Denne protokollen beskriver trinnvis autofluorescensavbildning og evaluering av fykobiliproteinendringer i rødalger basert på spektralanalyse. Dette er en etikettfri og ikke-destruktiv metode for å evaluere cellulær tilpasning til ekstreme habitater, når bare knappe materialer er tilgjengelige og celler vokser sakte, eller ikke i det hele tatt, under laboratorieforhold.
Røde alger (Rhodophyta) inneholder phycobiliproteins og koloniserer habitater med svakt lys, men noen (f.eks. Noen Chroothece-arter ) kan også utvikle seg i fullt solskinn. De fleste rhodofytter er røde, men noen kan virke blåaktige, avhengig av andelen blå og røde biliproteiner (phycocyanin og phycoerythrin). Ulike phycobiliproteiner kan fange lys ved forskjellige bølgelengder og overføre det til klorofyll a, noe som gjør fotosyntese under svært forskjellige lysforhold mulig. Disse pigmentene reagerer på habitatendringer i lys, og deres autofluorescens kan bidra til å studere biologiske prosesser. Ved å bruke Chroothece mobilis som modellorganisme og spektral lambda-skanningsmodus i et konfokalmikroskop, ble tilpasningen av fotosyntetiske pigmenter til forskjellige monokromatiske lys studert på mobilnivå for å gjette artens optimale vekstforhold. Resultatene viste at selv når den studerte stammen ble isolert fra en hule, tilpasset den seg både svake og middels lysintensiteter. Den presenterte metoden er spesielt nyttig for å studere fotosyntetiske organismer som ikke vokser eller vokser veldig sakte under laboratorieforhold, noe som vanligvis er tilfelle for de som bor i ekstreme habitater.
Rødalger, som slekten Chroothece, kan vokse i ekstreme habitater, hvor de ofte må takle markerte miljøendringer1. Flom og tørke er hyppige i halvtørre områder der denne slekten kan bli funnet, og noen arter har blitt rapportert i bekker, klipper, grotter eller til og med termisk vann2. Men mesteparten av tiden, biologiske variabler, som konkurranse eller beite, henviser arter til ikke-optimale forhold for deres vekst. Siden disse organismene ofte er vanskelige å dyrke og enten ikke vokser eller vokser veldig sakte under laboratorieforhold, er en stor begrensning den tilgjengelige prøvestørrelsen. Derfor er det svært viktig å følge ikke-destruktive metoder eller metoder som involverer minimal prøvemanipulasjon 3,4.
De fysiologiske ferdighetene som trengs for å overleve i disse tøffe miljøene, kan overvåkes ved å følge endringer i deres fotosyntetiske systemer. Metabolske mekanismer, fotosyntetisk effektivitet og følsomhet for lys- eller kulturforhold kan avsløres av pigmentfluorescensutslippsprofiler på grunn av nøyaktige endringer i energioverføring eller fangst 5,6,7,8.
Autofluorescens av cellulære forbindelser kan brukes som markør for cytodiagnose eller som en naturlig indikator på cellulær tilstand eller metabolisme som respons på eksterne og interne signaler gjennom endringer i utslipp9. Det kan også brukes til å diskriminere taksonomisk forskjellige grupper av fotosyntetiske organismer10. Avhengig av den fylogenetiske posisjonen til fototrofe mikroorganismer, kan man finne forskjellige in vivo fluorescensfunksjoner. Derfor har en taksonomisk identifikasjon basert på in vivo-egenskapene til fototrofisk fluorescens (inkludert fluorescensabsorpsjon og emisjonsspektra) blitt forsøkt ved flere anledninger11,12. På grunn av mangfoldet i tilbehørspigmenter blant fytoplankton taxa, kan forskjeller i bølgelengdene der klorofyll a (Chl a) fluorescens stimuleres, eller forskjeller i utslippsspektra, brukes til å utlede taksonomi13. In vivo fluorescenseksitasjon og utslippsspektra av disse prøvene er ikke bare avhengig av algerens fyla, men også på fotosystemtilpasning14. Effektiviteten av energioverføring til Chl a, eller forholdet mellom Chl a og tilbehørspigmenter, og det cellulære pigmentinnholdet er følsomt for vekstforhold5.
Røde alger, spesielt Chroothece, har flere tilbehør fluorescerende pigmenter-phycobiliproteins og karotenoider; Det tidligere konsentratet i fykobilisomer festet til thylakoider av kloroplaster. Phycobiliproteins (phycocyanin, phycoerythrin, og allophycocyanin) kan fange lys ved forskjellige bølgelengder og overføre det til Chl a, noe som gjør fotosyntese i svært forskjellige lys- og kulturforhold mulig15. For eksempel kan Chroothece-arter vokse inne i huler eller nesten dukke opp i litt saltholdige kalkholdige bekker2.
Monokromatiske lys påvirker veksten og pigmentsammensetningen av fotosyntetiske organismer, og har blitt studert for å forhindre eller kontrollere veksten av fotosyntetiske organismer i huler. Mulec et al. viste at rød beriket belysning fremmer veksten av cyanobakterier, alger og planter16. Tidligere studier har også rapportert at grønt lys påvirker pigmentsammensetningen av cyanobakterier17, mens andre har avslørt at grønt lys forhindrer veksten av de fleste fotosyntetiske organismer, og noen cyanobakterier viser en reduksjon i thylakoider og svakere gjennomsnittlig fluorescensintensitet18.
For å forstå Chrootheces evne som modellorganisme til å overvinne tøffe forhold, har dyrkede celler blitt utsatt for økende lysintensitet og monokromatisk lys (grønt eller rødt)15, for å se hvordan det takler de svake forholdene i huler (hvor rødt lys dominerer). Protokollen som presenteres her, reproduserer effekten av de ovennevnte variablene på Chrootheces fykobiliproteiner på cellenivå ved bruk av sin egen autofluorescens.
I dag brukes fluorescens ofte som et verktøy for å studere de fysiologiske responsene til karplanter, mikroalger, makroalger og cyanobakterier13,14,16. Spektral konfokal fluorescensmikroskopi er et ypperlig verktøy for in vivo-studier for å evaluere fotosyntetiske prøvers fysiologi på enkeltcellenivå 10,17,18,19,20, ved å unngå problemer forbundet med den lave veksthastigheten i laboratoriet og vanskelighetene med å skaffe nok biomasse til tilhørende ekstraksjon og biokjemiske metoder8 . Når cellene er behandlet under forskjellige dyrkningsbetingelser i 2 uker, kan lambda-skanningsprofilen måles in vivo. Selv om det er flere publikasjoner der forskjellige bølgelengder av eksitasjon ved konfokal avbildning har blitt brukt 3,4,10,17, kan de fleste fykobiliproteiner og Chl a detekteres ved hjelp av en 561 nm bølgelengde eksitasjonslinje, og den oppdagede utslippet varierer fra 570 til 760 nm bølgelengde. Disse kriteriene er basert på en analyse tidligere utført 10 med kommersielle rene pigmenter (tabell 1) ved konfokal avbildning og de oppnådde resultatene i forskjellige algearter20,21,22.
Pigmenter | λflmax (nm) | λ exc (nm) | |||||||
351 | 364 | 458 | 476 | 488 | 514 | 543 | 633 | ||
Chl en | 660.9-678.1 | 43,4 ± 1,8 | 11,2 ± 0,2 | 1,8 ± 0,05 | 2,0 ± 0,08 | 12,2 ± 0,7 | 6,0 ± 0,3 | 4,2 ± 0,16 | 80,7 ± 1,5 |
R-PE | 569.2-583.3 | 5,9 ± 0,6 | 5,9 ± 0,16 | 11,1 ± 0,04 | 42,2 ± 0,3 | 100,0 ± 0 | 90,0 ± 0,3 | 99,2 ± 0,08 | – |
652.1-668.6 | – | – | 1,5 ± 0,01 | 3,7 ± 0,04 | 26,7 ± 0,5 | 8,7 ± 0,16 | 11,1 ± 0,16 | 11,3 ± 0,2 | |
C-PC | 636.2-676.4 | 2,3 ± 0,04 | 1,0 ± 0,01 | 0,6 ± 0,004 | 0,7 ± 0,008 | 2,0 ± 0,08 | 2,0 ± 0,04 | 3,3 ± 0,16 | 33,6 ± 0,9 |
APC-XL | 667.3-683.8 | 15.1 ± 1.5 | 9,6 ± 0,98 | 1,0 ± 0,04 | 1,2 ± 0,08 | 5,9 ± 0,7 | 4,1 ± 0,5 | 23,2 ± 3,5 | 91,4 ± 2,3 |
Tabell 1: Den rene pigmentinformasjonen som ble brukt til å kjøre lambda-skanningsanalysen. Denne tabellen viser utslippstopper og skuldre/fluorescensbåndmaksima for forskjellige fluorokromer/pigmenter ved konfokal avbildningsspektrofotometri for alle eksitasjonsbølgelengder, og prosentandelen lysutslipp fra pigmenter/fluorokrom. Verdiene ble beregnet med formelen: = MFI*100/255. Hver verdi er gjennomsnittet ± SE (gjennomsnitt ± standardfeil fra gjennomsnittet). Rene pigmenter ble brukt til kalibrering av konfokalskanningslasermikroskopet som følger: 1,2,10. Klorofyll a ble hentet fra Spinacia oleracea, R-phycoerythrin (R-PE) fra Porphyra tenera, og C-phycocyanin (C-PE) fra Spirulina sp. Alle artene ble oppløst i filtrert destillert vann. Allophycocyanin-XL (APC-XL) ble oppnådd fra Mastigocladus laminosus, som ble oppløst i ammoniumsulfat (60%) og kaliumfosfat (pH = 7) for å oppnå en konsentrasjon på 38 mM. Skanningene ble utført med 400 μL av hver pigmentløsning (konsentrasjon på 1 mg/ml) ved bruk av et bunnkammer med 8 brønner i glass.
Studien av en enkelt eksitasjonsbølgelengde er ganske nyttig første tilnærming. I dette tilfellet er det imidlertid nødvendig å belyse det relative bidraget til de forskjellige kompleksene i fluorescenssignalet, som anbefales å utføre et fluorescensforhold eller spektrumanalyse ved flere bølgelengder, blant andre metoder.
Noen encellede eller koloniale røde alger, som Chroothece, vokser sakte in vitro, men inneholder flere autofluorescerende forbindelser som kan analyseres ved spektralanalyse under et konfokalmikroskop, hvor forskjeller i pigmentutslippstopper kan oppdages. Spektral konfokal fluorescensmikroskopi har gitt oss mulighet til å gjennomføre in vivo-studier for å evaluere tilpasning eller akklimatisering av fotosyntetiske organismer 8,10,17,18,19,20.<sup class="x…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble utført som en del av prosjektene TIN2015-68454-R og 20961/PI/18, finansiert av det spanske departementet for økonomi og konkurranseevne og Seneca-stiftelsen i Murcia-regionen. Irene Hernández Martínez og Francisco Javier Ibáñez López fra seksjonen for statistisk støtte ved vitenskaps- og forskningsområdet ved Murcia universitet (Sección de Apoyo Estadístico (SAE), Área Científica y de Investigación (ACTI), Universidad de Murcia, (figur 1 ) er tegnet med bilder fra Servier Medical Art. Servier Medical Art by Servier er lisensiert med Creative Commons Attribution 3.0 Unported License (https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/)
µ-Dish 35 mm, high Glass Bottom | Ibidi | 81158 | – |
24 black well plate | Ibidi | 82406 | flat and clear bottom for high throughput microscopy |
Algae Incubator | Panasonic | MLR-352-PE | |
Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | SP8 TCS | – |
Flask | Fisher Scientific | 15380591 | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
green filter | PNTA, LEE filters | – | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
HC PL APO 63X/1.30 GLYC CORR CS2 | Leica Microsystems | 506353 | Glycerol immersion lens |
Image acquisition software. LAS X | Leica Microsystems | SP8 TCS | – |
Light source | Panasonic | FL40SSENW/37MLR-352-PE | |
Quantum photoradiometer | DeltaOhm | DO 9721 | – |
R software | R Core Team, 2020 | 4.0.2. | – |
red filter | PNTA, LEE filters | – | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
SWES medium | University of Murcia | – | – |
Type G Immersion liquid | Leica Microsystems | 11513910 | Glycerol |