Culture tridimensionnelle de cryptes coliques murines pour étudier la fonction des cellules souches intestinales ex vivo
Summary
Le présent protocole décrit l’établissement d’un système organoïde du côlon murin pour étudier l’activité et le fonctionnement des cellules souches du côlon dans un modèle knockout claudin-7.
Abstract
L’épithélium intestinal se régénère tous les 5 à 7 jours et est contrôlé par la population de cellules souches épithéliales intestinales (IESC) située au fond de la région de la crypte. Les CSEI comprennent les cellules souches actives, qui s’auto-renouvellent et se différencient en divers types de cellules épithéliales, et les cellules souches quiescentes, qui servent de cellules souches de réserve en cas de blessure. La régénération de l’épithélium intestinal est contrôlée par les capacités d’auto-renouvellement et de différenciation de ces IESC actifs. De plus, l’équilibre de la population de cellules souches cryptiques et le maintien de la niche des cellules souches sont essentiels à la régénération intestinale. La culture organoïde est une approche importante et attrayante pour étudier les protéines, les molécules de signalisation et les signaux environnementaux qui régulent la survie et les fonctions des cellules souches. Ce modèle est moins cher, moins long et plus manipulable que les modèles animaux. Les organoïdes imitent également le microenvironnement tissulaire, fournissant une pertinence in vivo . Le présent protocole décrit l’isolement des cryptes du côlon, l’intégration de ces cellules cryptiques isolées dans un système de matrice de gel tridimensionnel et la culture de cellules cryptiques pour former des organoïdes du côlon capables d’auto-organisation, de prolifération, d’auto-renouvellement et de différenciation. Ce modèle permet de manipuler l’environnement – éliminer des protéines spécifiques telles que la claudine 7, activer / désactiver les voies de signalisation, etc. – pour étudier comment ces effets influencent le fonctionnement des cellules souches du côlon. Plus précisément, le rôle de la protéine de jonction serrée claudin-7 dans la fonction des cellules souches du côlon a été examiné. Claudin-7 est vital pour maintenir l’homéostasie intestinale et la fonction et l’intégrité de la barrière. L’élimination de la claudine-7 chez la souris induit un phénotype semblable à une maladie inflammatoire de l’intestin présentant une inflammation intestinale, une hyperplasie épithéliale, une perte de poids, des ulcérations des muqueuses, une desquamation des cellules épithéliales et des adénomes. Auparavant, il a été rapporté que la claudine-7 est nécessaire pour les fonctions des cellules souches épithéliales intestinales dans l’intestin grêle. Dans ce protocole, un système de culture organoïde du côlon est établi pour étudier le rôle de la claudine-7 dans le gros intestin.
Introduction
La culture organoïde intestinale est un système ex vivo tridimensionnel (3D) dans lequel les cellules souches sont isolées des cryptes intestinales du tissu primaire et plaquées dans une matrice de gel 1,2. Ces cellules souches sont capables d’auto-renouvellement, d’auto-organisation et de fonctionnalité des organes2. Les organoïdes imitent le microenvironnement tissulaire et sont plus semblables aux modèles in vivo qu’aux modèles de culture cellulaire in vitro bidimensionnels (2D), bien que moins manipulables que les cellules 3,4. Ce modèle élimine les obstacles rencontrés dans les modèles 2D, tels que le manque d’adhérences cellule-cellule appropriées, les interactions cellule-matrice et les populations homogènes, et réduit également les limites des modèles animaux, y compris les coûts élevés et les longues périodes de temps5. Les organoïdes intestinaux – également appelés colonoïdes pour ceux cultivés à partir de cellules souches dérivées de cryptes du côlon – sont essentiellement des mini-organes qui contiennent un épithélium comprenant tous les types de cellules qui seraient présentes in vivo, ainsi qu’une lumière. Ce modèle permet de manipuler le système pour étudier de nombreux aspects de l’intestin, tels que la niche des cellules souches, la physiologie intestinale, la physiopathologie et la morphogenèse intestinale 3,5,6. Il fournit également un excellent modèle pour la découverte de médicaments, l’étude des troubles intestinaux humains tels que les maladies inflammatoires de l’intestin (MII) et le cancer colorectal, le développement de traitements personnalisés spécifiques au patient et l’étude de la régénération tissulaire 4,7,8,9. En outre, le système organoïde peut également être utilisé pour étudier la communication cellulaire, le métabolisme des médicaments, la viabilité, la prolifération et la réponse aux stimuli 7,8. Bien que des modèles animaux puissent être utilisés pour tester des traitements potentiels pour les affections pathologiques intestinales, ils sont assez limités, car l’étude de plusieurs médicaments à la fois pose un défi. Il y a plus de variables confondantes in vivo, et le coût et le temps associés sont respectivement élevés et longs. D’autre part, le système de culture organoïde permet le criblage de nombreux produits thérapeutiques à la fois dans un laps de temps plus court et permet également un traitement personnalisé grâce à l’utilisation de cultures organoïdes dérivées du patient 4,8. La capacité des organoïdes du côlon à imiter l’organisation, le microenvironnement et la fonctionnalité des tissus en fait également un excellent modèle pour étudier la régénération et la réparation des tissus9. Notre laboratoire a mis en place un système de culture organoïde de l’intestin grêle pour étudier l’effet de la claudine-7 sur les fonctions des cellules souches de l’intestin grêle10. Dans cette étude, un système de culture organoïde intestinal de grande taille est établi pour étudier la capacité, ou l’absence de capacité, des cellules souches à s’auto-renouveler, à se différencier et à proliférer dans un modèle conditionnel de claudin-7 knockout (cKO).
La claudine-7 est une protéine de jonction serrée (TJ) très importante qui est fortement exprimée dans l’intestin et est essentielle au maintien de la fonction et de l’intégrité de TJ11. Les souris cKO souffrent d’un phénotype de type MII, présentant une inflammation sévère, des ulcérations, une desquamation des cellules épithéliales, des adénomes et une augmentation des taux de cytokines11,12. Bien qu’il soit largement admis que les claudines sont vitales pour la fonction de barrière épithéliale, de nouveaux rôles pour les claudines émergent; Ils sont impliqués dans la prolifération, la migration, la progression du cancer et la fonction des cellules souches 10,12,13,14,15,16,17. On ignore actuellement comment la claudine-7 affecte la niche des cellules souches et la fonction des cellules souches du côlon. Comme l’intestin s’auto-renouvelle rapidement environ tous les 5 à 7 jours, le maintien de la niche des cellules souches et le bon fonctionnement des cellules souches actives sont essentiels18. Ici, un système est établi pour examiner les effets régulateurs potentiels de la claudine-7 sur la niche des cellules souches du côlon.
Protocol
Representative Results
Discussion
La culture organoïde est un excellent modèle pour étudier la fonction des cellules souches, la physiologie intestinale, la découverte de médicaments, les maladies intestinales humaines et la régénération et la réparation des tissus 7,8,9,10,11,26. Bien qu’il présente de nombreux avantages, il peut être difficile …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée par NIH DK103166.
Materials
| 0.09 cubic feet space-saver vacuum desiccator | United States Plastic Corp | 78564 | anesthesia chamber |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | AM9261 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | ThermoFisher | 69715 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| 1x Dulbecco’s Phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | |
| 2-methylbutane | Sigma | 277258 | |
| 4% paraformaldehyde | ThermoFisher | J61899.AK | |
| 4-hydroxytamoxifen (4OH-TAM) | Sigma | 579002 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 70 µm nylon cell strainer | Corning | 352350 | |
| 96 well culture plate | Greiner Bio-One | 655180 | |
| B-27 Supplement (50x) | Gibco | 12587-010 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP1605-100 | |
| Claudin-7 anti-murine rabbit antibody | Immuno-Biological Laboratories | 18875 | |
| Cover glass (24 x 50-1.5) | Fisher Scientific | 12544E | |
| Cryomolds | vwr | 25608-916 | |
| Cultrex RCF BME, Type 2 | R&D Systems | 3533-005-02 | gel matrix |
| Cy3 anti-rabbit antibody | Jackson Immunoresearch | 111-165-003 | |
| Dewar Flask | Thomas Scientific | 1173F61 | |
| DMEM High Glucose with L-Glutamine | ATCC | 30-2002 | |
| EVOS FLoid Imaging System | ThermoFisher | 4477136 | |
| Fluoro-Gel II with DAPI | Electron Microscopy Sciences | 17985-50 | |
| GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Glycine | JT Baker | 4059-02 | |
| HEPES (1 M) Buffer Solution | Gibco | 15630-080 | |
| Hoechst | ThermoFisher | 62249 | |
| In situ cell death detection kit, TMR Red | Roche | 12156792910 | |
| Isoflurane | Pivetal | 07-893-8440 | |
| L-WRN Media | Harvard Medical School Gastrointestinal Organoid Derivation and Culture Core | N/A | |
| Mouse surgical kit | Kent Scientific Corporation | INSMOUSEKIT | |
| Murine EGF | PeproTech | 315-09-500UG | |
| N2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | |
| Optimum cutting temperature (OCT) compound | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Sequenza Rack | vwr | 10129-584 | |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | S-279 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Vacuum filter (0.22 µm; cellulose acetate) | Corning | 430769 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris Bioscience | 1254 |
Riferimenti
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Wallach, T. E., Bayrer, J. R. Intestinal organoids: new frontiers in the study of intestinal disease and physiology. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 64 (2), 180-185 (2017).
- Shankaran, A., Prasad, K., Chaudhari, S., Brand, A., Satyamoorthy, K. Advances in development and application of human organoids. 3 Biotech. 11 (6), 257 (2021).
- Angus, H., Butt, A., Schultz, M., Kemp, R. Intestinal organoids as a tool for inflammatory bowel disease research. Frontiers in Medicine. 6, 334 (2020).
- Fan, Y., Davidson, L. A., Chapkin, R. S. Murine colonic organoid culture system and down stream assay applications. Methods in Molecular Biology. 1576, 171-181 (2019).
- Gupta, N., et al. Microfluidics-based 3D cell culture models: Utility in novel drug discovery and delivery research. Bioengineering and Translational Medicine. 1 (1), 63-81 (2016).
- Yoo, J., Donowitz, M. Intesitnal enteroids/organoids: A novel platform for drug discovery in inflammatory bowel diseases. World Journal of Gastroenterology. 25 (30), 4125-4147 (2019).
- Qu, M., et al. Establishment of intestinal organoid cultures modeling injury-associated epithelial regeneration. Cell Research. 31 (3), 259-271 (2021).
- Xing, T., et al. Tight junction protein claudin-7 is essential for intestinal epithelial stem cell self-renewal and differentiation. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (4), 641-659 (2020).
- Ding, L., et al. Inflammation and disruption of the mucosal architecture in claudin-7-deficient mice. Gastroenterology. 142 (2), 305-315 (2012).
- Lu, Z., Ding, L., Lu, Q., Chen, Y. H. Claudins in intestines: distribution and functional significance in health and diseases. Tissue Barriers. 1 (3), 24978 (2013).
- Ding, L., Lu, Z., Lu, Q., Chen, Y. H. The claudin family of proteins in human malignancy: a clinical perspective. Cancer Management and Research. 5, 367-375 (2013).
- Bhat, A. A., et al. Claudin-7 expression induces mesenchymal to epithelial transformation (MET) to inhibit colon tumorigenesis. Oncogene. 34 (35), 4570-4580 (2015).
- Lu, Z., et al. A non-tight junction function of claudin-7-interaction with integrin signaling in suppressing lung cancer cell proliferation and detachement. Molecular Cancer. 14, 120 (2015).
- Wang, K., Xu, C., Li, W., Ding, L. Emerging clinical significance of claudin-7 in colorectal cancer: a review. Cancer Management and Research. 10, 3741-3752 (2018).
- Wang, K., et al. Claudin-7 downregulation induces metastasis and invasion in colorectal cancer via the promotion of epithelial-mesenchymal transition. Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (3), 797-804 (2019).
- Wang, F., et al. Isolation and characterization of intestinal stem cells based on surface marker combinations and colony-formation assay. Gastroenterology. 145 (2), 383 (2013).
- Li, W., et al. Severe intestinal inflammation in the small intestine of mice induced by controllable deletion of claudin-7. Digestive Diseases and Sciences. 63 (5), 1200-1209 (2018).
- Donovan, J., Brown, P. Euthanasia. Current Protocols in Immunology. 73 (1), (2006).
- Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. Journal of Visual Experiments. (80), e50611 (2013).
- Sugimoto, K., et al. Cell adhesion signals regulate the nuclear receptor activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (49), 24600-24609 (2019).
- Mansour, H., et al. Connexin 30 expression and frewuency of connexin heterogeneity in astrocyte gap junction plaques increase with age in the rat retina. PLoS One. 8 (3), 57038 (2013).
- Miranda, M., et al. Antioxidants rescue photoreceptors in rd1 mice: relationship with thiol metabolism. Free Radical Biology and Medicine. 48 (2), 216-222 (2010).
- Wang, L., et al. Mesenchymal stromal cells ameliorate oxidative stress-induced islet endothelium apoptosis and functional impairment via Wnt4-β-catenin signaling. Stem Cell Research and Therapy. 8 (1), 188 (2017).
- Almeqdadi, M., Mana, M., Roper, J., Yilmaz, O. Gut organoids: mini-tissues in culture to study intestinal physiology and disease. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 317 (3), 405-419 (2019).
