تقييم الخصائص المفترضة المضادة للخفيات للمستخلصات الخام والموضحة من الرخويات
Summary
ينتج العامل الممرض الفطري البشري Cryptococcus neoformans مجموعة متنوعة من عوامل الفوعة (مثل الببتيداز) لتعزيز بقائه داخل المضيف. تمثل المنافذ البيئية مصدرا واعدا لمثبطات الببتيداز الطبيعية الجديدة. يحدد هذا البروتوكول تحضير المستخلصات من الرخويات وتقييم تأثيرها على إنتاج عامل الفوعة الفطرية.
Abstract
Cryptococcus neoformans هو أحد مسببات الأمراض الفطرية البشرية المغلفة مع توزيع عالمي يصيب في المقام الأول الأفراد الذين يعانون من نقص المناعة. أدى الاستخدام الواسع النطاق لمضادات الفطريات في البيئات السريرية ، واستخدامها في الزراعة ، وتهجين السلالة إلى زيادة تطور المقاومة. هذا المعدل المتزايد للمقاومة ضد مضادات الفطريات هو مصدر قلق متزايد بين الأطباء والعلماء في جميع أنحاء العالم ، وهناك حاجة ملحة متزايدة لتطوير علاجات جديدة مضادة للفطريات. على سبيل المثال ، تنتج C. neoformans العديد من عوامل الفوعة ، بما في ذلك الإنزيمات داخل وخارج الخلية (على سبيل المثال ، الببتيداز) مع أدوار في تدهور الأنسجة ، والتنظيم الخلوي ، واكتساب المغذيات. إن تعطيل نشاط الببتيداز هذا بواسطة مثبطات يزعج نمو الفطريات وتكاثرها ، مما يشير إلى أن هذه قد تكون استراتيجية مهمة لمكافحة العامل الممرض. الأهم من ذلك ، أن اللافقاريات مثل الرخويات تنتج مثبطات الببتيداز مع التطبيقات الطبية الحيوية والنشاط المضاد للميكروبات ، لكنها غير مستكشفة من حيث استخدامها ضد مسببات الأمراض الفطرية. في هذا البروتوكول ، تم إجراء استخراج عالمي من الرخويات لعزل مثبطات الببتيداز المحتملة في المستخلصات الخام والموضحة ، وتم تقييم آثارها ضد عوامل ضراوة المكورات العقدية الكلاسيكية. تدعم هذه الطريقة تحديد أولويات الرخويات ذات الخصائص المضادة للفطريات وتوفر فرصا لاكتشاف العوامل المضادة للضراوة من خلال تسخير المثبطات الطبيعية الموجودة في الرخويات.
Introduction
Cryptococcus neoformans هو أحد مسببات الأمراض الفطرية البشرية التي تنتج مرضا شديدا في المضيفين الذين يعانون من نقص المناعة ، مثل الأفراد المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية / الإيدز1 ، ويؤدي إلى ما يقرب من 19 ٪ من الوفيات المرتبطة بالإيدز2. الفطر عرضة لعدة فئات من مضادات الفطريات ، بما في ذلك الأزول ، البوليين ، والفلوسيتوسين ، والتي تمارس نشاط مبيد للفطريات والفطريات باستخدام آليات متميزة 3,4. ومع ذلك ، فإن الاستخدام المكثف لمضادات الفطريات في البيئات السريرية والزراعية جنبا إلى جنب مع تهجين السلالة قد أدى إلى تضخيم تطور المقاومة في أنواع فطرية متعددة ، بما في ذلك C. neoformans5.
للتغلب على تحديات المقاومة المضادة للفطريات والحد من انتشار الالتهابات الفطرية على نطاق عالمي ، يتمثل النهج الواعد في استخدام عوامل الفوعة ل Cryptococcus spp. (على سبيل المثال ، القدرة على التكيف مع درجة الحرارة ، وكبسولة السكاريد ، والميلانين ، والإنزيمات خارج الخلية) كأهداف علاجية محتملة 4,6 . هذا النهج له العديد من المزايا ، حيث أن عوامل الفوعة هذه موصوفة جيدا في الأدبيات ، واستهداف هذه العوامل يمكن أن يقلل من معدلات المقاومة المضادة للفطريات عن طريق فرض ضغط انتقائي أضعف من خلال إضعاف الفوعة بدلا من استهداف نمو الخلايا6. في هذا السياق ، قيمت العديد من الدراسات إمكانية استهداف الإنزيمات خارج الخلية (على سبيل المثال ، البروتياز والببتيداز) لتقليل أو تثبيط ضراوة Cryptococcus spp.7،8،9.
الكائنات الحية مثل اللافقاريات والنباتات لا تمتلك جهاز مناعة تكيفي لحماية نفسها من مسببات الأمراض. ومع ذلك ، فإنهم يعتمدون على نظام مناعي فطري قوي مع مجموعة هائلة من المركبات الكيميائية للتعامل مع الكائنات الحية الدقيقة والحيوانات المفترسة10. تشمل هذه الجزيئات مثبطات الببتيداز ، والتي تلعب أدوارا مهمة في العديد من الأنظمة البيولوجية ، بما في ذلك العمليات الخلوية لمناعة اللافقاريات ، مثل تخثر الدملمف ، وتوليف السيتوكينات والببتيدات المضادة للميكروبات ، وحماية المضيفين عن طريق تعطيل البروتياز من مسببات الأمراض مباشرة11. وبالتالي ، فإن مثبطات الببتيداز من اللافقاريات مثل الرخويات تمتلك تطبيقات طبية حيوية محتملة ، لكن العديد منها لا يزال غير مميز10،12،13. في هذا السياق ، هناك ما يقرب من 34 نوعا من الرخويات الأرضية في أونتاريو و 180 من رخويات المياه العذبة في كندا14. ومع ذلك ، لا يزال تنميطها وتوصيفها المتعمق محدودين15. تقدم هذه الكائنات فرصة لتحديد مركبات جديدة ذات نشاط مضاد للفطرياتمحتمل 10.
في هذا البروتوكول ، يتم وصف طرق عزل وتوضيح المستخلصات من اللافقاريات (مثل الرخويات) (الشكل 1) متبوعة بقياس النشاط المثبط للببتيداز المفترض. ثم يتم تقييم الخصائص المضادة للفطريات لهذه المستخلصات عن طريق قياس تأثيرها على إنتاج عامل ضراوة C. neoformans باستخدام مقايسات النمط الظاهري (الشكل 2). من المهم ملاحظة أن الاختلافات في الخصائص المضادة للفطريات بين المستخلصات الخام والموضحة قد تكون مؤشرا على العوامل الميكروبية (على سبيل المثال ، المستقلبات الثانوية أو السموم التي ينتجها الميكروبيوم المضيف) للرخويات ، والتي قد تؤثر على الملاحظات التجريبية. تدعم هذه النتائج الحاجة إلى هذا البروتوكول لتقييم كل من المستخلصات الخام والموضحة بشكل مستقل لكشف طرق العمل. بالإضافة إلى ذلك ، فإن عملية الاستخراج غير متحيزة وقد تمكن من اكتشاف الخصائص المضادة للميكروبات ضد عدد كبير من مسببات الأمراض الفطرية والبكتيرية. لذلك ، يوفر هذا البروتوكول نقطة انطلاق لتحديد أولويات أنواع الرخويات ذات الخصائص المضادة للفطريات ضد C. neoformans وفرصة لتقييم الروابط بين النشاط الأنزيمي وإنتاج عامل الفوعة من خلال آليات مثبطة مفترضة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يحدد بروتوكول الاستخراج الموصوف هنا عزل المركبات من الرخويات التي تم جمعها من أونتاريو ، كندا ، ويوضح تحقيقا جديدا في استخدام مستخلصات الرخويات ضد العامل الممرض الفطري البشري ، C. neoformans. يضيف هذا البروتوكول إلى مجموعة متزايدة من الأبحاث التي تبحث في نشاط مثبطات الببتيداز من اللافقار?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون أعضاء مختبر Geddes-McAlister على دعمهم القيم طوال هذا التحقيق وملاحظاتهم على المخطوطة. يقر المؤلفون بدعم التمويل من منحة أونتاريو للدراسات العليا وجائزة أبحاث الدراسات العليا الدولية – جامعة جيلف إلى D. G.-G ومن المؤسسة الكندية للابتكار (JELF 38798) ووزارة أونتاريو للكليات والجامعات – جائزة الباحث المبكر ل J. G.-M.
Materials
| 0.2 μm Filters | VWR | 28145-477 (North America) | |
| 1.5 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120086 | |
| 2 mL Tubes (Safe-Lock) | Eppendorf | 0030120094 | |
| 3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA) | Sigma-Aldrich | D9628-5G | CAS #: 59-92-7 |
| 96-well plates | Costar (Corning) | 3370 | |
| Bullet Blender Storm 24 | NEXT ADVANCE | BBY24M | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428000010 | |
| Chelex 100 Resin | BioRad | 142-1253 | |
| CO2 Incubator (Static) | SANYO | Not available | |
| Cryptococcus neoformans H99 | ATCC | 208821 | |
| DIC Microscope | Olympus | ||
| DIC Microscope software | Zeiss | ||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Glucose (D-Glucose, Anhydrous, Reagent Grade) | BioShop | GLU501 | CAS #: 50-99-7 |
| Glycine | Fisher Chemical | G46-1 | CAS #: 56-40-6 |
| GraphPad Prism 9 | Dotmatics | ||
| Hemocytometer | VWR | 15170-208 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7 H2O) | Honeywell | M1880-500G | CAS #: 10034-99-8 |
| Peptone | BioShop | PEP403 | |
| Phosohate buffer salt pH 7.4 | BioShop | PBS408 | SKU: PBS408.500 |
| Plate reader (Synergy-H1) | BioTek (Agilent) | Not available | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Chemical | P285-500 | CAS #: 7778-77-0 |
| Subtilisin A | Sigma-Aldrich | P4860 | CAS #: 9014-01-01 |
| Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide | Sigma-Aldrich | 573462 | CAS #: 70967-97-4 |
| Thermal bath | VWR | 76308-834 | |
| Thiamine Hydrochloride | Fisher-Bioreagents | BP892-100 | CAS #: 67-03-8 |
| Yeast extract | BioShop | YEX401 | CAS #: 8013-01-2 |
| Yeast nitrogen base (with Amino Acids) | Sigma-Aldrich | Y1250-250G | YNB |
Riferimenti
- Derek, J., Sloan, V. P. Cryptococcal meningitis: Epidemiology and therapeutic options. Clinical Epidemiology. 6, 169-182 (2014).
- Rajasingham, R., et al. The global burden of HIV-associated cryptococcal infection in adults in 2020: a modelling analysis. The Lancet Infectious Diseases. , (2022).
- Mourad, A., Perfect, J. R. Present and future therapy of Cryptococcus infections. Journal of Fungi. 4 (3), 79 (2018).
- Bermas, A., Geddes-McAlister, J. Combatting the evolution of antifungal resistance in Cryptococcus neoformans. Molecular Microbiology. 114 (5), 721-734 (2020).
- Geddes-McAlister, J., Shapiro, R. S. New pathogens, new tricks: Emerging, drug-resistant fungal pathogens and future prospects for antifungal therapeutics. Annals of the New York Academy of Sciences. 1435 (1), 57-78 (2019).
- Kronstad, J. W., Hu, G., Choi, J. The cAMP/protein kinase A pathway and virulence in Cryptococcus neoformans. Mycobiology. 39 (3), 143-150 (2018).
- Olszewski, M. A., et al. Urease expression by Cryptococcus neoformans promotes microvascular sequestration, thereby enhancing central nervous system invasion. The American Journal of Pathology. 164 (5), 1761-1771 (2004).
- Shi, M., et al. Real-time imaging of trapping and urease-dependent transmigration of Cryptococcus neoformans in mouse brain. The Journal of Clinical Investigation. 120 (5), 1683-1693 (2010).
- Vu, K., et al. Invasion of the central nervous system by Cryptococcus neoformans requires a secreted fungal metalloprotease. mBio. 5 (3), 01101-01114 (2014).
- Gutierrez-Gongora, D., Geddes-McAlister, J. From naturally-sourced protease inhibitors to new treatments for fungal infections. Journal of Fungi. 7 (12), 1016 (2021).
- Nakao, Y., Fusetani, N. Enzyme inhibitors from marine invertebrates. Journal of Natural Products. 70 (4), 689-710 (2007).
- Reytor, M. L., et al. Screening of protease inhibitory activity in extracts of five Ascidian species from Cuban coasts. Biotecnologia Aplicada. 28 (2), 77-82 (2011).
- González, L., et al. Screening of protease inhibitory activity in aqueous extracts of marine invertebrates from Cuban coast. American Journal of Analytical Chemistry. 7 (4), 319-331 (2016).
- Brown, D. S., Werger, M. J. A. Freshwater molluscs. Biogeography and Ecology of Southern Africa. , 1153-1180 (1978).
- Forsyth, R. G., Oldham, M. J. Terrestrial molluscs from the Ontario Far North. Check List. 12 (3), 1-51 (2016).
- Eigenheer, R. A., Lee, Y. J., Blumwald, E., Phinney, B. S., Gelli, A. Extracellular glycosylphosphatidylinositol-anchored mannoproteins and proteases of Cryptococcus neoformans. FEMS Yeast Research. 7 (4), 499-510 (2007).
- Homer, C. M., et al. Intracellular action of a secreted peptide required for fungal virulence. Cell Host & Microbe. 19 (6), 849-864 (2016).
- Clarke, S. C., et al. Integrated activity and genetic profiling of secreted peptidases in Cryptococcus neoformans reveals an aspartyl peptidase required for low pH survival and virulence. PLoS Pathogens. 12 (12), 1006051 (2016).
- Copeland, R. A. . Evaluation of Enzyme Inhibitors in Drug Discovery: A Guide for Medicinal Chemists and Pharmacologists. , (2013).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
- Rawlings, N. D., et al. The MEROPS database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors in 2017 and a comparison with peptidases in the PANTHER database. Nucleic Acids Research. 46, 624-632 (2018).
- Gutierrez-Gongora, D., Geddes-McAlister, J. Peptidases: Promising antifungal targets of the human fungal pathogen, Cryptococcus neoformans. Facets. 7 (1), 319-342 (2022).
- Martinez, L. R., Casadevall, A. Susceptibility of Cryptococcus neoformans biofilms to antifungal agents in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (3), 1021-1033 (2006).
- Culp, E., Wright, G. D. Bacterial proteases, untapped antimicrobial drug targets. Journal of Antibiotics. 70 (4), 366-377 (2017).
- Ruocco, N., Costantini, S., Palumbo, F., Costantini, M. Marine sponges and bacteria as challenging sources of enzyme inhibitors for pharmacological applications. Mar Drugs. 15 (6), 173 (2017).
- Costa, H. P. S., et al. JcTI-I: A novel trypsin inhibitor from Jatropha curcas seed cake with potential for bacterial infection treatment. Frontiers in Microbiology. 5, 5 (2014).
