Tredimensionel kultur af Murine Colonic Crypts til undersøgelse af tarmstamcellefunktion Ex vivo
Summary
Den nuværende protokol beskriver etablering af et murine colonic organoid system til at studere aktiviteten og funktionen af kolon stamceller i en claudin-7 knockout model.
Abstract
Tarmepitelet regenererer hver 5-7 dage og styres af tarmepitelstamcellepopulationen (IESC) placeret i bunden af kryptområdet. IESC’er omfatter aktive stamceller, som selvfornyer og differentierer sig til forskellige epitelcelletyper, og hvilende stamceller, der tjener som reservestamceller i tilfælde af skade. Regenerering af tarmepitelet styres af disse aktive IESC’ers selvfornyende og differentierende egenskaber. Derudover er balancen i kryptstamcellepopulationen og vedligeholdelsen af stamcellenichen afgørende for tarmregenerering. Organoidkultur er en vigtig og attraktiv tilgang til at studere proteiner, signalmolekyler og miljømæssige signaler, der regulerer stamcelleoverlevelse og funktioner. Denne model er billigere, mindre tidskrævende og mere manipulerbar end dyremodeller. Organoider efterligner også vævsmikromiljøet, hvilket giver in vivo relevans. Den nuværende protokol beskriver isoleringen af kolonkrypter, indlejring af disse isolerede kryptceller i et tredimensionelt gelmatrixsystem og dyrkning af kryptceller til dannelse af kolonorganiske oider, der er i stand til selvorganisering, spredning, selvfornyelse og differentiering. Denne model gør det muligt at manipulere miljøet – slå specifikke proteiner ud som claudin-7, aktivere / deaktivere signalveje osv. – for at studere, hvordan disse effekter påvirker funktionen af kolonstamceller. Specifikt blev rollen som tæt krydsprotein claudin-7 i kolon stamcellefunktion undersøgt. Claudin-7 er afgørende for at opretholde tarmhomeostase og barrierefunktion og integritet. Knockout af claudin-7 hos mus inducerer en inflammatorisk tarmsygdom-lignende fænotype, der udviser tarmbetændelse, epitelhyperplasi, vægttab, slimhindesårdannelser, epitelcellesloughing og adenomer. Tidligere blev det rapporteret, at claudin-7 er nødvendig for intestinal epitel stamcellefunktioner i tyndtarmen. I denne protokol etableres et kolonorganoidkultursystem for at studere claudin-7’s rolle i tyktarmen.
Introduction
Intestinal organoidkultur er et tredimensionelt (3D) ex vivo-system, hvor stamceller isoleres fra tarmkrypterne i primært væv og belægges til en gelmatrix 1,2. Disse stamceller er i stand til selvfornyelse, selvorganisering og organfunktionalitet2. Organoider efterligner vævsmikromiljøet og ligner mere in vivo-modeller end todimensionelle (2D) in vitro-cellekulturmodeller, selvom de er mindre manipulerbare end celler 3,4. Denne model eliminerer forhindringer, der opstår i 2D-modeller, såsom mangel på korrekt celle-celle-adhæsioner, celle-matrix-interaktioner og homogene populationer, og reducerer også begrænsningerne ved dyremodeller, herunder høje omkostninger og lange perioder5. Intestinale organoider – også kaldet colonoider for dem, der dyrkes af kolonkryptafledte stamceller – er i det væsentlige mini-organer, der indeholder et epitel, herunder alle celletyper, der ville være til stede in vivo, samt et lumen. Denne model tillader manipulation af systemet til at studere mange aspekter af tarmen, såsom stamcelleniche, tarmfysiologi, patofysiologi og tarmmorfogenese 3,5,6. Det giver også en god model til lægemiddelopdagelse, studerer menneskelige tarmlidelser såsom inflammatorisk tarmsygdom (IBD) og kolorektal cancer, patientspecifik personlig behandlingsudvikling og studerer vævsregenerering 4,7,8,9. Derudover kan organoidsystemet også bruges til at studere cellulær kommunikation, lægemiddelmetabolisme, levedygtighed, spredning og respons på stimuli 7,8. Mens dyremodeller kan bruges til at teste potentielle terapeutiske midler til tarmpatologiske tilstande, er de ret begrænsede, da det er en udfordring at studere flere lægemidler på én gang. Der er flere forvirrende variabler in vivo, og tilhørende omkostninger og tid er henholdsvis høje og lange. På den anden side giver organoidkultursystemet mulighed for screening af mange terapier på én gang i en kortere periode og giver også mulighed for personlig behandling ved brug af patientafledt organoidkultur 4,8. Colonic organoids evne til at efterligne vævsorganisation, mikromiljø og funktionalitet gør dem også til en fremragende model til at studere regenerering og vævsreparation9. Vores laboratorium har etableret et tyndtarmsorganoidkultursystem for at studere effekten af claudin-7 på tyndtarmens stamcellefunktioner10. I denne undersøgelse etableres et stort tarmorganoidkultursystem for at studere stamcellers evne eller manglende evne til selvfornyelse, differentiering og spredning i en betinget claudin-7 knockout (cKO) model.
Claudin-7 er et meget vigtigt TJ-protein (tight junction), der udtrykkes meget i tarmen og er afgørende for at opretholde TJ-funktion og integritet11. cKO-mus lider af en IBD-lignende fænotype, der udviser alvorlig betændelse, sårdannelser, epitelcellesloughing, adenomer og øgede cytokinniveauer11,12. Mens det er almindeligt accepteret, at claudiner er afgørende for epitelbarrierefunktion, opstår der nye roller for claudiner; de er involveret i spredning, migration, kræftprogression og stamcellefunktion 10,12,13,14,15,16,17. Det er på nuværende tidspunkt uvist, hvordan claudin-7 påvirker stamcellenichen og funktionen af kolonstamceller. Da tarmen hurtigt fornyer sig selv ca. hver 5-7 dag, er vedligeholdelse af stamcelleniche og korrekt funktion af de aktive stamceller afgørende18. Her etableres et system til at undersøge de potentielle regulatoriske virkninger af claudin-7 på den koloniske stamcelleniche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Organoidkultur er en fremragende model til undersøgelse af stamcellefunktion, tarmfysiologi, lægemiddelopdagelse, menneskelige tarmsygdomme og vævsregenerering og reparation 7,8,9,10,11,26. Selvom det har mange fordele, kan det være udfordrende at etablere. Der skal udvises forsigtighed i alle trin i hele protokollen, men…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev finansieret af NIH DK103166.
Materials
| 0.09 cubic feet space-saver vacuum desiccator | United States Plastic Corp | 78564 | anesthesia chamber |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | AM9261 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | ThermoFisher | 69715 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| 1x Dulbecco’s Phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | |
| 2-methylbutane | Sigma | 277258 | |
| 4% paraformaldehyde | ThermoFisher | J61899.AK | |
| 4-hydroxytamoxifen (4OH-TAM) | Sigma | 579002 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 70 µm nylon cell strainer | Corning | 352350 | |
| 96 well culture plate | Greiner Bio-One | 655180 | |
| B-27 Supplement (50x) | Gibco | 12587-010 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP1605-100 | |
| Claudin-7 anti-murine rabbit antibody | Immuno-Biological Laboratories | 18875 | |
| Cover glass (24 x 50-1.5) | Fisher Scientific | 12544E | |
| Cryomolds | vwr | 25608-916 | |
| Cultrex RCF BME, Type 2 | R&D Systems | 3533-005-02 | gel matrix |
| Cy3 anti-rabbit antibody | Jackson Immunoresearch | 111-165-003 | |
| Dewar Flask | Thomas Scientific | 1173F61 | |
| DMEM High Glucose with L-Glutamine | ATCC | 30-2002 | |
| EVOS FLoid Imaging System | ThermoFisher | 4477136 | |
| Fluoro-Gel II with DAPI | Electron Microscopy Sciences | 17985-50 | |
| GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Glycine | JT Baker | 4059-02 | |
| HEPES (1 M) Buffer Solution | Gibco | 15630-080 | |
| Hoechst | ThermoFisher | 62249 | |
| In situ cell death detection kit, TMR Red | Roche | 12156792910 | |
| Isoflurane | Pivetal | 07-893-8440 | |
| L-WRN Media | Harvard Medical School Gastrointestinal Organoid Derivation and Culture Core | N/A | |
| Mouse surgical kit | Kent Scientific Corporation | INSMOUSEKIT | |
| Murine EGF | PeproTech | 315-09-500UG | |
| N2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | |
| Optimum cutting temperature (OCT) compound | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Sequenza Rack | vwr | 10129-584 | |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | S-279 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Vacuum filter (0.22 µm; cellulose acetate) | Corning | 430769 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris Bioscience | 1254 |
Riferimenti
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Wallach, T. E., Bayrer, J. R. Intestinal organoids: new frontiers in the study of intestinal disease and physiology. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 64 (2), 180-185 (2017).
- Shankaran, A., Prasad, K., Chaudhari, S., Brand, A., Satyamoorthy, K. Advances in development and application of human organoids. 3 Biotech. 11 (6), 257 (2021).
- Angus, H., Butt, A., Schultz, M., Kemp, R. Intestinal organoids as a tool for inflammatory bowel disease research. Frontiers in Medicine. 6, 334 (2020).
- Fan, Y., Davidson, L. A., Chapkin, R. S. Murine colonic organoid culture system and down stream assay applications. Methods in Molecular Biology. 1576, 171-181 (2019).
- Gupta, N., et al. Microfluidics-based 3D cell culture models: Utility in novel drug discovery and delivery research. Bioengineering and Translational Medicine. 1 (1), 63-81 (2016).
- Yoo, J., Donowitz, M. Intesitnal enteroids/organoids: A novel platform for drug discovery in inflammatory bowel diseases. World Journal of Gastroenterology. 25 (30), 4125-4147 (2019).
- Qu, M., et al. Establishment of intestinal organoid cultures modeling injury-associated epithelial regeneration. Cell Research. 31 (3), 259-271 (2021).
- Xing, T., et al. Tight junction protein claudin-7 is essential for intestinal epithelial stem cell self-renewal and differentiation. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (4), 641-659 (2020).
- Ding, L., et al. Inflammation and disruption of the mucosal architecture in claudin-7-deficient mice. Gastroenterology. 142 (2), 305-315 (2012).
- Lu, Z., Ding, L., Lu, Q., Chen, Y. H. Claudins in intestines: distribution and functional significance in health and diseases. Tissue Barriers. 1 (3), 24978 (2013).
- Ding, L., Lu, Z., Lu, Q., Chen, Y. H. The claudin family of proteins in human malignancy: a clinical perspective. Cancer Management and Research. 5, 367-375 (2013).
- Bhat, A. A., et al. Claudin-7 expression induces mesenchymal to epithelial transformation (MET) to inhibit colon tumorigenesis. Oncogene. 34 (35), 4570-4580 (2015).
- Lu, Z., et al. A non-tight junction function of claudin-7-interaction with integrin signaling in suppressing lung cancer cell proliferation and detachement. Molecular Cancer. 14, 120 (2015).
- Wang, K., Xu, C., Li, W., Ding, L. Emerging clinical significance of claudin-7 in colorectal cancer: a review. Cancer Management and Research. 10, 3741-3752 (2018).
- Wang, K., et al. Claudin-7 downregulation induces metastasis and invasion in colorectal cancer via the promotion of epithelial-mesenchymal transition. Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (3), 797-804 (2019).
- Wang, F., et al. Isolation and characterization of intestinal stem cells based on surface marker combinations and colony-formation assay. Gastroenterology. 145 (2), 383 (2013).
- Li, W., et al. Severe intestinal inflammation in the small intestine of mice induced by controllable deletion of claudin-7. Digestive Diseases and Sciences. 63 (5), 1200-1209 (2018).
- Donovan, J., Brown, P. Euthanasia. Current Protocols in Immunology. 73 (1), (2006).
- Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. Journal of Visual Experiments. (80), e50611 (2013).
- Sugimoto, K., et al. Cell adhesion signals regulate the nuclear receptor activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (49), 24600-24609 (2019).
- Mansour, H., et al. Connexin 30 expression and frewuency of connexin heterogeneity in astrocyte gap junction plaques increase with age in the rat retina. PLoS One. 8 (3), 57038 (2013).
- Miranda, M., et al. Antioxidants rescue photoreceptors in rd1 mice: relationship with thiol metabolism. Free Radical Biology and Medicine. 48 (2), 216-222 (2010).
- Wang, L., et al. Mesenchymal stromal cells ameliorate oxidative stress-induced islet endothelium apoptosis and functional impairment via Wnt4-β-catenin signaling. Stem Cell Research and Therapy. 8 (1), 188 (2017).
- Almeqdadi, M., Mana, M., Roper, J., Yilmaz, O. Gut organoids: mini-tissues in culture to study intestinal physiology and disease. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 317 (3), 405-419 (2019).
