Stabilire un modello di lesione del midollo spinale per contusione murina basato su una tecnica minimamente invasiva

Summary

Tecniche mini-invasive e un semplice dispositivo di laboratorio migliorano la riproducibilità del modello di lesione midollare riducendo il danno operatorio agli animali da esperimento e consentendo il mantenimento della morfologia anatomica. Il metodo è utile perché i risultati affidabili e la procedura riproducibile facilitano le indagini sui meccanismi di riparazione della malattia.

Abstract

L'utilizzo di metodi minimamente invasivi per modellare la lesione del midollo spinale (SCI) può ridurre al minimo le differenze comportamentali e istologiche tra gli animali da esperimento, migliorando così la riproducibilità degli esperimenti.

Questi metodi richiedono due requisiti per essere soddisfatti: chiarezza del percorso anatomico chirurgico e semplicità e praticità del dispositivo di laboratorio. Fondamentalmente per l'operatore, un percorso anatomico chiaro fornisce un'esposizione minimamente invasiva, che evita ulteriori danni all'animale da esperimento durante le procedure chirurgiche e consente all'animale di mantenere una morfologia anatomica coerente e stabile durante l'esperimento.

In questo studio, viene studiato l'uso di una nuova piattaforma integrata chiamata piattaforma coassiale SCI per lesioni del midollo spinale in piccoli animali per esporre il midollo spinale a livello di T9 in modo minimamente invasivo e stabilizzare e immobilizzare la vertebra dei topi utilizzando uno stabilizzatore vertebrale e, infine, un impattatore a gravità coassiale viene utilizzato per contusare il midollo spinale dei topi per avvicinarsi a diversi gradi di lesione del midollo spinale T9. Infine, i risultati istologici sono forniti come riferimento per i lettori.

Introduction

La lesione traumatica del midollo spinale (SCI) predispone facilmente l'individuo a gravi conseguenze¹; Tuttavia, attualmente non esiste un trattamento efficace ^1,2. I modelli di contusione animale sono uno dei principali metodi per studiare SCI ^3,4.

Dal 2004 al 2014⁴, i ratti sono stati utilizzati come organismi modello in 289 dei 407 studi (71%) e i topi in 69 (16,9%). In effetti, la percentuale di esperimenti con topi è gradualmente aumentata nel corso degli anni a causa dei loro vantaggi rispetto ad altri modelli, in particolare il grande potenziale per gli studi di regolazione genica ^3,4,5. Pertanto, sono necessari strumenti più compatibili per condurre più studi utilizzando il mouse come modello a causa della grande importanza attribuita alla coerenza del modello⁶. I dispositivi comuni riportati in studi precedenti sono fondamentalmente basati sul principio di impatto del midollo spinale di Allen, ad esempio, l'impattatore di caduta di peso di base^7,8, l'impattatore ^1,9 della New York University (NYU) / Multicenter Animal Spinal Cord Injury Studies (MASCIS) e l'impattatore^Infinite Horizon (IH)^10,11 . Il dispositivo di impatto a caduta di peso e l'impattatore NYU / MASCIS condividono lo stesso principio di mirare al midollo spinale mirato e far cadere un peso fisso da altezze diverse per ottenere lesioni di gravità diverse. Il dispositivo d'urto IH crea la lesione del midollo spinale in base a forze diverse.

Per comodità nell'utilizzo del modello murino negli studi SCI e per stabilire le basi per metodi di trattamento efficaci, viene sviluppata una piattaforma integrata per lesioni da impatto del midollo spinale del topo, chiamata piattaforma coassiale per lesioni del midollo spinale (SCICP). La piattaforma è composta da quattro componenti principali: (1) un tavolo operatorio per animali progettato per una posizione adatta per topi operati, che è molto compatto e offre praticità senza restrizioni di posizione; (2) un micro-divaricatore su entrambi i lati per trattenere i muscoli paravertebrali durante il funzionamento; (3) uno stabilizzatore vertebrale per trattenere la vertebra prima della procedura di SCI (due stabilizzatori vertebrali sono disponibili per l'operazione su animali più grandi come i ratti); (4) un manicotto, una punta del dispositivo d'impatto, pesi e un perno di trazione. Le tre parti devono essere assemblate su un braccio X-Y-Z rimovibile. Per un targeting preciso, una punta del dispositivo d'urto viene posizionata sulla superficie del midollo spinale e il braccio X-Y-Z viene delicatamente abbassato all'altezza prevista con l'assistenza del segno tra la punta del dispositivo d'urto e il manicotto. La punta del dispositivo d'urto è realizzata in lega di alluminio da 0,12 g per evitare danni al midollo spinale attribuiti a una grande compressione del peso prima della procedura. Il perno di trazione serve a tenere i pesi sulla parte superiore della manica per preparare la caduta di peso (Figura 1).

In studi precedenti, la divisione della forza d'impatto è stata definita in base ai dati della forza d'impatto del dispositivo IH, che sono 30 Kdyn, 50 Kdyn e 70 Kdyn, rispettivamente ^6,10. Durante il processo di ricerca, è stato dimostrato che i gradi seriali dei modelli SCI sono stati stabiliti sulla base di SCICP, che può essere utilizzato in vari studi. Pertanto, prima di iniziare ufficialmente l'esperimento, le forze d'impatto generate da vari pesi di masse diverse sono state testate utilizzando un dispositivo di prova della pressione di picco. Di conseguenza, sono stati selezionati tre modelli di topi SCI rappresentativi standardizzati come tre diversi gradi di lesione, inclusi i gruppi lievi, moderati e gravi, rispettivamente ^6,10, e i pesi sono stati rilasciati alla stessa altezza, con un peso di 1,3 g per il danno lieve, 2,0 g per il moderato e ^2,7 g per i danni gravi.

Come altro mezzo per garantire operabilità e precisione, viene riportato un approccio operativo nuovo e minimamente invasivo. Attraverso la ricerca dell'anatomia dei topi normali, viene trovato un nuovo metodo per localizzare lo spazio interspinoso di T12-T13. Il metodo di localizzazione delle vertebre nelle fasi operative è facile da padroneggiare e preciso, il che garantisce una localizzazione precisa per operazioni minimamente invasive.

Si spera che questa tecnica di lesione da contusione possa aiutare la ricerca e la comprensione della lesione del midollo spinale, compresa la comprensione fisiopatologica, la valutazione della gestione e così via.

Protocol

NOTA: Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal Comitato etico e benessere degli animali da laboratorio dello Shandong University Cheeloo College of Medicine (numero di approvazione: 21L60) e sono stati eseguiti secondo la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio pubblicata dal National Institutes of Health (NIH Publications No. 85-23, revised 1996).

1. Meccanismo della piattaforma coassiale della lesione del midollo spinale e prove meccaniche

1. Assemblare la piattaforma con un tavolo operatorio chirurgico, uno stabilizzatore vertebrale e una punta d'urto (Figura 1).
   NOTA: Mantenere pulite le fessure di caduta di peso e di scarico, che impediscono al peso di incontrare correnti d'aria, perché qualsiasi sporco sulla caduta di peso o sul manicotto potrebbe influire sulla precisione della piattaforma.
2. Inserire la punta, che consente una localizzazione accurata del midollo spinale, nella manica.
3. Selezionare le masse corrette delle gocce di peso per l'esperimento, che sono 1,3 g, 2,0 g e 2,7 g per i gruppi lieve, moderato e grave, rispettivamente.
4. Inserire il perno di trazione nei fori della caduta di peso.
5. Assemblare la caduta di peso sulla parte superiore del manicotto con il perno di trazione inserito nella scanalatura sul braccio X-Y-Z in modo che, una volta completata la localizzazione, il peso venga rilasciato per colpire la punta del dispositivo d'impatto, di conseguenza contenzioso il midollo spinale e si osservino cambiamenti nel midollo spinale al microscopio.
6. Regolare il braccio X-Y-Z di precisione rimovibile da 0,1 mm per la comodità dell'operatore e fornire uno spazio di lavoro adeguato (Figura 1D, E).
   NOTA: Per confermare la coerenza dei risultati dello studio, prima dell'inizio dell'esperimento, misurare la forza generata quando il peso viene lasciato cadere all'interno del manicotto utilizzando un dispositivo di rilevamento della pressione di picco. Una ripetizione della conferma non è necessaria per studi futuri.
7. Accendere il dispositivo, posizionare il recettore di pressione metallica sotto la punta, azzerare l'adattatore, rilasciare il perno di trazione e registrare la forza d'impatto effettiva.

2. Localizzazione e laminectomia della 9a vertebra^toracica (T9)

NOTA: Topi femmina C57BL / 6J di 9-10 settimane sono stati acquistati da Jinan Pengyue Experimental Animal Company (Jinan, Cina).

1. Autoclavare una suite di strumenti chirurgici per l'esperimento e sterilizzare il tavolo operatorio con alcol al 75% prima dell'intervento chirurgico.
2. Iniettare buprenorfina per l'analgesia (0,05-2,0 mg/kg, SQ) 30 minuti prima dell'anestesia per le operazioni di lesione. Quindi, anestetizzare il topo con isoflurano (induzione: ~ 3% -5%, mantenimento: ~ 1,5% -2%). Controlla se l'animale è completamente anestetizzato dai riflessi della coda o del pizzico della punta. Una volta che l'anestesia è in atto, appoggiare il topo in posizione prona in una parte designata del tavolo operatorio e rivestire la cornea con unguento oftalmico (applicare unguento oftalmico alle cornee per proteggere gli occhi dall'asciugatura durante l'intervento chirurgico).
   1. Rasare i capelli dalla caudale al rostrale con un rasoio elettrico sulla colonna vertebrale toracolombare. Sterilizzare la pelle più volte con un movimento circolare con iodophor per 30 s e seguito da alcol al 75%. Applicare un drappo chirurgico sterile e praticare un'incisione longitudinale di circa 1,5 cm sulla pelle da circa T6 a T13 con bisturi e lama.
      NOTA: Palpare lungo il margine costale fino alla linea mediana, dove si trova lo spazio interspinoso T12-T13. Fai un'incisione di 1,5 cm al rostrale e l'incisione è approssimativamente a filo con vertebre T6-T13.
3. Esplora la 13a costola su un lato dalla parte ossea sotto il microscopio operatorio. Esplora il processo spinoso nella linea mediana toccando leggermente l'area dell'angolo costovertebrale e poi verso il rostrale per individuare lo spazio interspinoso del T12-T13. Esplora lo spazio interspinoso del T9-T10 dallo spazio del T12-T13 al lato rostrale. (Figura 2A, 3A)
4. Sezionare il muscolo paraspinale lungo il processo spinoso del T9 fino alle faccette articolari anteriori e posteriori di entrambi i lati con micro forbici (Figura 3B). Ritrarre i muscoli paraspinali con micro-divaricatori e pulire il tessuto molle sulla lamina e nello spazio interspinoso del T8-T9 e T9-T10 con micro forbici.
5. Eseguire la laminectomia T9, bloccare il processo spinoso di T9 con una pinza da microchirurgia, sollevarla leggermente, inserire le micro forbici parallelamente lungo il lato dorsolaterale destro della lamina, evitando danni al midollo spinale e tagliare la lamina con micro forbici. Ripeti sul lato sinistro e il midollo spinale può essere esposto (Figura 2B, 3C).
6. Prima di fissare la vertebra, allentare il braccio universale e bloccare lentamente le articolazioni delle faccette dal 9 ° al 10 ° su entrambi i lati della vertebra con la micro pinza per zanzare dello stabilizzatore vertebrale. Stringere le viti sulle micro pinze per zanzare e la vertebra è così stabilizzata. Regolare il midollo spinale sul piano orizzontale, stringere il braccio universale e la vertebra è fissa (Figura 3D).

3. Lesione da contusione T9

1. Una volta che il midollo spinale di livello T9 è esposto e la vertebra è fissa, mirare al midollo spinale dalla punta all'interno della manica sotto il microscopico operativo (Figura 3E).
2. Controllare se la superficie della punta è parallela al midollo spinale dagli aspetti posteriori e laterali del midollo spinale, poiché è facile osservare la relazione tra il midollo spinale e la punta al microscopio e che il tavolo operatorio può essere ruotato facilmente.
3. Controllare se la superficie della punta è parallela ai bordi bilaterali della lamina risparmiata prima che la punta sia in contatto con il midollo spinale dopo la laminectomia poiché è un piano di riferimento naturale parallelo al midollo spinale.
4. Dopo aver individuato lo spazio interspinoso del T12-T13, abbassare il manicotto fino a quando l'estremità del dispositivo d'urto è coerente con il segno sulla finestra di osservazione e viene raggiunta l'altezza specificata di 22 mm. Estrarre il perno di trazione per rilasciare il peso (1,3 g, 2,0 g o 2,7 g a seconda del gruppo, con ogni gruppo che include 3 topi e ogni gruppo ha un mouse per ogni punto temporale).
   NOTA: Il midollo spinale deve essere parallelo al suolo e perpendicolare alla punta; Spostare il tavolo operatorio per garantire il campo visivo microscopico, poiché il tavolo è molto compatto.
5. Rimuovere il dispositivo d'urto quando la contusione è terminata e osservare il grado di SCI al microscopio operatorio. Nel gruppo lieve, si può osservare un'alterazione del colore rosso chiaro, mentre nel gruppo moderato, il sito della lesione mostra un rosso scuro in 3-4 s e, possibilmente, si può osservare l'eminenza. Nel gruppo grave, le manifestazioni rosso scuro possono apparire immediatamente e si manifesta un'evidente eminenza nella dura, ma la dura è ancora in una forma coerente (Figura 3F).
6. Suturare la fascia superficiale e la pelle con punti di sutura (sutura in polipropilene non assorbibile, taglia: 6-0).
7. Dopo aver completato la sutura, sterilizzare l'area chirurgica, posizionare il mouse su un pad a temperatura controllata fino a ripristinare la piena consapevolezza, quindi mettere il topo nelle gabbie del topo.

4. Cura degli animali

1. Posizionare l'animale sulla piastra elettrica per il recupero e osservare il movimento di entrambi gli arti posteriori.
   NOTA: Gli animali sottoposti a intervento chirurgico non devono essere restituiti alla compagnia di altri animali fino a quando non sono completamente guariti.
2. Metti una dieta ricca di acqua sul pavimento della gabbia in modo che gli animali possano facilmente raggiungere il cibo. In alternativa, utilizzare una gabbia con un tavolo di alimentazione inferiore.
3. Svuotare le vesciche dei topi due volte al giorno dopo l'operazione perché è difficile per i gruppi di lesioni moderate e gravi recuperare la funzione della vescica. Iniettare buprenorfina per analgesia (0,05-2,0 mg/kg, SQ) 8-12 h/die per 3 giorni.

5. Perfusione transcardica, colorazione e immunocolorazione

1. Il 1 °, 28 ° e 56 ° giorno dopo l'infortunio, sacrificare un topo di ciascun gruppo, rispettivamente, per perfusione.
   1. Perfondere i topi con 60 mL di soluzione salina tamponata fosfato (PBS) e 20 ml di paraformaldeide al 4% dopo anestesia eccessiva (4%-6% isoflurano).
   2. Raccogliere la colonna vertebrale con micro forbici, estendendo rostralmente e caudalmente 1 cm, rispettivamente, dal centro della lesione.
   3. Resecare i muscoli in eccesso, riservare segmenti della colonna vertebrale intatti con costole parziali per gli strumenti da tenere al punto 5.1.4 e immergerlo in paraformaldeide al 4% per 24 ore.
   4. Bloccare le costole con una pinza emostatica per la fissazione e definire il centro della lesione al microscopio in base alla lamina resecata e all'alterazione del colore nel centro della lesione del midollo spinale.
   5. Resecare tutte le lamine e i processi articolari con micro forbici dalla caudale.
   6. Tagliare le radici nervose con micro forbici ed estrarre il midollo spinale.
   7. Raccogliere 0,5 cm del midollo spinale che si estende caudalmente e rostralmente, rispettivamente, dal centro della lesione con micro forbici.
   8. Mettere il midollo spinale in saccarosio al 30% a 4 °C per 48 ore.
2. Tagliare i tessuti in sezioni spesse 6 μm dopo il congelamento secondo il tipo di esame istologico.
3. Eseguire la colorazione con ematossilina ed eosina (H & E).
   1. Riscaldare nuovamente le sezioni a temperatura ambiente e immergere le sezioni spesse 6 μm in formaldeide al 4% per circa 15 minuti, quindi immergere in 1x PBS per 1 minuto quattro volte per rimuovere l'OCT residuo.
   2. Macchiare le sezioni con ematossilina per 90 s e risciacquare con acqua bidistillata.
   3. Quindi, lavare le sezioni con acqua corrente per 3 minuti.
   4. Colorare con eosina per 4 minuti e immergere in alcool al 95% per 30 s due volte per risciacquare l'eosina in eccesso.
   5. Infine, disidratare con alcool sfumato (95% alcol e 50% alcol una volta, successivamente) per 30 s e immergere in xilene per trasparenza per 2 minuti. Quindi, sigillare i campioni con gel di resina (sezione del piano coronale: Figura 4; sezione del piano sagittale: Figura 5).
4. Eseguire la colorazione immunofluorescente.
   1. Riscaldare nuovamente le sezioni a temperatura ambiente e immergere le sezioni spesse 6 μm in formaldeide al 4% per circa 2 minuti.
   2. Lavare le sezioni in TBST per 5 minuti per tre volte.
   3. Incubare le sezioni con soluzione bloccante (siero normale di capra al 10% in PBS) e bloccare per 1 ora per bloccare il legame non specifico dell'immunoglobulina.
   4. Incubare le sezioni del midollo spinale per una notte a 4 °C con la proteina acida fibrillare anti-glia del topo (GFAP, un marker per gli astrociti reattivi), l'anticorpo policlonale (1:600) e l'anticorpo anti-NF200 del coniglio (1:2000), un marker per il neurofilamento in 0,4 ml di soluzione bloccante.
   5. Risciacquare le sezioni con PBS e aggiungere 0,4 ml di soluzione bloccante con anticorpi secondari IgG (1:1.000) coniugati Alexa 594 anti-coniglio di capra e IgG coniugati Alexa 488 (1:1.000) di capra per 1 ora a temperatura ambiente.
   6. Scatta immagini con un microscopio fluorescente a 10x mediante scansione panoramica automatica a lunghezze d'onda rispettivamente di 594 nm e 488 nm (Figura 6).
      1. Accendere il microscopio a fluorescenza, posizionare il vetrino sul palco del microscopio, passare al canale di fluorescenza, utilizzare il tasto di posizionamento per posizionare tre o quattro punti sul tessuto e concentrarsi per completare lo scatto. Dopo aver terminato lo scatto, salvare le immagini di diversi canali nel formato desiderato, quindi salvare l'immagine unita.

Results

Per testare la precisione del dispositivo, la forza che tre diverse masse di pesi hanno fatto dalla stessa altezza è stata misurata utilizzando un dispositivo di prova della pressione di picco. Sono state effettuate ventiquattro prove con gruppi di pesi variabili, ottenendo (media ± DS) 0,323 N ± 0,02 N per pesi da 1,3 g, 0,543 N ± 0,15 N per pesi da 2,0 g e 0,723 N ± 0,26 N per pesi da 2,7 g (Figura 7). Studi precedenti hanno adottato dyne (dyn) o Kilodyne (Kdyn) come unità per misurare le intensità della contusione. Per un migliore confronto con studi precedenti, sono elencate le conversioni tra Newton (N) e dyne/kilodyne (1 N = 1 kg × 1 m/s 2 = 1 × 10 3 g × 1 × 100 cm/s² = 1 × 10⁵ dyn; 0,323 N = 32,3 Kdyn; 0,543 N = 54,3 Kdyn; 0,723 N = 72,3 Kdyn).

La Tabella 1 e la Figura 4 mostrano i dati delle lesioni dei gruppi lieve, moderato e grave sulle sezioni coronali. A giudicare dalla Figura 4, il 28 ° giorno dopo l'infortunio, la continuità dei confini distinguibili della sostanza grigia e bianca nei gruppi lieve, moderato e grave è diminuita successivamente, con l'area del tessuto cicatriziale che cresce e una proporzione crescente sulla sezione trasversale del centro della lesione. C'erano evidenti differenze morfologiche in tutti i gruppi sperimentali rispetto al gruppo normale. Ciò ha dimostrato la razionalità della divisione dei gradi di lesione nei gruppi sperimentali.

La Tabella 2 e la Figura 5 descrivono la lesione del midollo spinale nel 1° e 56° giorno dopo l'infortunio sulle sezioni sagittali. Si può vedere che l'area della lesione è gradualmente aumentata significativamente dai gruppi lievi a gravi il 1 ° giorno dopo l'infortunio. Nel frattempo, la continuità della sostanza bianca su entrambi i lati del midollo spinale era migliore nel gruppo lieve, con piccoli vacuoli rotondi osservabili, che sono le caratteristiche dell'edema interstiziale. Nel gruppo moderato, la sostanza bianca mostrava scarsa continuità e la struttura della sostanza bianca ventrale non era ordinata. Nel gruppo grave, la sostanza bianca ventrale ha mostrato un'interruzione più grave e una vasta area della cavità è apparsa al centro della lesione. Inoltre, il tessuto circostante ha mostrato un evidente riempimento dei globuli rossi e i globuli rossi vicino al canale centrale si sono riuniti in strisce. Il 56 ° giorno dopo l'infortunio, è stata osservata la formazione di cicatrici nel centro della lesione dei tre gruppi, la cui area è aumentata in base alla gravità della lesione.

L'integrità del neurofilamento del midollo spinale al 56° giorno dopo l'infortunio può anche essere derivata dall'analisi dei risultati della colorazione con immunofluorescenza (Figura 6). La figura mostra anche che gli astrociti sovrapposti che formano cicatrici erano visibili al centro di tutti e tre i gruppi di lesioni, con la lunghezza dell'area della lesione che aumentava con la gravità della lesione, mentre il diametro della cicatrice diminuiva. Ciò suggerisce la presenza di contrattura cicatriziale, che può portare ad una diminuzione del diametro del midollo spinale.

Figura 1: Esposizione in tutto e in parti della piattaforma coassiale per lesioni del midollo spinale. (A) Il braccio X-Y-Z e il tavolo operatorio possono essere separati, il che lascia spazio sufficiente per la procedura operativa durante la quale il midollo spinale di un piccolo animale è esposto. Il tavolo operatorio può essere spostato liberamente durante il funzionamento, riducendo la potenziale difficoltà operativa attribuita ai limiti di posizione. Il corpo dello stabilizzatore vertebrale ha un braccio universale a tre articolazioni per l'assistenza alla direzione, che aumenta la sua flessibilità. (B) Inserire la punta del dispositivo d'urto nel manicotto e assemblare quest'ultimo nel braccio X-Y-Z. Inserire la punta del perno di trazione nei fori del peso per evitare che il peso cada e posizionare il peso nella manica. Con le parti assemblate, individuare l'area della lesione mirata al microscopio. Quindi, abbassare il braccio X-Y-Z fino a quando la fine della punta del dispositivo d'urto è coerente con il livello inferiore della finestra di osservazione, che indica che è stata raggiunta un'altezza di contusione unificata (l'altezza tra il peso e la punta del dispositivo d'urto è di 22 mm quando inizia la caduta). Tira il perno di trazione e l'impatto sarà fatto. (C) Dopo che l'area della lesione è stata esposta, utilizzare le clip per bloccare e fissare la colonna vertebrale del mouse e il bullone di serraggio per stabilizzare lo stabilizzatore vertebrale. (D) Funzioni consigliate per le scanalature sul tavolo operatorio. L'animale da esperimento dovrebbe essere messo nel solco centrale, con la testa verso la parte anteriore toracica sul pendio. Il braccio X-Y-Z è separato dal tavolo operatorio. (E) Una visualizzazione del SCIC assemblato. Le frecce indicano le parti. Con la punta che mira all'area di contusione bersaglio, per iniziare la contusione, estrarre il perno di trazione e il peso cadrà sulla punta del dispositivo d'urto per contusare il midollo spinale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Un grafico di imaging del metodo di localizzazione delle vertebre costovertebrali T13. (A) La 13a costola e T13 sono strutture anatomiche relativamente costanti. L'angolo costovertebrale T13 può essere facilmente rilevato al microscopio, dal quale l'operatore può sondare verso il processo spinoso e trovare lo spazio interspinoso T12-T13. Quindi, sondare successivamente verso il lato rostrale per trovare la vertebra della lesione bersaglio (ad esempio, T9). (B) Una laminectomia toracica 9° minimamente invasiva può preservare adeguate articolazioni della lamina e delle faccette tra i corpi vertebrali adiacenti. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Esposizione e contusione del midollo spinale di livello T9 nei topi . (A) Sondare l'angolo costovertebrale T13. (B) Con il muscolo paraspinale retratto da micro-divaricatori per creare spazio adeguato per il funzionamento, esporre il T9. (C) Condurre la laminectomia T9 con micro forbici. (D) Stabilizzare la vertebra con le clip dello stabilizzatore vertebrale. (E) Puntare all'area bersaglio di contusione con la punta del dispositivo d'urto. (F) Edema e congestione sono notati nell'area della lesione dopo la contusione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Sezioni rappresentative il 28° giorno dopo diversi gradi di SCI nei topi (sezioni coronali). (A) Midollo spinale toracico normale del topo. Barra della scala = 500 μm. (B) Per il gruppo lieve, si può notare una leggera lesione nell'aspetto dorsale del midollo spinale, mentre la morfologia della sostanza bianca risparmiata e della materia grigia è sostanzialmente preservata. (C) Per il gruppo moderato, si osserva tessuto cicatriziale evidente nel midollo spinale (indicato dall'asterisco rosso). Le caratteristiche differenziative tra sostanza bianca e materia grigia possono a malapena essere distinte. (D) Comparativamente, il midollo spinale del gruppo grave ha quasi perso la sua morfologia originale ed è stato quasi sostituito da tessuto cicatriziale. La linea tratteggiata verde indica l'area del danno e la linea tratteggiata nera indica il confine della materia grigia osservabile. Con l'aumentare della gravità della lesione, una lesione più grande e una struttura meno risparmiata apparvero nel midollo spinale del topo, con il bordo della materia grigia appena distinguibile. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 5: Sezioni rappresentative al 1° e al 56° giorno dopo la lesione del midollo spinale dei topi (sezioni sagittali). (A) Midollo spinale toracico normale del topo. (B) B1-B3 rappresentano, rispettivamente, il midollo spinale il 1 ° giorno dopo la lesione nei gruppi lieve, moderato e grave. Si può vedere che, con l'aumentare del danno, un'area più ampia è stata interrotta o liquefatta nel centro della lesione. La continuità della sostanza bianca nel midollo spinale ventrale differiva a causa delle diverse intensità della lesione. B1 mostra che la sostanza bianca nel midollo spinale ventrale ha una migliore continuità con un leggero edema. B2 mostra una scarsa continuità della sostanza bianca nel midollo spinale ventrale e un edema più grave. Il tessuto al centro della SCI B3 ha perso quasi tutta la continuità e c'è un edema esteso nell'area al di fuori del centro della lesione. (C) C1-C3 rappresentano, rispettivamente, il midollo spinale il 56 ° giorno dopo la lesione nei gruppi lieve, moderato e grave. Diversi gradi di contrattura cicatriziale si sono manifestati nel centro della lesione tra i diversi gruppi e c'era una differenza significativa nel diametro dell'area della lesione. Barra di scala = 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 6: Sezioni rappresentative al 56° giorno dopo la lesione del midollo spinale nei topi (sezioni sagittali). (A) Sezione rappresentativa del gruppo lieve. NF200 indica il neurofilamento, mentre GFAP indica astrociti. Gli astrociti sovrapposti sono osservati nell'epicentro della lesione, mentre il neurofilamento nella parte ventrale del midollo spinale è in buona continuità. (B) Sezione rappresentativa del gruppo moderato. Si possono osservare due centri cicatriziali (indicati da asterischi rossi) oltre agli astrociti sovrapposti, mentre il neurofilamento nell'aspetto ventrale ha continuità. (C) Sezione rappresentativa del gruppo grave, con un ampio intervallo di lesioni e astrociti massicci che formano cicatrici. Non è osservato un centro cicatriziale evidente e il neurofilamento ha scarsa continuità. Barra di scala = 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 7: Forza generata dalla stessa altezza ma con pesi diversi. Prima dell'esperimento, la forza generata da diverse masse di pesi rilasciati dalla stessa altezza è stata rilevata utilizzando un dispositivo di rilevamento della pressione di picco. Dopo che ogni gruppo ha completato 24 rilevamenti, sono stati ottenuti dati di gravità più affidabili per il riferimento della forza d'urto. I dati sono stati analizzati utilizzando il software statistico SPSS19.0. I dati sono presentati come media ± DS, n = 24 in ciascun gruppo. I confronti tra più gruppi erano basati su un'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) utilizzata per testare le differenze; p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

28 punti per pollice (dpi)
Gruppo	GMR (%)	WMR (%)	DR (%)
Normale	35.44	64.57	0
Lieve	11.59	64.88	23.53
Moderato	0	41.14	58.86
Forte	0	0	100

Tabella 1: Tasso di sostanza bianca, materia grigia e danno al 28 ° giorno dopo l'infortunio. Abbreviazioni: dpi = giorni post-infortunio, DA = area danneggiata; GMR = tasso di materia grigia; WMR = tasso di sostanza bianca; DR = tasso danneggiato.

Gruppo	1dpi DA (μm2)	56dpi DA (μm2)
Normale	0	0
Lieve	2391250	666091
Moderato	4383381	1263191
Forte	5118833	1943962

Tabella 2: Confronti tra la lesione sulle sezioni sagittali al 1 ° e 56 ° giorno dopo l'infortunio.

Discussion

Attraverso la procedura standardizzata, è possibile ottenere dati stabili, specialmente negli esperimenti in vivo su piccoli animali, che possono ridurre al minimo la deviazione dei risultati causata dalle differenze individuali tra gli animali. Sulla base delle condizioni di cui sopra e di strumenti applicativi convenienti, è possibile stabilire modelli SCI standardizzati, minimamente invasivi, accurati e ripetibili.

Grazie alla sua praticabilità e praticità, in precedenza, il dispositivo di impatto a caduta di peso veniva utilizzato principalmente³. L'impattatore introdotto in questo studio condivide lo stesso principio con il modello¹² di Allen. Fortunatamente, grazie agli accurati vantaggi di produzione della moderna tecnologia di lavorazione, il team di ricerca ha progettato un dispositivo di impatto a caduta di peso con i vantaggi di essere facile da usare, fortemente stabile e raramente impreciso. Un dispositivo di rilevamento della pressione di picco è stato utilizzato per misurare la gravità di diversi pesi. Precedenti studi^6,10 sull'impattatore Infinite Horizons hanno riportato che una gamma di forza di ±5 Kdyn che devia dalla forza prevista è accettata nei gruppi 30 Kdyn, 50 Kdyn e ⁷⁰ Kdyn^, che fornisce un riferimento per il presente studio in termini di divisione del gruppo e selezione del grado di contusione. Nella presente ricerca, la possibile forza di diversi gruppi è stata misurata in anticipo e sono stati ottenuti dati più accurati.

Più critico del dispositivo negli esperimenti su modelli animali è la comprensione e l'utilizzo dell'anatomia del topo. Fare buon uso dell'anatomia può rendere le procedure minimamente invasive. La chirurgia minimamente invasiva influisce direttamente sulla stabilità dello stato funzionale dell'animale da esperimento e sulla consistenza del successivo recupero del topo. Studi precedenti hanno dimostrato che l'istituzione minimamente invasiva di modelli SCI aumenta la stabilità della struttura vertebrale ed evita ulteriori danni causati dall'instabilità spinale durante il recupero nei ratti¹. La premessa della chirurgia minimamente invasiva è l'uso ragionevole di strutture anatomiche naturali. Pertanto, la localizzazione rapida e precisa dei segmenti del midollo spinale dovrebbe essere effettuata in conformità con la struttura anatomica dei topi. Come riportato, il metodo di imaging è stato utilizzato per trovare la vertebra¹³. Sebbene abbia un'elevata precisione, nell'effettivo processo operativo sperimentale, il metodo di imaging per la localizzazione presenta gli svantaggi di un funzionamento scomodo, tempi di funzionamento lunghi, acquisizione di apparecchiature complesse e requisiti di elevata precisione delle apparecchiature. McDonough et al. hanno descritto la localizzazione del T7 attraverso gli angoli inferiori delle scapole¹⁴, mentre i topi agiscono in una bugia prostrata, quindi gli angoli inferiori menzionati dovrebbero essere angoli posteriori. Inoltre, l'utilizzo delle punte scapolari inferiori per trovare il T7 è un metodo di localizzazione per una posizione specifica nell'anatomia umana¹⁵, che non è adatto per i topi. Infine, i dati Micro-CT hanno anche convalidato l'ipotesi che gli angoli posteriori delle scapole non siano a filo con T7 indipendentemente dal fatto che il topo sia nella loro posizione naturale o specifica del corpo. McDonough et ^al.14 hanno anche menzionato la localizzazione del punto più alto della schiena quando il topo è arcuato e la definizione del punto più alto come T12. Comparativamente, nella presente ricerca, il T9 si trova con l'assistenza dello spazio interspinoso T12-T13, che non è né associato né influenzato dalla postura del topo. Inoltre, con questo metodo, la vertebra bersaglio può essere facilmente localizzata e operata. Si dovrebbe sondare la 13a costola al microscopio, toccare delicatamente l'area dell'angolo costovertebrale, tracciare una linea verso il processo spinoso, quindi sondare lo spazio tra i processi spinosi del T12-T13 verso la testa. Il team di ricerca ha utilizzato lo spazio interspinoso T12-T13 per localizzare il T9 di 12 topi. Infine, 12 topi femmina C57BL / 6J sono stati sottoposti a una scansione Micro-CT dopo la posizione T9 e la laminectomia. Il risultato della scansione Micro-CT ha indicato che le lamine rimosse in tutti i 12 topi erano T9. I risultati del Micro-CT hanno mostrato che tutti i T9 erano localizzati con precisione e la precisione era significativamente superiore rispetto al metodo di localizzazione della scapola. Questo metodo ci fornisce un modo rapido e preciso per localizzare, che contribuisce alla coerenza del modello di lesione.

La minima invasività del presente protocollo è pronunciata principalmente in tre aspetti. In primo luogo, dopo la localizzazione, i muscoli paraspinali a livello T9 vengono retratti solo da micro-divaricatori, senza danneggiare i muscoli a livello T8 o T10. Inoltre, l'esposizione della lamina da parte dei micro-divaricatori non interferisce con il campo visivo. In secondo luogo, la perdita di sangue, che è principalmente da laminectomia, che può causare il deflusso di sangue dall'osso spugnoso, è molto bassa nella procedura operativa, quasi non più del volume per macchiare un pezzo triangolare di cotone di 2 mm x 2 mm x 3 mm. In terzo luogo, la laminectomia è stata condotta limitatamente all'area necessaria nella misura massima, mantenendo la continuità della parte laterale della lamina e attenuando notevolmente l'instabilità delle vertebre. Rispetto ai precedenti protocolli^16,17, il protocollo attuale riduce molti danni inutili.

Per valutare i diversi gradi di SCI, i risultati tra tutti i gruppi in istopatologia sono stati confrontati con ciò che studi precedenti hanno già mostrato 9,11,18. Questi risultati sono sufficienti per completare uno studio osservazionale di diversi gradi di lesioni e cambiamenti in diversi periodi. L'HE e l'immunofluorescenza hanno dimostrato che, con l'aumento della gravità della SCI, è comparsa una morfologia più anormale nel tessuto del midollo spinale e l'aumento del grado di danno ha anche portato ad un aumento del grado di disordine strutturale del midollo spinale. Dal punto di vista dell'osservazione della morfologia tissutale, il grado e la regolarità dei cambiamenti della morfologia tissutale in ciascun gruppo sperimentale in questo studio sono altamente coerenti con gli studi precedenti.

Secondo gli attuali risultati dei test istologici, sono indicati chiari cambiamenti in vari indicatori dopo diversi gradi di SCI traumatico, il che conferma ulteriormente l'affidabilità del modello stabilito in questo studio.

Per quanto accurata ed efficace sia la tecnica, potrebbero esistere potenziali limitazioni per i metodi. Per quanto riguarda la laminectomia, l'operatore dovrebbe essere abile con operazioni al microscopio per evitare che il midollo spinale venga danneggiato per errore. Inoltre, la configurazione dell'intera piattaforma si basa su strutture meccaniche, impostando una maggiore domanda per l'operatore rispetto alle apparecchiature automatizzate. In effetti, tutti i problemi menzionati possono essere migliorati ripetendo l'addestramento dell'operazione.

Si può vedere che la modellazione minimamente invasiva e standardizzata è utile nel rendere i risultati più uniformi, stabili e ripetibili, valutando accuratamente l'efficacia dei vari piani di trattamento e ottimizzando il piano di ricerca per la SCI traumatica.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Soluzione fissativa al 4%	Solarbio	P1110	Anticorpo
polipeptidico pesante anti-neurofilamento	abcam	ab135	Rapporto di diluizione (1: 2000)
Soluzione colorante eosina (solubile in acqua)	biosharp	BL727B
Reagente Fuyu etanolo		64-17-5
Microscopio fluorescente	KEYENCE	BZ-X800
Affettatrice per Surgelati	leica	CM3050 S
GFAP (GA5) Mouse mAb	Cell Signaling TECHNOLOGY#	3670	Rapporto di diluizione (1: 600)
Anticorpo secondario altamente adsorbito anti-topo di capra (H+L), Alexa Fluor Plus 488	ThermoFisher SCIENTIFIC	A32723TR	Rapporto di diluizione (1: 1000)
Anticorpo secondario altamente adsorbito anti-coniglio di capra (H+L), Alexa Fluor Plus 594	ThermoFisher SCIENTIFIC	A32740	Rapporto di diluizione (1: 1000)
Ematossilina Soluzione colorante	biosharp	BL702A
Topi	Jinan Pengyue Animale sperimentaleCompany	C57BL/6J
Apparecchio per microchirurgia	Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd	Tutti gli strumenti chirurgici sono	forbici oftalmiche su misura, micro pinze per zanzare, pinze per microchirurgia, micro forbici
Siero di pecora normale per il blocco (soluzione di lavoro)	Zhong Shan Jin Qiao	ZLI-9022	soluzione di lavoro
OCT Composto	SAKURA	4583
PBS (soluzione tamponata con fosfato)	Solarbio	P1020	pH 7.2-7.4
RWD Stazione di anestesia per inalazione di laboratorio	RWD Life Science Co., Ltd	R550
Sistema di imaging microCT in vivo per piccoli animali	PerkinElmer	Quantum GX2
Piattaforma coassiale per lesioni del midollo spinale	Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd	Su misura (standard di Feng)	(https://shop43957633.m.youzan.com/wscgoods/detail/367x5ovgn69q18g?banner_id=f.81386274~goods.7~1~ b0yRFKOq& alg_id=0& slg=tagGood List-default%2COpBottom%2Cuuid %2CabTraceId& components_style_ layout=1& reft=1659409105184& sp m=g.930111970_f.81386274& alias =367x5ovgn69q18g& from_uuid=136 2cc46-ffe0-6886-2c65-01903dbacbb a& sf=qq_sm& is_share=1& shopAuto Invio=1& share_cmpt=native_ wechat& is_silence_auth=1)
Microscopio chirurgico	Zumax  Fornitore verificato - Medical Co., Ltd.	zumax, OMS2355
TBST (Tris Buffered Saline+Tween)	Solarbio	T1082	Rapporto di diluizione (1: 19)
Reagente xilene	Fuyu	1330-20-7