磁気共鳴ガイド下高強度集束超音波生成温熱療法:マウス横紋筋肉腫モデルにおける実行可能な治療法
Summary
ここに提示されるのは、横紋筋肉腫マウスモデルにおいて温度感受性リポソームからの薬物放出を引き起こすために、磁気共鳴ガイド下高強度集束超音波によって生成される制御された温熱療法を使用するプロトコルです。
Abstract
磁気共鳴ガイド下高強度集束超音波(MRgHIFU)は、局所温熱療法を生成するための確立された方法です。リアルタイムのイメージングと音響エネルギー変調により、このモダリティは定義された領域内で正確な温度制御を可能にします。温熱療法の生成など、この非侵襲的で非イオン化技術を使用して、熱感受性リポソームキャリアから薬物を放出するための多くの熱応用が検討されています。これらの薬物は、用量制限全身性副作用、すなわち心毒性のために標的放出が望まれるドキソルビシンなどの化学療法を含むことができる。ドキソルビシンは、さまざまな悪性腫瘍を治療するための主力であり、再発または再発横紋筋肉腫(RMS)で一般的に使用されます。RMSは、小児および若年成人において最も一般的な固形軟部組織頭蓋外腫瘍です。積極的なマルチモーダル療法にもかかわらず、RMSの生存率は過去30年間同じままです。この満たされていないニーズに対処するためのソリューションを探求するために、MRgHIFUを薬物放出の温熱療法の供給源として使用する免疫能の同系RMSマウスモデルにおける熱感受性リポソームドキソルビシン(TLD)の放出を評価するための実験プロトコルが開発されました。
Introduction
横紋筋肉腫(RMS)は、小児および若年成人に最も一般的に発生する骨格筋腫瘍です1。限局性疾患は、化学療法、電離放射線、手術などの複合的な治療で治療されることがよくあります。多剤化学療法レジメンの使用は、小児患者でより一般的であり、成人の患者と比較して転帰が改善されています2。しかし、進行中の研究努力にもかかわらず、5年生存率は、最も攻撃的な形態の疾患で約30%のままです3,4。化学療法の標準治療は、ビンクリスチン、シクロホスファミド、およびアクチノマイシンDを含む多剤レジメンです。再発または再発性疾患の場合、標準的な(遊離)ドキソルビシン(FD)およびイホスファミド1を含む代替化学療法が使用されます。これらの化学療法はすべて全身毒性を持っていますが、ドキソルビシンの心毒性は生涯にわたる用量制限を課します5-7。腫瘍に送達される薬物の量を増加させ、全身毒性を最小化するために、リポソームカプセル化を含む代替製剤が開発されている。これらは、乳がんおよび肝細胞がんの治療に承認されている非熱感受性ドキソルビシン、または臨床試験が進行中の熱感受性ドキソルビシンである可能性があります8,9,10,11,12,13。多胞リポソームおよびリガンド標的リポソームなどのリポソーム封入薬物を送達するための代替方法が評価されており、腫瘍の治療に有望である9。この研究では、熱の追加は、薬物放出を含む多因子の影響をもたらします14。磁気共鳴ガイド下高強度集束超音波(MRgHIFU)と熱感受性リポソームドキソルビシン(TLD)で生成された温熱療法(HT)の組み合わせは、用量制限毒性を最小限に抑え、腫瘍に対する免疫応答を潜在的に増加させながら、RMSを治療するためにこの毒性でありながら効果的な薬物を使用するための新しいマルチモーダル治療アプローチです。
ドキソルビシンは、>39°Cの温度でTLDから急速に放出され、人体の平均体温である37°Cをはるかに上回っていますが、組織の損傷やアブレーションを引き起こすほど高くはありません。これは43°Cで起こり始めますが、温度が60°Cに近づくにつれてより急速に起こります15。レーザー、マイクロ波、高周波アブレーション、集束超音波など、さまざまな方法が生体内でHTを生成するために使用されており、その多くは侵襲的な加熱方法です16。MRgHIFUは、非侵襲的で非イオン化加熱法であり、標的組織内の正確な温度設定を容易にします。磁気共鳴(MR)イメージングは、コンピュータソフトウェアを使用して、治療中の組織の温度測定測定値を計算できるリアルタイムイメージングを提供します。続いて、このデータを使用して、超音波治療をリアルタイムで制御し、所望の温度設定点17に到達および維持することができる。MRgHIFUはさまざまな組織タイプでテストされており、軽度のHTからアブレーションまで、幅広い温度治療に使用できるだけでなく、臨床的には痛みを伴う骨転移の治療に成功しています18。さらに、HTは腫瘍細胞毒性を引き起こし、タンパク質発現を調節し、腫瘍微小環境における免疫応答を変化させることが示されています19,20,21,22。ある研究では、相乗的なR1ラットモデル23で軽度のHTとTLDを組み合わせ、続いてMRgHIFUでアブレーションを行い、腫瘍コアの壊死と末梢への薬物送達をもたらしました。伝統的に、放射線療法は、腫瘍細胞に損傷を与え、局所疾患の再発を減らすための補助療法として使用されてきました。ただし、その使用は、生涯投与とオフターゲット損傷によって制限されます1。したがって、HTは、同じ毒性または制限なしに同じ効果のいくつかを引き起こすことができるという点で独特である。
RMSの前臨床動物モデルには、免疫不全宿主における同系免疫適格モデルおよび患者由来異種移植片(PDX)が含まれます。免疫不全モデルはヒト腫瘍の成長を可能にするが、適切な腫瘍微小環境を欠いており、免疫応答を研究する能力が制限されている24。FGFR4活性化変異は、予後不良の有望なマーカーであり、成人および小児RMS1,25における潜在的な治療標的です。Gladdy研究室で開発された同系RMSモデルでは、腫瘍は免疫適格宿主で増殖することができ、腫瘍に対する自然免疫応答および適応免疫応答を発達させる26。HTは免疫応答に影響を与えるため、マウス免疫応答の変化を観察することは、この腫瘍モデルの貴重な利点です。FDと比較したTLDに対する腫瘍応答、および化学療法とHTの両方に対する腫瘍の免疫応答の変化の両方をテストするために、この研究の焦点であるMRgHIFUおよびTLDを使用してin vivoで同系マウスRMS腫瘍を治療するためのプロトコルが開発され、採用されました。
Protocol
Representative Results
Discussion
本明細書で開発されたプロトコルは、軽度のHT治療のためにMRgHIFUを使用して後肢腫瘍を標的とし、 インビボ でリポソームから封入薬物を放出するために使用された。パイロット研究中にこのプロトコルでいくつかの重要なステップに遭遇し、これらの重要なステップを最適化することで、パイロット研究よりも治療の成功が向上しました。まず、超音波処理される領域の毛髪を完全?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロジェクトの資金源と、C17研究助成金、カナダ大学院奨学金、オンタリオ学生機会信託基金、ジェームズJ.ハモンド基金などの関係者に感謝したいと思います。
Materials
| 1.5mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 22363204 | |
| 1kb plus DNA Ladder | Froggabio | DM015-R500 | |
| 2x HS-Red Taq (PCR mix) | Wisent | 801-200-MM | |
| 7 Tesla MRI BioSpec | Bruker | T184931 | 70/30 BioSpec, Bruker, Ettlingen, Germany |
| C1000 Thermal cycler | Biorad | 1851148 | |
| Clippers | Whal Peanut | 8655 | |
| Compressed ultrasound gel | Aquaflex | HF54-004 | |
| Convection heating device | 3M Bair Hugger | 70200791401 | |
| Depiliatory cream | Nair | 61700222611 | Shopper's Drug Mart |
| DMEM | Wisent | 219-065-LK | |
| DNeasy extraction kit | Qiagen | 69504 | |
| DPBS | Wisent | 311-420-CL | |
| Drug injection system | Harvard Apparatus | PY2 70-2131 | PHD 22/2200 MRI compatible Syringe Pump |
| Eye lubricant | Optixcare | 50-218-8442 | |
| F10 Media | Wisent | 318-050-CL | |
| FBS | Wisent | 081-105 | |
| Froggarose | FroggaBio | A87 | |
| Gel Molecular Imager | BioRad | GelDocXR | |
| Glutamax | Wisent | 609-065-EL | |
| Heat Lamp | Morganville Scientific | HL0100 | Similar to this product |
| Intravascular Polyethylene tubing (0.015" ID x 0.043" OD, 20G) | SAI infusion | PE-20-100 | |
| Isoflurane | Sigma | 792632 | |
| M25FV24C Cell line | Gladdy Lab | N/A | |
| Microliter Syringe | Hamilton | 01-01-7648 | |
| Molecular Imager Gel Doc XR | Biorad | 170-8170 | |
| Mouse holder | The 3D printing material used was ABS-M30i, and it was printed on FDM Fortus 380mc machine | N/A | Dimensions: length = 43 mm, outer radius = 15 mm, inner width (where the mouse would sit) = 20.7 mm. |
| MyRun Machine | Cosmo Bio Co Ltd | CBJ-IMR-001-EX | |
| Nanodrop 8000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-8000-GL | |
| p53 primers | Eurofins | N/A | Custom Primers |
| PCR tubes | Diamed | SSI3131-06 | |
| Penicillin/Streptomycin | Wisent | 450-200-EL | |
| Proteus software | Pichardo lab | N/A | |
| Respiratory monitoring system | SAII | Model 1030 | MR-compatible monitoring and gating system for small animals |
| Small Bore HIFU device, LabFUS | Image Guided Therapy | N/A | LabFUS, Image Guided Therapy, Pessac, France Number of elements 8 frequency 2.5 MHz diameter 25 mm radius of curvature 20 mm Focal spot size 0.6 mm x 0.6 mm x 2.0 mm Motor: axes 2 Generator: Number of channels 8 Maximum electrical power/channel Wel 4 Maximum electrical power Wel 32 Bandwidth 0.5 – 5 MHz Control per channel: Freq., Phase and. amplitude Measurements per channel: Vrms, Irms, cos(theta) Duty Cycle at 100% power % 100% for 1 min. Transducer: Number of elements 8 frequency 2.5 MHz diameter 25 mm radius of curvature 20 mm Focal spot size 0.6 mm x 0.6 mm x 2.0 mm |
| SYBR Safe | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| TAE | Wisent | 811-540-FL | |
| Tail vein catheter (27G 0.5" ) | Terumo Medical Corp | 15253 | |
| Thermal probes | Rugged Monitoring | L201-08 | |
| Trypan blue | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin | Wisent | 325-052-EL | |
| Ultrasound Gel | Aquasonic | PLI 01-08 |
Riferimenti
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