Autofluorescensavbildning for å evaluere rødalgefysiologi

Summary

Denne protokollen beskriver trinnvis autofluorescensavbildning og evaluering av fykobiliproteinendringer i rødalger basert på spektralanalyse. Dette er en etikettfri og ikke-destruktiv metode for å evaluere cellulær tilpasning til ekstreme habitater, når bare knappe materialer er tilgjengelige og celler vokser sakte, eller ikke i det hele tatt, under laboratorieforhold.

Abstract

Røde alger (Rhodophyta) inneholder phycobiliproteins og koloniserer habitater med svakt lys, men noen (f.eks. Noen Chroothece-arter ) kan også utvikle seg i fullt solskinn. De fleste rhodofytter er røde, men noen kan virke blåaktige, avhengig av andelen blå og røde biliproteiner (phycocyanin og phycoerythrin). Ulike phycobiliproteiner kan fange lys ved forskjellige bølgelengder og overføre det til klorofyll a, noe som gjør fotosyntese under svært forskjellige lysforhold mulig. Disse pigmentene reagerer på habitatendringer i lys, og deres autofluorescens kan bidra til å studere biologiske prosesser. Ved å bruke Chroothece mobilis som modellorganisme og spektral lambda-skanningsmodus i et konfokalmikroskop, ble tilpasningen av fotosyntetiske pigmenter til forskjellige monokromatiske lys studert på mobilnivå for å gjette artens optimale vekstforhold. Resultatene viste at selv når den studerte stammen ble isolert fra en hule, tilpasset den seg både svake og middels lysintensiteter. Den presenterte metoden er spesielt nyttig for å studere fotosyntetiske organismer som ikke vokser eller vokser veldig sakte under laboratorieforhold, noe som vanligvis er tilfelle for de som bor i ekstreme habitater.

Introduction

Rødalger, som slekten Chroothece, kan vokse i ekstreme habitater, hvor de ofte må takle markerte miljøendringer¹. Flom og tørke er hyppige i halvtørre områder der denne slekten kan bli funnet, og noen arter har blitt rapportert i bekker, klipper, grotter eller til og med termisk vann². Men mesteparten av tiden, biologiske variabler, som konkurranse eller beite, henviser arter til ikke-optimale forhold for deres vekst. Siden disse organismene ofte er vanskelige å dyrke og enten ikke vokser eller vokser veldig sakte under laboratorieforhold, er en stor begrensning den tilgjengelige prøvestørrelsen. Derfor er det svært viktig å følge ikke-destruktive metoder eller metoder som involverer minimal prøvemanipulasjon ^3,4.

De fysiologiske ferdighetene som trengs for å overleve i disse tøffe miljøene, kan overvåkes ved å følge endringer i deres fotosyntetiske systemer. Metabolske mekanismer, fotosyntetisk effektivitet og følsomhet for lys- eller kulturforhold kan avsløres av pigmentfluorescensutslippsprofiler på grunn av nøyaktige endringer i energioverføring eller fangst 5,6,7,8.

Autofluorescens av cellulære forbindelser kan brukes som markør for cytodiagnose eller som en naturlig indikator på cellulær tilstand eller metabolisme som respons på eksterne og interne signaler gjennom endringer i utslipp⁹. Det kan også brukes til å diskriminere taksonomisk forskjellige grupper av fotosyntetiske organismer¹⁰. Avhengig av den fylogenetiske posisjonen til fototrofe mikroorganismer, kan man finne forskjellige in vivo fluorescensfunksjoner. Derfor har en taksonomisk identifikasjon basert på in vivo-egenskapene til fototrofisk fluorescens (inkludert fluorescensabsorpsjon og emisjonsspektra) blitt forsøkt ved flere anledninger^11,12. På grunn av mangfoldet i tilbehørspigmenter blant fytoplankton taxa, kan forskjeller i bølgelengdene der klorofyll a (Chl a) fluorescens stimuleres, eller forskjeller i utslippsspektra, brukes til å utlede taksonomi¹³. In vivo fluorescenseksitasjon og utslippsspektra av disse prøvene er ikke bare avhengig av algerens fyla, men også på fotosystemtilpasning¹⁴. Effektiviteten av energioverføring til Chl a, eller forholdet mellom Chl a og tilbehørspigmenter, og det cellulære pigmentinnholdet er følsomt for vekstforhold⁵.

Røde alger, spesielt Chroothece, har flere tilbehør fluorescerende pigmenter-phycobiliproteins og karotenoider; Det tidligere konsentratet i fykobilisomer festet til thylakoider av kloroplaster. Phycobiliproteins (phycocyanin, phycoerythrin, og allophycocyanin) kan fange lys ved forskjellige bølgelengder og overføre det til Chl a, noe som gjør fotosyntese i svært forskjellige lys- og kulturforhold mulig¹⁵. For eksempel kan Chroothece-arter vokse inne i huler eller nesten dukke opp i litt saltholdige kalkholdige bekker².

Monokromatiske lys påvirker veksten og pigmentsammensetningen av fotosyntetiske organismer, og har blitt studert for å forhindre eller kontrollere veksten av fotosyntetiske organismer i huler. Mulec et al. viste at rød beriket belysning fremmer veksten av cyanobakterier, alger og planter¹⁶. Tidligere studier har også rapportert at grønt lys påvirker pigmentsammensetningen av cyanobakterier¹⁷, mens andre har avslørt at grønt lys forhindrer veksten av de fleste fotosyntetiske organismer, og noen cyanobakterier viser en reduksjon i thylakoider og svakere gjennomsnittlig fluorescensintensitet¹⁸.

For å forstå Chrootheces evne som modellorganisme til å overvinne tøffe forhold, har dyrkede celler blitt utsatt for økende lysintensitet og monokromatisk lys (grønt eller rødt)¹⁵, for å se hvordan det takler de svake forholdene i huler (hvor rødt lys dominerer). Protokollen som presenteres her, reproduserer effekten av de ovennevnte variablene på Chrootheces fykobiliproteiner på cellenivå ved bruk av sin egen autofluorescens.

I dag brukes fluorescens ofte som et verktøy for å studere de fysiologiske responsene til karplanter, mikroalger, makroalger og cyanobakterier^13,14,16. Spektral konfokal fluorescensmikroskopi er et ypperlig verktøy for in vivo-studier for å evaluere fotosyntetiske prøvers fysiologi på enkeltcellenivå 10,17,18,19,20^, ved å unngå problemer forbundet med den lave veksthastigheten i laboratoriet og vanskelighetene med å skaffe nok biomasse til tilhørende ekstraksjon og biokjemiske metoder⁸ . Når cellene er behandlet under forskjellige dyrkningsbetingelser i 2 uker, kan lambda-skanningsprofilen måles in vivo. Selv om det er flere publikasjoner der forskjellige bølgelengder av eksitasjon ved konfokal avbildning har blitt brukt 3,4,10,17, kan de fleste fykobiliproteiner og Chl a detekteres ved hjelp av en 561 nm bølgelengde eksitasjonslinje^, og den oppdagede utslippet varierer fra 570 til ⁷⁶⁰ nm bølgelengde. Disse kriteriene er basert på en analyse tidligere utført 10 med kommersielle rene pigmenter (tabell 1) ved konfokal avbildning og de oppnådde resultatene i forskjellige algearter^20,21,22.

Pigmenter	λflmax (nm)	λ exc (nm)
		351	364	458	476	488	514	543	633
Chl en	660.9-678.1	43,4 ± 1,8	11,2 ± 0,2	1,8 ± 0,05	2,0 ± 0,08	12,2 ± 0,7	6,0 ± 0,3	4,2 ± 0,16	80,7 ± 1,5
R-PE	569.2-583.3	5,9 ± 0,6	5,9 ± 0,16	11,1 ± 0,04	42,2 ± 0,3	100,0 ± 0	90,0 ± 0,3	99,2 ± 0,08	–
	652.1-668.6	–	–	1,5 ± 0,01	3,7 ± 0,04	26,7 ± 0,5	8,7 ± 0,16	11,1 ± 0,16	11,3 ± 0,2
C-PC	636.2-676.4	2,3 ± 0,04	1,0 ± 0,01	0,6 ± 0,004	0,7 ± 0,008	2,0 ± 0,08	2,0 ± 0,04	3,3 ± 0,16	33,6 ± 0,9
APC-XL	667.3-683.8	15.1 ± 1.5	9,6 ± 0,98	1,0 ± 0,04	1,2 ± 0,08	5,9 ± 0,7	4,1 ± 0,5	23,2 ± 3,5	91,4 ± 2,3

Tabell 1: Den rene pigmentinformasjonen som ble brukt til å kjøre lambda-skanningsanalysen. Denne tabellen viser utslippstopper og skuldre/fluorescensbåndmaksima for forskjellige fluorokromer/pigmenter ved konfokal avbildningsspektrofotometri for alle eksitasjonsbølgelengder, og prosentandelen lysutslipp fra pigmenter/fluorokrom. Verdiene ble beregnet med formelen: = MFI*100/255. Hver verdi er gjennomsnittet ± SE (gjennomsnitt ± standardfeil fra gjennomsnittet). Rene pigmenter ble brukt til kalibrering av konfokalskanningslasermikroskopet som følger: ^1,2,10. Klorofyll a ble hentet fra Spinacia oleracea, R-phycoerythrin (R-PE) fra Porphyra tenera, og C-phycocyanin (C-PE) fra Spirulina sp. Alle artene ble oppløst i filtrert destillert vann. Allophycocyanin-XL (APC-XL) ble oppnådd fra Mastigocladus laminosus, som ble oppløst i ammoniumsulfat (60%) og kaliumfosfat (pH = 7) for å oppnå en konsentrasjon på 38 mM. Skanningene ble utført med 400 μL av hver pigmentløsning (konsentrasjon på 1 mg/ml) ved bruk av et bunnkammer med 8 brønner i glass.

Studien av en enkelt eksitasjonsbølgelengde er ganske nyttig første tilnærming. I dette tilfellet er det imidlertid nødvendig å belyse det relative bidraget til de forskjellige kompleksene i fluorescenssignalet, som anbefales å utføre et fluorescensforhold eller spektrumanalyse ved flere bølgelengder, blant andre metoder.

Protocol

Algearten Chroothece mobilis ble brukt i denne studien. Arten ble hentet fra kultursamlingen Microalgae Edaphic SE Spain, MAESE 20.29. En oversikt over protokollen er vist i figur 1. Figur 1: Oversikt over studien. Chroothece mobilis inkuberes under ekstreme habitatforhold, …

Representative Results

Klorofyll a absorberer generelt blå og røde bølgelengder av synlig lys, mens phycobiliproteiner bruker grønne, gule og oransje bølgelengder7. Autofluorescensen av disse pigmentene gjør den første tilnærmingen til å studere fykobiliproteiner og klorofylladferd under eksperimentelle og feltforhold mulig. Ved å sammenligne de oppnådde dataene og plotte på forskjellige grafer, kan man skille mellom signifikante endringer i gjennomsnittlig fluorescensintensitet (…

Discussion

Noen encellede eller koloniale røde alger, som Chroothece, vokser sakte in vitro, men inneholder flere autofluorescerende forbindelser som kan analyseres ved spektralanalyse under et konfokalmikroskop, hvor forskjeller i pigmentutslippstopper kan oppdages. Spektral konfokal fluorescensmikroskopi har gitt oss mulighet til å gjennomføre in vivo-studier for å evaluere tilpasning eller akklimatisering av fotosyntetiske organismer 8,10,17,18,19,20.<sup class="x…

Materials

µ-Dish 35 mm, high Glass Bottom	Ibidi	81158	–
24 black well plate	Ibidi	82406	flat and clear bottom for high throughput microscopy
Algae Incubator	Panasonic	MLR-352-PE
Confocal laser scanning microscope	Leica Microsystems	SP8 TCS	–
Flask	Fisher Scientific	15380591	Can be purchased in a local convenience store or online stores.
green filter	PNTA, LEE filters	–	Can be purchased in a local convenience store or online stores.
HC PL APO 63X/1.30 GLYC CORR CS2	Leica Microsystems	506353	Glycerol immersion lens
Image acquisition software. LAS X	Leica Microsystems	SP8 TCS	–
Light source	Panasonic	FL40SSENW/37MLR-352-PE
Quantum photoradiometer	DeltaOhm	DO 9721	–
R software	R Core Team, 2020	4.0.2.	–
red filter	PNTA, LEE filters	–	Can be purchased in a local convenience store or online stores.
SWES medium	University of Murcia	–	–
Type G Immersion liquid	Leica Microsystems	11513910	Glycerol