Magnetisk resonansstyret højintensitetsfokuseret ultralydgenereret hypertermi: en gennemførlig behandlingsmetode i en murin rhabdomyosarkommodel

Summary

Præsenteret her er en protokol til brug af kontrolleret hypertermi, genereret af magnetisk resonansstyret højintensitetsfokuseret ultralyd, til at udløse lægemiddelfrigivelse fra temperaturfølsomme liposomer i en rhabdomyosarcoma musemodel.

Abstract

Magnetisk resonansstyret højintensitetsfokuseret ultralyd (MRgHIFU) er en etableret metode til fremstilling af lokaliseret hypertermi. I betragtning af billeddannelse i realtid og akustisk energimodulering muliggør denne modalitet præcis temperaturkontrol inden for et defineret område. Mange termiske applikationer udforskes med denne ikke-invasive, ikke-ioniserende teknologi, såsom hypertermigenerering, for at frigive lægemidler fra termofølsomme liposomale bærere. Disse lægemidler kan omfatte kemoterapier såsom doxorubicin, for hvilke målrettet frigivelse ønskes på grund af de dosisbegrænsende systemiske bivirkninger, nemlig kardiotoksicitet. Doxorubicin er en grundpille til behandling af en række maligne tumorer og er almindeligt anvendt i recidiverende eller tilbagevendende rhabdomyosarcoma (RMS). RMS er den mest almindelige ekstrakranielle tumor i fast blødt væv hos børn og unge voksne. På trods af aggressiv, multimodal terapi har RMS-overlevelsesraten været den samme i de sidste 30 år. For at undersøge en løsning til at imødekomme dette uopfyldte behov blev der udviklet en eksperimentel protokol til evaluering af frigivelsen af termosensitiv liposomal doxorubicin (TLD) i en immunokompetent, syngeneisk RMS-musemodel ved hjælp af MRgHIFU som kilde til hypertermi til lægemiddelfrigivelse.

Introduction

Rhabdomyosarcoma (RMS) er en skeletmuskeltumor, der oftest forekommer hos børn og unge voksne¹. Lokaliseret sygdom behandles ofte med multimodal behandling, herunder kemoterapi, ioniserende stråling og kirurgi. Brugen af kemoterapiregimer med flere lægemidler er mere udbredt hos pædiatriske patienter med forbedrede resultater sammenlignet med deres voksne kolleger²; På trods af igangværende forskningsindsats forbliver den 5-årige overlevelsesrate imidlertid på omkring 30% i den mest aggressive form af sygdommen ^3,4. Kemoterapistandarden for pleje er et multidrug regime, der omfatter vincristin, cyclophosphamid og actinomycin D. I tilfælde af recidiverende eller tilbagevendende sygdom anvendes alternative kemoterapier, herunder standard (fri) doxorubicin (FD) og ifosfamid¹. Mens alle disse kemoterapier har systemiske toksiciteter, pålægger doxorubicins kardiotoksicitet en livslang dosisbegrænsning ^5-7. For at øge mængden af lægemidlet, der leveres til tumoren og for at minimere systemisk toksicitet, er der udviklet alternative formuleringer, herunder liposomal indkapsling. Disse kan være ikke-termosensitivt doxorubicin, som er godkendt til behandling af brystkræft og hepatocellulært karcinom, eller termosensitivt doxorubicin, for hvilket kliniske forsøg er i gang 8,9,10,11,12,13. Alternative metoder til levering af liposomale indkapslede lægemidler såsom multivesikulære liposomer og ligandmålrettede liposomer er blevet evalueret og viser løfte om behandling af tumorer⁹. I denne undersøgelse har tilsætningen af varme multifaktorielle virkninger, herunder lægemiddelfrigivelse¹⁴. Kombinationen af hypertermi (HT) genereret med magnetisk resonansstyret højintensitetsfokuseret ultralyd (MRgHIFU) og termosensitiv liposomal doxorubicin (TLD) er en ny multimodal terapeutisk tilgang til anvendelse af dette giftige, men effektive lægemiddel til behandling af RMS, samtidig med at dosisbegrænsende toksicitet minimeres og potentielt øger immunresponset på tumoren.

Doxorubicin frigives hurtigt fra TLD ved temperaturer >39 °C, et godt stykke over den gennemsnitlige menneskelige kropstemperatur på 37 °C, men ikke høj nok til at forårsage vævsskade eller ablation; dette begynder at ske ved 43 ° C, men sker hurtigere, når temperaturen nærmer sig 60 ° C¹⁵. Forskellige metoder er blevet brugt til at generere HT in vivo, herunder lasere, mikrobølger, radiofrekvensablation og fokuseret ultralyd, hvoraf mange er invasive opvarmningsmetoder¹⁶. MRgHIFU er en ikke-invasiv, ikke-ioniserende opvarmningsmetode, der letter præcise temperaturindstillinger inden for målvævet in situ. Magnetisk resonans (MR) billeddannelse giver afgørende billeddannelse i realtid, hvor computersoftware kan bruges, til at beregne en termometrimåling af vævet under hele behandlingen; Derefter kan disse data bruges til at kontrollere ultralydsbehandlingen i realtid for at nå og opretholde et ønsket temperaturindstillingspunkt¹⁷. MRgHIFU er blevet testet i forskellige vævstyper og kan bruges til en bred vifte af temperaturbehandlinger, fra mild HT til ablation, såvel som klinisk til vellykket behandling af smertefulde knoglemetastaser¹⁸. Derudover har HT vist sig at forårsage tumorcytotoksicitet, modulere proteinekspression og ændre immunresponset i tumormikromiljøet 19,20,21,22. En undersøgelse kombinerede mild HT med TLD efterfulgt af ablation med MRgHIFU i en synergetisk R1-rottemodel²³, hvilket resulterede i nekrose i tumorkernen og lægemiddelafgivelse til periferien. Traditionelt er strålebehandling blevet brugt som en supplerende terapi til at beskadige tumorceller og mindske lokal sygdomsgentagelse. Imidlertid er dets anvendelse begrænset af levetidsdosering og skader uden for målet¹. HT er således unik, fordi det kan forårsage nogle af de samme virkninger uden de samme toksiciteter eller begrænsninger.

Prækliniske dyremodeller for RMS omfatter syngeneiske immunkompetente modeller og patientafledte xenotransplantater (PDX) hos immunkompromitterede værter. Mens de immunkompromitterede modeller tillader vækst af de humane tumorer, mangler de det passende tumormikromiljø og er begrænsede i deres evne til at studere immunrespons²⁴. FGFR4-aktiverende mutation er en lovende markør for dårlig prognose og et potentielt terapeutisk mål i voksen og pædiatrisk RMS ^1,25. I de syngeneiske RMS-modeller, der er udviklet i Gladdy-laboratoriet, er tumorerne i stand til at vokse i en immunkompetent vært, som udvikler medfødte og adaptive immunresponser på tumoren²⁶. Da HT påvirker immunresponset, er observation af ændringen i murinimmunresponset en værdifuld fordel ved denne tumormodel. For at teste både tumorresponset på TLD sammenlignet med FD såvel som ændringen i tumorens immunrespons til både kemoterapi og HT blev der udviklet en protokol, der blev anvendt til behandling af syngeneiske murine RMS-tumorer in vivo ved hjælp af MRgHIFU og TLD, som er fokus for denne undersøgelse.

Protocol

Forskningen blev udført i overensstemmelse med dyreplejekomitéerne med godkendte dyreanvendelsesprotokoller under en tilsynsførende dyrlæge ved Center for Phenogenomics (TCP) og University Health Network (UHN) Animal Resource Centre (ARC) dyreforskningsfaciliteter. Alle procedurer, undtagen MRgHIFU, der involverede dyrene, blev udført i et biologisk sikkerhedsskab (BSC) for at minimere dyrs eksponering for ekstern luft eller modtagelig infektion. 1. Opdræt af mus <p cl…

Representative Results

Ved hjælp af den MRgHIFU-genererede hypertermiprotokol kunne tumorerne i bagbenet konsekvent opvarmes til den ønskede indstillede temperatur i behandlingens varighed (figur 4 viser en repræsentativ behandling, 10 eller 20 min, n = 65). For at betragte en behandling som vellykket skulle ROI opretholdes over 39 °C under hele behandlingen med <6 °C variation gennem hele behandlingen og uden opvarmning af væv uden for målet. Derudover skulle kernetemperaturen forblive under 39 °C baseret…

Discussion

Protokollen udviklet heri blev brugt til at målrette bagekstremitetstumorer ved hjælp af MRgHIFU til mild HT-behandling og frigive indkapslede lægemidler fra liposomer in vivo. Flere kritiske trin blev fundet i denne protokol under pilotundersøgelsen, og optimering af disse kritiske trin tegnede sig for den forbedrede behandlingssucces i forhold til pilotstudiet. For det første er fuldstændig fjernelse af håret på det område, der skal sonikeres. Enhver gasfangst i pelsen forhindrer ultralydstrålen i at…

Materials

1.5mL Eppendorf tubes	Eppendorf	22363204
1kb plus DNA Ladder	Froggabio	DM015-R500
2x HS-Red Taq (PCR mix)	Wisent	801-200-MM
7 Tesla MRI BioSpec	Bruker	T184931	70/30 BioSpec, Bruker, Ettlingen, Germany
C1000 Thermal cycler	Biorad	1851148
Clippers	Whal Peanut	8655
Compressed ultrasound gel	Aquaflex	HF54-004
Convection heating device	3M Bair Hugger	70200791401
Depiliatory cream	Nair	61700222611	Shopper's Drug Mart
DMEM	Wisent	219-065-LK
DNeasy extraction kit	Qiagen	69504
DPBS	Wisent	311-420-CL
Drug injection system	Harvard Apparatus	PY2 70-2131	PHD 22/2200 MRI compatible Syringe Pump
Eye lubricant	Optixcare	50-218-8442
F10 Media	Wisent	318-050-CL
FBS	Wisent	081-105
Froggarose	FroggaBio	A87
Gel Molecular Imager	BioRad	GelDocXR
Glutamax	Wisent	609-065-EL
Heat Lamp	Morganville Scientific	HL0100	Similar to this product
Intravascular Polyethylene tubing (0.015" ID x 0.043" OD, 20G)	SAI infusion	PE-20-100
Isoflurane	Sigma	792632
M25FV24C Cell line	Gladdy Lab	N/A
Microliter Syringe	Hamilton	01-01-7648
Molecular Imager Gel Doc XR	Biorad	170-8170
Mouse holder	The 3D printing material used was ABS-M30i, and it was printed on FDM Fortus 380mc machine	N/A	Dimensions: length = 43 mm, outer radius = 15 mm, inner width (where the mouse would sit) = 20.7 mm.
MyRun Machine	Cosmo Bio Co Ltd	CBJ-IMR-001-EX
Nanodrop 8000 Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-8000-GL
p53 primers	Eurofins	N/A	Custom Primers
PCR tubes	Diamed	SSI3131-06
Penicillin/Streptomycin	Wisent	450-200-EL
Proteus software	Pichardo lab	N/A
Respiratory monitoring system	SAII	Model 1030	MR-compatible monitoring and gating system for small animals
Small Bore HIFU device, LabFUS	Image Guided Therapy	N/A	LabFUS, Image Guided Therapy, Pessac, France Number of elements 8 frequency 2.5 MHz diameter  25 mm radius of curvature 20 mm Focal spot size 0.6 mm x 0.6 mm x 2.0 mm Motor: axes 2 Generator: Number of channels 8 Maximum electrical power/channel Wel 4 Maximum electrical power Wel 32 Bandwidth 0.5 – 5 MHz Control per channel: Freq., Phase and. amplitude Measurements per channel: Vrms, Irms, cos(theta) Duty Cycle at 100% power % 100% for 1 min. Transducer: Number of elements 8 frequency  2.5 MHz diameter 25 mm radius of curvature 20 mm Focal spot size  0.6 mm x 0.6 mm x 2.0 mm
SYBR Safe	ThermoFisher Scientific	S33102
TAE	Wisent	811-540-FL
Tail vein catheter (27G 0.5" )	Terumo Medical Corp	15253
Thermal probes	Rugged Monitoring	L201-08
Trypan blue	ThermoFisher Scientific	15250061
Trypsin	Wisent	325-052-EL
Ultrasound Gel	Aquasonic	PLI 01-08