şekil 1 , Servier Medical Art’tan resimler kullanılarak çizilmiştir. Servier Medical Art by Servier, Creative Commons Atıf 3.0 Taşınmamış Lisansı (https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/) ile lisanslanmıştır.
Materials
| µ-Dish 35 mm, high Glass Bottom | Ibidi | 81158 | – |
| 24 black well plate | Ibidi | 82406 | flat and clear bottom for high throughput microscopy |
| Algae Incubator | Panasonic | MLR-352-PE | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | SP8 TCS | – |
| Flask | Fisher Scientific | 15380591 | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| green filter | PNTA, LEE filters | – | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| HC PL APO 63X/1.30 GLYC CORR CS2 | Leica Microsystems | 506353 | Glycerol immersion lens |
| Image acquisition software. LAS X | Leica Microsystems | SP8 TCS | – |
| Light source | Panasonic | FL40SSENW/37MLR-352-PE | |
| Quantum photoradiometer | DeltaOhm | DO 9721 | – |
| R software | R Core Team, 2020 | 4.0.2. | – |
| red filter | PNTA, LEE filters | – | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| SWES medium | University of Murcia | – | – |
| Type G Immersion liquid | Leica Microsystems | 11513910 | Glycerol |
Riferimenti
- Vis, M. L., Necchi, O. . Freshwater Red Algae: Phylogeny, Taxonomy and Biogeography. , (2021).
- Aboal, M., et al. Diversity of Chroothece (Rhodophyta, Stylonematales) including two new species. European Journal of Phycology. 53 (2), 189-197 (2018).
- Millach, L., Obiol, A., Solé, A., Esteve, I. A novel method to analyse in vivo the physiological state and cell viability of phototrophic microorganisms by confocal laser scanning microscopy using a dual laser. Journal of Microscopy. 268 (1), 53-65 (2017).
- Millach, L., Villagrasa, E., Solé, A., Esteve, I. Combined confocal laser scanning microscopy techniques for a rapid assessment of the effect and cell viability of Scenedesmus sp. DE2009 under metal stress. Microscopy and Microanalysis. 25 (4), 998-1003 (2019).
- Poryvkina, L., Babichenko, S., Leeben, A. Analysis of phytoplankton pigments by excitation spectra of fluorescence. Proceedings of EARSeL-SIG-Workshop LIDAR. , (2000).
- Beutler, M., et al. A fluorometric method for the differentiation of algal populations in vivo and in situ. Photosynthesis Research. 72 (1), 39-53 (2002).
- Grigoryeva, N., Chistyakova, L. Fluorescence microscopic spectroscopy for investigation and monitoring of biological diversity and physiological state of cyanobacterial cultures. Cyanobacteria. , (2018).
- Grigoryeva, N. . Fluorescence Methods for Investigation of Living Cells and Microorganisms. , (2020).
- Roshchina, V. V. Vital autofluorescence: application to the study of plant living cells. International Journal of Spectroscopy. 2012, 5-18 (2012).
- Roldán, M., Thomas, F., Castel, S., Quesada, A., Hernández-Mariné, M. Noninvasive pigment identification in single cells from living phototrophic biofilms by confocal imaging spectrofluorometry. Applied and Environmental Microbiology. 70 (6), 3745-3750 (2004).
- Hense, B. A., Gais, P., Jütting, U., Scherb, H., Rodenacker, K. Use of fluorescence information for automated phytoplankton investigation by image analysis. Journal of Plankton Research. 30 (5), 587-606 (2008).
- Millie, D. F., Schofield, O. M., Kirkpatrick, G. J., Johnsen, G., Evens, T. J. Using absorbance and fluorescence spectra to discriminate microalgae. European Journal of Phycology. 37 (3), 313-322 (2002).
- Richardson, T. L., et al. Spectral fluorometric characterization of phytoplankton community composition using the Algae Online Analyser. Water Research. 44 (8), 2461-2472 (2010).
- Kieleck, C., Bousquet, B., Le Brun, G., Cariou, J., Lotrian, J. Laser induced fluorescence imaging: application to groups of macroalgae identification. Journal of Physics D: Applied Physics. 34 (16), 2561-2571 (2001).
- Coronado-Parra, T., Roldán, M., Aboal, M. Confocal microscopy in ecophysiological studies of algae: a door to understanding autofluorescence in red algae. Microscopy and Microanalysis. 28 (1), 218-226 (2022).
- Mulec, J., Kosi, G. Lampenflora algae and methods of growth control. Journal of Cave and Karst Studies. 71 (2), 109-115 (2009).
- Nelissen, B., De Baere, R., Wilmotte, A., De Wachter, R. Phylogenetic relationships of nonaxenic filamentous cyanobacterial strains based on 16S rRNA sequence analysis. Journal of Molecular Evolution. 42 (2), 194-200 (1996).
- Roldán, M., Oliva, F., Gónzalez Del Valle, M. A., Saiz-Jimenez, C., Hernández-Mariné, M. Does green light influence the fluorescence properties and structure of phototrophic biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 72 (4), 3026-3031 (2006).
- Topinka, J. A., Bellows, W. K., Yentsch, C. S. Characterization of marine macroalgae by fluorescence signatures. International Journal of Remote Sensing. 11 (12), 2329-2335 (1990).
- Roldán, M., Ascaso, C., Wierzchos, J. Fluorescent fingerprints of endolithic phototrophic cyanobacteria living within halite rocks in the atacama desert. Applied and Environmental Microbiology. 80 (10), 2998-3006 (2014).
- Solé, A., Diestra, E., Esteve, I. Confocal laser scanning microscopy image analysis for cyanobacterial biomass determined at microscale level in different microbial mats. Microbial Ecology. 57 (4), 649-656 (2009).
- Ramírez, O., García, A., Rojas, R., Couve, A., Härtel, S. Confined displacement algorithm determines true and random colocalization in fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 239 (3), 173-183 (2010).
- Universität Gottingen-Georg-August. SAG Culture Collection of Algae. Universität Gottingen-Georg-August. , (2022).
- Zhang, M., et al. Improvement of cell counting method for Neubauer counting chamber. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 34 (1), 23024 (2020).
- Wolf, E., Schüßler, A. Phycobiliprotein fluorescence of Nostoc punctiforme changes during the life cycle and chromatic adaptation: Characterization by spectral confocal laser scanning microscopy and spectral unmixing. Plant, Cell and Environment. 28 (4), 480-491 (2005).
- Zucker, R. M., Rigby, P., Clements, I., Salmon, W., Chua, M. Reliability of confocal microscopy spectral imaging systems: Use of multispectral beads. Cytometry Part A. 71 (3), 174-189 (2007).
- Field, A. M. . Discovering Statistics Using R. , (2013).
- Linnet, K. Limitations of the paired t-test for evaluation of method comparison data. Clinical Chemistry. 45 (2), 314-315 (1999).
- Rosner, B., Grove, D. Use of the Mann-Whitney U-test for clustered data. Statistics in Medicine. 18 (11), 1387-1400 (1999).
- Colin, L., et al. Imaging the living plant cell: from probes to quantification. The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).
- Borlinghaus, R. The white confical: continuous spectral tuning in excitation and emission. Optical Fluorescence Microscopy. , (2011).
