न्यूनतम इनवेसिव तकनीक और एक सरल प्रयोगशाला उपकरण प्रयोगात्मक जानवरों को ऑपरेटिव क्षति को कम करके और शारीरिक आकृति विज्ञान रखरखाव की अनुमति देकर रीढ़ की हड्डी की चोट मॉडल की प्रजनन क्षमता में सुधार करते हैं। विधि सार्थक है क्योंकि विश्वसनीय परिणाम और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रक्रिया रोग क्षतिपूर्ति के तंत्र की जांच की सुविधा प्रदान करती है।
रीढ़ की हड्डी की चोट (एससीआई) को मॉडल करने के लिए न्यूनतम इनवेसिव तरीकों का उपयोग प्रयोगात्मक जानवरों के बीच व्यवहार और हिस्टोलॉजिकल अंतर को कम कर सकता है, जिससे प्रयोगों की प्रजनन क्षमता में सुधार हो सकता है।
इन विधियों को पूरा करने के लिए दो आवश्यकताओं की आवश्यकता होती है: सर्जिकल शारीरिक मार्ग की स्पष्टता और प्रयोगशाला उपकरण की सादगी और सुविधा। ऑपरेटर के लिए महत्वपूर्ण रूप से, एक स्पष्ट शारीरिक मार्ग न्यूनतम इनवेसिव एक्सपोजर प्रदान करता है, जो सर्जिकल प्रक्रियाओं के दौरान प्रयोगात्मक जानवर को अतिरिक्त नुकसान से बचाता है और जानवर को प्रयोग के दौरान एक सुसंगत और स्थिर शारीरिक आकृति विज्ञान बनाए रखने की अनुमति देता है।
इस अध्ययन में, छोटे जानवरों में रीढ़ की हड्डी की चोट के लिए एससीआई समाक्षीय मंच नामक एक नए एकीकृत मंच का उपयोग न्यूनतम इनवेसिव तरीके से टी 9 स्तर की रीढ़ की हड्डी को उजागर करने और कशेरुक स्टेबलाइजर का उपयोग करके चूहों के कशेरुक को स्थिर और स्थिर करने के लिए किया जाता है, और अंत में, टी 9 रीढ़ की हड्डी की चोट के विभिन्न डिग्री तक पहुंचने के लिए चूहों की रीढ़ की हड्डी को दूषित करने के लिए एक समाक्षीय गुरुत्वाकर्षण प्रभावक का उपयोग किया जाता है। अंत में, हिस्टोलॉजिकल परिणाम पाठकों के लिए एक संदर्भ के रूप में प्रदान किए जाते हैं।
दर्दनाक रीढ़ की हड्डी की चोट (एससीआई) आसानी से व्यक्ति को गंभीर परिणामों के लिए प्रेरित करती है1; फिर भी, वर्तमान में कोई प्रभावी उपचार नहीं है 1,2. पशु संदूषण मॉडल एससीआई 3,4 का अध्ययन करने के प्रमुख तरीकों में से एक है।
2004 से 2014तक, चूहों को 407 अध्ययनों (71%) में से 289 में मॉडल जीवों के रूप में और 69 (16.9%) में चूहों में इस्तेमाल किया गया था। दरअसल, चूहों के साथ प्रयोगों का अनुपात धीरे-धीरे अन्य मॉडलों पर उनके फायदे के कारण वर्षों से बढ़ गया है, विशेष रूप से जीन विनियमन अध्ययन 3,4,5 के लिए महान क्षमता। इसलिए, मॉडल स्थिरता6 से जुड़े महान महत्व के कारण एक मॉडल के रूप में माउस का उपयोग करके अधिक अध्ययन करने के लिए अधिक संगत उपकरणों की आवश्यकता होती है। पिछले अध्ययनों में रिपोर्ट किए गए सामान्य उपकरण मूल रूप से एलन के रीढ़ की हड्डी के प्रभाव सिद्धांत पर आधारित हैं, उदाहरण के लिए, मूल वजन ड्रॉप इंपैक्टर 7,8, न्यूयॉर्क विश्वविद्यालय (एनवाईयू)/ बहु-आयामी पशु रीढ़ की हड्डी की चोट अध्ययन (एमएएससीआईएस) इंपैक्टर 1,9, और अनंत क्षितिज (आईएच) इंपैक्टर10,11 . वजन घटाने वाले इम्पैक्टर और एनवाईयू / एमएएससीआईएस इम्पैक्टर लक्षित रीढ़ की हड्डी को लक्षित करने और अलग-अलग चोट ों को अलग करने के लिए अलग-अलग ऊंचाइयों से एक निश्चित वजन गिराने के एक ही सिद्धांत को साझा करते हैं। आईएच इम्पैक्टर विभिन्न बलों के अनुसार रीढ़ की हड्डी की चोट बनाता है।
एससीआई अध्ययनों में माउस मॉडल का उपयोग करने में सुविधा के लिए और प्रभावी उपचार विधियों के लिए आधार स्थापित करने के लिए, एक एकीकृत माउस रीढ़ की हड्डी प्रभाव चोट मंच, जिसे रीढ़ की हड्डी की चोट समाक्षीय मंच (एससीआईसीपी) कहा जाता है, विकसित किया गया है। मंच में चार मुख्य घटक होते हैं: (1) संचालित चूहों के लिए उपयुक्त स्थिति के लिए डिज़ाइन की गई एक पशु ऑपरेटिंग टेबल, जो बहुत कॉम्पैक्ट है और स्थिति प्रतिबंध के बिना सुविधा प्रदान करती है; (2) ऑपरेशन के दौरान पैरावर्टेब्रल मांसपेशियों को पकड़ने के लिए दोनों तरफ एक माइक्रो-रिट्रैक्टर; (3) एससीआई की प्रक्रिया से पहले कशेरुका को पकड़ने के लिए एक कशेरुका स्टेबिलिज़ेटर (चूहों जैसे बड़े जानवरों पर ऑपरेशन के लिए दो कशेरुक स्टेबिलाइज़ेटर उपलब्ध हैं); (4) एक आस्तीन, एक इंपैक्टर टिप, वजन और एक पुल पिन। तीन भागों को एक हटाने योग्य एक्स-वाई-जेड हाथ में इकट्ठा किया जाना चाहिए। सटीक लक्ष्यीकरण के लिए, रीढ़ की हड्डी की सतह पर एक इंपैक्टर टिप रखी जाती है, और एक्स-वाई-जेड आर्म को धीरे-धीरे इम्पैक्टर टिप और आस्तीन के बीच निशान की सहायता से अपेक्षित ऊंचाई तक उतारा जाता है। इम्पैक्टर टिप 0.12 ग्राम एल्यूमीनियम मिश्र धातु से बना है ताकि प्रक्रिया से पहले बड़े वजन संपीड़न के कारण रीढ़ की हड्डी को नुकसान से बचाया जा सके। खिंचाव पिन वजन में गिरावट तैयार करने के लिए आस्तीन के शीर्ष पर वजन रखने के लिए है (चित्रा 1)।
पिछले अध्ययनों में, प्रभाव बल विभाजन को आईएच डिवाइस के प्रभाव बल डेटा के अनुसार परिभाषित किया गया था, जो क्रमशः 30 केडिन, 50 केडिन और 70 केडिन 6,10 हैं। अनुसंधान प्रक्रिया के दौरान, एससीआईसीपी के आधार पर एससीआई मॉडल की सीरियल डिग्री स्थापित की गई, जिसका उपयोग विभिन्न अध्ययनों में किया जा सकता है। इसलिए, आधिकारिक तौर पर प्रयोग शुरू करने से पहले, विभिन्न द्रव्यमानों के विभिन्न भारों द्वारा उत्पन्न प्रभाव बलों का परीक्षण एक चरम दबाव परीक्षण उपकरण का उपयोग करके किया गया था। नतीजतन, तीन मानकीकृत प्रतिनिधि एससीआई माउस मॉडल को चोट के तीन अलग-अलग डिग्री के रूप में चुना गया था, जिसमें क्रमशः 6,10 वर्गीकृत हल्के, मध्यम और गंभीर समूह शामिल थे, और वजन को एक ही ऊंचाई पर जारी किया गया था, जिसमें हल्के के लिए 1.3 ग्राम वजन, मध्यम के लिए 2.0 ग्राम और गंभीर क्षति के लिए 2.7 ग्राम था।
संचालन और सटीकता की गारंटी देने के एक अन्य साधन के रूप में, एक नया और न्यूनतम इनवेसिव ऑपरेटिव दृष्टिकोण बताया गया है। सामान्य चूहों की शारीरिक रचना पर शोध के माध्यम से, टी 12-टी 13 के इंटरस्पिनस स्पेस का पता लगाने के लिए एक नई विधि पाई गई है। ऑपरेशन चरणों में कशेरुक का पता लगाने की विधि मास्टर और सटीक है, जो न्यूनतम इनवेसिव ऑपरेशन के लिए सटीक पता लगाना सुनिश्चित करती है।
उम्मीद है, दूषित चोट की यह तकनीक रीढ़ की हड्डी की चोट के अनुसंधान और समझ में सहायता कर सकती है, जिसमें पैथोफिज़ियोलॉजी समझ, प्रबंधन मूल्यांकन आदि शामिल हैं।
मानकीकृत प्रक्रिया के माध्यम से, स्थिर डेटा प्राप्त किया जा सकता है, विशेष रूप से विवो प्रयोगों में छोटे जानवरों में , जो जानवरों के बीच व्यक्तिगत मतभेदों के कारण परिणामों के विचलन को कम कर सकता है। उपरोक्त शर्तों और सुविधाजनक अनुप्रयोग उपकरणों के आधार पर, मानकीकृत, न्यूनतम इनवेसिव, सटीक और दोहराने योग्य एससीआई मॉडल स्थापित किए जा सकते हैं।
इसकी व्यावहारिकता और सुविधा के कारण, पहले, वजन ड्रॉप इंपैक्टर का उपयोग ज्यादातर3 किया जाता था। इस अध्ययन में पेश किया गया इम्पैक्टर एलन के मॉडल12 के साथ एक ही सिद्धांत साझा करता है। सौभाग्य से, आधुनिक मशीनिंग तकनीक के सटीक विनिर्माण लाभों के कारण, अनुसंधान टीम ने संचालित करने में आसान, दृढ़ता से स्थिर और शायद ही कभी गलत होने के लाभों के साथ एक वजन ड्रॉप इम्पैक्टर तैयार किया। विभिन्न भारों के गुरुत्वाकर्षण को मापने के लिए एक चरम दबाव का पता लगाने वाले उपकरण का उपयोग किया गया था। अनंत क्षितिज प्रभावक के बारे में पिछले अध्ययन 6,10 ने बताया कि 30 Kdyn, 50 Kdyn और 70 Kdyn समूहों में इच्छित बल से विचलित बल की एक ±5 Kdyn रेंज को स्वीकार किया जाता है, जो समूह विभाजन और संदूषण डिग्री चयन के संदर्भ में वर्तमान अध्ययन के लिए एक संदर्भ प्रदान करता है। वर्तमान शोध में, विभिन्न समूहों के संभावित बल को पहले से मापा गया था, और अधिक सटीक डेटा प्राप्त किया गया था।
पशु मॉडल प्रयोगों में डिवाइस की तुलना में अधिक महत्वपूर्ण माउस शरीर रचना विज्ञान की समझ और उपयोग है। शरीर रचना विज्ञान का अच्छा उपयोग करने से प्रक्रियाओं को न्यूनतम इनवेसिव बनाया जा सकता है। मिनिमली इनवेसिव सर्जरी सीधे प्रयोगात्मक जानवर की कार्यात्मक स्थिति की स्थिरता और बाद में माउस रिकवरी की स्थिरता को प्रभावित करती है। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि एससीआई मॉडल की न्यूनतम इनवेसिव स्थापना कशेरुक संरचना की स्थिरता को बढ़ाती हैऔर चूहों में वसूली के दौरान रीढ़ की हड्डी की अस्थिरता के कारण होने वाली अतिरिक्त क्षति से बचती है। न्यूनतम इनवेसिव सर्जरी का आधार प्राकृतिक शारीरिक संरचनाओं का उचित उपयोग है। इसलिए, रीढ़ की हड्डी के खंडों का तेजी से और सटीक पता लगाना चूहों की शारीरिक संरचना के अनुसार किया जाना चाहिए। जैसा कि बताया गया है, कशेरुक13 को खोजने के लिए इमेजिंग विधि का उपयोग किया गया था। यद्यपि इसमें उच्च सटीकता है, वास्तविक प्रयोगात्मक संचालन प्रक्रिया में, पता लगाने के लिए इमेजिंग विधि में असुविधाजनक संचालन, लंबे ऑपरेशन समय, जटिल उपकरण अधिग्रहण और उच्च उपकरण सटीकता आवश्यकताओं के नुकसान हैं। मैकडोनो एट अल ने स्कैपुलस14 के अवर कोणों के माध्यम से टी 7 का पता लगाने का वर्णन किया, जबकि चूहे एक झूठ के साष्टांग में कार्य करते हैं, इसलिए उल्लिखित अवर कोणों को पीछे के कोण माना जाता है। इसके अलावा, टी 7 को खोजने के लिए निचले स्कैपुलर युक्तियों का उपयोग करना मानव शरीर रचनाविज्ञान 15 में एक विशिष्ट स्थिति के लिए एक पता लगाने की विधि है, जो चूहों के लिए उपयुक्त नहीं है। अंत में, माइक्रो-सीटी डेटा ने इस परिकल्पना को भी मान्य किया कि स्कैपुला के पीछे के कोण टी 7 के साथ फ्लश नहीं होते हैं, भले ही माउस उनकी प्राकृतिक या विशिष्ट शरीर की स्थिति में हो। मैकडोनो एट अल.14 ने माउस के धनुषाकार होने पर पीठ के उच्चतम बिंदु का पता लगाने और उच्चतम बिंदु को टी 12 के रूप में परिभाषित करने का भी उल्लेख किया। तुलनात्मक रूप से, वर्तमान शोध में, टी 9 टी 12-टी 13 इंटरस्पिनस स्पेस की सहायता से स्थित है, जो माउस की मुद्रा से न तो जुड़ा हुआ है और न ही प्रभावित है। इसके अलावा, इस विधि के साथ, लक्ष्य कशेरुक को आसानी से स्थित और संचालित किया जा सकता है। माइक्रोस्कोप के नीचे 13 वीं पसली की जांच करनी चाहिए, धीरे से कॉस्टओवरटेब्रल कोण के क्षेत्र को छूना चाहिए, स्पिनस प्रक्रिया की ओर एक रेखा खींचनी चाहिए, और फिर सिर की ओर टी 12-टी 13 की घुमावदार प्रक्रियाओं के बीच की जगह की जांच करनी चाहिए। शोध दल ने 12 चूहों में से टी 9 का पता लगाने के लिए टी 12-टी 13 इंटरस्पिनस स्पेस का उपयोग किया। अंत में, 12 महिला C57BL / 6J चूहों को T9 स्थान और लैमिनेक्टॉमी के बाद माइक्रो-सीटी स्कैन किया गया था। माइक्रो-सीटी स्कैन के परिणाम ने संकेत दिया कि सभी 12 चूहों में हटाए गए लैमिनेट टी 9 थे। माइक्रो-सीटी के परिणामों से पता चला कि सभी टी 9 सटीक रूप से स्थित थे, और सटीकता स्कैपुला लोकेटिंग विधि की तुलना में काफी अधिक थी। यह विधि हमें पता लगाने का एक तेज़ और सटीक तरीका प्रदान करती है, जो चोट मॉडल की स्थिरता में योगदान देती है।
वर्तमान प्रोटोकॉल की न्यूनतम आक्रामकता मुख्य रूप से तीन पहलुओं में स्पष्ट है। सबसे पहले, पता लगाने के बाद, टी 9 स्तर पर पैरास्पाइनल मांसपेशियों को केवल माइक्रो-रिट्रैक्टर्स द्वारा वापस ले लिया जाता है, टी 8 या टी 10 स्तरों पर मांसपेशियों को नुकसान पहुंचाए बिना। इसके अलावा, माइक्रो-रिट्रैक्टर्स द्वारा लैमिना का जोखिम दृश्य क्षेत्र में हस्तक्षेप नहीं करता है। दूसरा, रक्त की कमी, जो ज्यादातर लैमिनेक्टॉमी से होती है, जो कैंसेलस हड्डी से रक्त बहिर्वाह का कारण बन सकती है, ऑपरेशन प्रक्रिया में बहुत कम है, कपास के 2 मिमी x 2 मिमी x 3 मिमी त्रिकोणीय टुकड़े को दागने की मात्रा से अधिक नहीं है। तीसरा, लैमिनेक्टॉमी सबसे बड़ी सीमा तक आवश्यक क्षेत्र तक सीमित थी, जिससे लैमिना के पार्श्व भाग की निरंतरता बनी रही और कशेरुक अस्थिरता को बहुत कम किया गया। पिछले प्रोटोकॉल16,17 की तुलना में, वर्तमान प्रोटोकॉल बहुत अनावश्यक क्षति को कम करता है।
एससीआई की विभिन्न डिग्री का मूल्यांकन करने के लिए, हिस्टोपैथोलॉजी में सभी समूहों के बीच परिणामों की तुलना पिछले अध्ययनों से पहले से ही 9,11,18 दिखाई गई है। ये परिणाम चोट की विभिन्न डिग्री और विभिन्न अवधियों में परिवर्तन के अवलोकन अध्ययन को पूरा करने के लिए पर्याप्त हैं। एचई और इम्यूनोफ्लोरेसेंस ने दिखाया कि, एससीआई की गंभीरता में वृद्धि के साथ, रीढ़ की हड्डी के ऊतकों में अधिक असामान्य आकृति विज्ञान दिखाई दिया, और क्षति की डिग्री में वृद्धि से रीढ़ की हड्डी के संरचनात्मक विकार की डिग्री में भी वृद्धि हुई। ऊतक आकृति विज्ञान अवलोकन के परिप्रेक्ष्य से, इस अध्ययन में प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह में ऊतक आकृति विज्ञान परिवर्तन की डिग्री और नियमितता पिछले अध्ययनों के साथ अत्यधिक सुसंगत है।
वर्तमान हिस्टोलॉजिकल परीक्षण परिणामों के अनुसार, दर्दनाक एससीआई के विभिन्न डिग्री के बाद विभिन्न संकेतकों में स्पष्ट परिवर्तन का संकेत दिया जाता है, जो इस अध्ययन में स्थापित मॉडल की विश्वसनीयता की पुष्टि करता है।
सटीक और प्रभावी हालांकि तकनीक है, विधियों के लिए संभावित सीमाएं मौजूद हो सकती हैं। लैमिनेक्टॉमी के बारे में, ऑपरेटर को माइक्रोस्कोप के तहत ऑपरेशन के साथ कुशल होना चाहिए ताकि रीढ़ की हड्डी को गलती से क्षतिग्रस्त होने से रोका जा सके। इसके अलावा, पूरे प्लेटफ़ॉर्म का सेटअप यांत्रिक संरचनाओं पर आधारित है, जो स्वचालित उपकरणों की तुलना में ऑपरेटर के लिए उच्च मांग निर्धारित करता है। दरअसल, ऑपरेशन के बार-बार प्रशिक्षण से सभी उल्लिखित समस्याओं में सुधार किया जा सकता है।
यह देखा जा सकता है कि न्यूनतम इनवेसिव और मानकीकृत मॉडलिंग परिणामों को अधिक समान, स्थिर और दोहराने योग्य बनाने, विभिन्न उपचार योजनाओं की प्रभावकारिता का सटीक मूल्यांकन करने और दर्दनाक एससीआई के लिए अनुसंधान योजना को अनुकूलित करने में फायदेमंद है।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान (81930070) के राज्य कुंजी कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था।
4% fixative solution | Solarbio | P1110 | 4% |
Anti-Neurofilament heavy polypeptide antibody | abcam | ab8135 | Dilution ratio (1: 2000) |
Eosin Staining Solution (water soluble) | biosharp | BL727B | |
Ethanol | Fuyu Reagent | 64-17-5 | |
Fluorescent microscope | KEYENCE | BZ-X800 | |
Frozen Slicer | leica | CM3050 S | |
GFAP (GA5) Mouse mAb | Cell Signaling TECHNOLOGY | #3670 | Dilution ratio (1: 600) |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFisher SCIENTIFIC | A32723TR | Dilution ratio (1: 1000) |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 594 | ThermoFisher SCIENTIFIC | A32740 | Dilution ratio (1: 1000) |
Hematoxylin Staining Solution | biosharp | BL702A | |
Mice | Jinan Pengyue Experimental AnimalCompany | C57BL/6J | |
Microsurgery apparatus | Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd | All the surgey instruments are custom-made | Ophthalmic scissors, micro mosquito forceps, microsurgery forceps, micro scissors |
Normal sheep serum for blocking (working solution) | Zhong Shan Jin Qiao | ZLI-9022 | working solution |
O.C.T. Compound | SAKURA | 4583 | |
PBS (phosphate buffered solution) | Solarbio | P1020 | pH 7.2-7.4 |
RWD Laboratory inhalation anesthetic station | RWD Life Science Co., Ltd | R550 | |
Small animal in vivo microCT imaging system | PerkinElmer | Quantum GX2 | |
Spinal cord injury coaxial platform | Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd | Custom-made(Feng's standard) | (https://shop43957633.m.youzan.com/wscgoods/detail/367x5ovgn69q18g?banner_id=f.81386274~goods.7~1~ b0yRFKOq&alg_id=0&slg=tagGood List-default%2COpBottom%2Cuuid %2CabTraceId&components_style_ layout=1&reft=1659409105184&sp m=g.930111970_f.81386274&alias =367x5ovgn69q18g&from_uuid=136 2cc46-ffe0-6886-2c65-01903dbacbb a&sf=qq_sm&is_share=1&shopAuto Enter=1&share_cmpt=native_ wechat&is_silence_auth=1) |
Surgery microscope | Zumax Medical Co., Ltd. | zumax, OMS2355 | |
TBST (Tris Buffered Saline+Tween) | Solarbio | T1082 | Dilution ratio (1: 19) |
Xylene | Fuyu Reagent | 1330-20-7 |