Manyetik Rezonans Rehberliğinde Yüksek Yoğunluklu Odaklanmış Ultrason Tarafından Üretilen Hipertermi: Bir Murin Rabdomiyosarkom Modelinde Uygulanabilir Bir Tedavi Yöntemi
Summary
Burada, rabdomiyosarkom fare modelinde sıcaklığa duyarlı lipozomlardan ilaç salınımını tetiklemek için manyetik rezonans rehberliğinde yüksek yoğunluklu odaklanmış ultrason tarafından üretilen kontrollü hipertermiyi kullanmak için bir protokol sunulmaktadır.
Abstract
Manyetik rezonans rehberliğinde yüksek yoğunluklu odaklanmış ultrason (MRgHIFU), lokalize hipertermi üretmek için kurulmuş bir yöntemdir. Gerçek zamanlı görüntüleme ve akustik enerji modülasyonu göz önüne alındığında, bu modalite, tanımlanmış bir alanda hassas sıcaklık kontrolü sağlar. Termosensitif lipozomal taşıyıcılardan ilaçları serbest bırakmak için hipertermi üretimi gibi bu invaziv olmayan, iyonlaştırıcı olmayan teknoloji ile birçok termal uygulama araştırılmaktadır. Bu ilaçlar, doz sınırlayıcı sistemik yan etkiler, yani kardiyotoksisite nedeniyle hedeflenen salınımın istendiği doksorubisin gibi kemoterapileri içerebilir. Doksorubisin, çeşitli malign tümörlerin tedavisinde temel dayanaktır ve nükseden veya tekrarlayan rabdomiyosarkomda (RMS) yaygın olarak kullanılır. RMS, çocuklarda ve genç erişkinlerde en sık görülen solid yumuşak doku ekstrakraniyal tümörüdür. Agresif, multimodal tedaviye rağmen, RMS sağkalım oranları son 30 yıldır aynı kalmıştır. Bu karşılanmamış ihtiyacı karşılamak için bir çözüm araştırmak amacıyla, ilaç salınımı için hipertermi kaynağı olarak MRgHIFU kullanılarak, immün yetkin, sinjenik bir RMS fare modelinde termosensitif lipozomal doksorubisin (TLD) salınımını değerlendirmek üzere deneysel bir protokol geliştirilmiştir.
Introduction
Rabdomiyosarkom (RMS), en sık çocuklarda ve genç erişkinlerde görülen bir iskelet kası tümörüdür1. Lokalize hastalık genellikle kemoterapi, iyonlaştırıcı radyasyon ve cerrahi dahil olmak üzere multimodal tedavi ile tedavi edilir. Çoklu ilaç kemoterapi rejimlerinin kullanımı pediatrik hastalarda daha yaygındır ve yetişkin meslektaşlarına kıyasla daha iyi sonuçlar elde edilmiştir2; Bununla birlikte, devam eden araştırma çabalarına rağmen, 5 yıllık sağkalım oranı, hastalığın en agresif formunda yaklaşık% 30’da kalmaktadır 3,4. Kemoterapi bakım standardı, vinkristin, siklofosfamid ve aktinomisin D içeren çoklu ilaç rejimidir. Nüks veya tekrarlayan hastalık vakalarında, standart (serbest) doksorubisin (FD) ve ifosfamid1 dahil olmak üzere alternatif kemoterapiler kullanılır. Tüm bu kemoterapiler sistemik toksisiteye sahipken, doksorubisin kardiyotoksisitesiyaşam boyu doz sınırlaması 5-7 getirmektedir. Tümöre verilen ilacın miktarını arttırmak ve sistemik toksisiteyi en aza indirmek için, lipozomal kapsülleme de dahil olmak üzere alternatif formülasyonlar geliştirilmiştir. Bunlar, meme kanseri ve hepatosellüler karsinomun tedavisi için onaylanmış ısıya duyarlı olmayan doksorubisin veya klinik çalışmaları devam eden 8,9,10,11,12,13 ısıya duyarlı doksorubisin olabilir. Multi-veziküler lipozomlar ve ligand hedefli lipozomlar gibi lipozomal kapsüllü ilaçların verilmesi için alternatif yöntemler değerlendirilmiş ve tümörlerin tedavisi için umut vaat etmektedir9. Bu çalışmada, ısı ilavesi, ilaç salınımı14 de dahil olmak üzere çok faktörlü etkilere sahiptir. Manyetik rezonans rehberliğinde yüksek yoğunluklu odaklanmış ultrason (MRgHIFU) ve termosensitif lipozomal doksorubisin (TLD) ile oluşturulan hipertermi (HT) kombinasyonu, doz sınırlayıcı toksisiteyi en aza indirirken ve potansiyel olarak tümöre karşı bağışıklık tepkisini arttırırken, RMS’yi tedavi etmek için bu toksik ancak etkili ilacı kullanmak için yeni bir multimodal terapötik yaklaşımdır.
Doksorubisin, TLD’den >39 ° C, ortalama insan vücudu sıcaklığı olan 37 ° C’nin çok üzerinde, ancak doku hasarına veya ablasyona neden olacak kadar yüksek olmayan sıcaklıklarda hızla salınır; Bu, 43 ° C’de gerçekleşmeye başlar, ancak sıcaklıklar 60 ° C’ye yaklaştıkça daha hızlı gerçekleşir15. HT in vivo üretmek için lazerler, mikrodalgalar, radyofrekans ablasyon ve odaklanmış ultrason dahil olmak üzere çeşitli yöntemler kullanılmıştır ve bunların çoğu invaziv ısıtma yöntemleridir16. MRgHIFU, in situ hedef doku içinde hassas sıcaklık ayarlarını kolaylaştıran invaziv olmayan, iyonlaştırıcı olmayan bir ısıtma yöntemidir. Manyetik rezonans (MR) görüntüleme, tedavi boyunca dokunun termometri ölçümünü hesaplamak için bilgisayar yazılımının kullanılabileceği gerçek zamanlı görüntüleme sağlar; Daha sonra, bu veriler, istenen sıcaklık ayar noktası17’ye ulaşmak ve korumak için ultrason tedavisini gerçek zamanlı olarak kontrol etmek için kullanılabilir. MRgHIFU çeşitli doku tiplerinde test edilmiştir ve hafif HT’den ablasyona kadar çok çeşitli sıcaklık tedavileri için ve ayrıca ağrılı kemik metastazlarını başarılı bir şekilde tedavi etmek için klinik olarak kullanılabilir18. Ek olarak, HT’nin tümör sitotoksisitesine neden olduğu, protein ekspresyonunu modüle ettiği ve tümör mikroortamında bağışıklık tepkisini değiştirdiği gösterilmiştir 19,20,21,22. Bir çalışma, hafif HT’yi TLD ile birleştirdi, ardından sinerjik bir R1 sıçan modeli23’te MRgHIFU ile ablasyon, tümör çekirdeğinde nekroz ve periferiye ilaç verilmesi ile sonuçlandı. Geleneksel olarak, radyoterapi tümör hücrelerine zarar vermek ve lokal hastalık nüksünü azaltmak için yardımcı bir tedavi olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, kullanımı ömür boyu dozlama ve hedef dışı hasar1 ile sınırlıdır. Bu nedenle, HT, aynı toksisiteler veya sınırlamalar olmadan aynı etkilerden bazılarına neden olabileceği için benzersizdir.
RMS için preklinik hayvan modelleri, immün sistemi baskılanmış konakçılarda sinjenik immünokompetan modelleri ve hasta kaynaklı ksenogreftleri (PDX) içerir. İmmün sistemi baskılanmış modeller insan tümörlerinin büyümesine izin verirken, uygun tümör mikroçevresinden yoksundurlar ve immün yanıtı inceleme yeteneklerinde sınırlıdırlar24. FGFR4-aktive edici mutasyon, kötü prognoz için umut verici bir belirteçtir ve erişkin ve pediatrik RMS 1,25’te potansiyel bir terapötik hedeftir. Gladdy laboratuvarında geliştirilen sinjenik RMS modellerinde, tümörler, tümör26’ya doğuştan gelen ve adaptif immün yanıtlar geliştiren immünokompetan bir konakçıda büyüyebilirler. HT immün yanıtı etkilediğinden, murin immün yanıtındaki değişimin gözlenmesi bu tümör modelinin değerli bir avantajıdır. Hem FD’ye kıyasla TLD’ye tümör yanıtını hem de tümörün hem kemoterapi hem de HT’ye karşı immün yanıtındaki değişikliği test etmek için, bu çalışmanın odak noktası olan MRgHIFU ve TLD kullanarak sinjenik murin RMS tümörlerini in vivo olarak tedavi etmek için bir protokol geliştirilmiş ve kullanılmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada geliştirilen protokol, hafif HT tedavisi için MRgHIFU kullanılarak arka ekstremite tümörlerini hedeflemek ve kapsüllenmiş ilaçları in vivo olarak lipozomlardan serbest bırakmak için kullanılmıştır. Pilot çalışma sırasında bu protokolde birkaç kritik adımla karşılaşıldı ve bu kritik adımların optimize edilmesi, pilot çalışmaya göre tedavi başarısının artmasını sağladı. Birincisi, sonikleştirilecek bölgedeki saçların tamamen çıkarılmasıdır. Kürk içinde sı…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu proje için finansman kaynaklarımızı ve C17 Araştırma Bursu, Kanada Yüksek Lisans Bursu, Ontario Öğrenci Fırsatı Güven Fonu ve James J. Hammond Fonu dahil olmak üzere ilgili personeli kabul etmek isteriz.
Materials
| 1.5mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 22363204 | |
| 1kb plus DNA Ladder | Froggabio | DM015-R500 | |
| 2x HS-Red Taq (PCR mix) | Wisent | 801-200-MM | |
| 7 Tesla MRI BioSpec | Bruker | T184931 | 70/30 BioSpec, Bruker, Ettlingen, Germany |
| C1000 Thermal cycler | Biorad | 1851148 | |
| Clippers | Whal Peanut | 8655 | |
| Compressed ultrasound gel | Aquaflex | HF54-004 | |
| Convection heating device | 3M Bair Hugger | 70200791401 | |
| Depiliatory cream | Nair | 61700222611 | Shopper's Drug Mart |
| DMEM | Wisent | 219-065-LK | |
| DNeasy extraction kit | Qiagen | 69504 | |
| DPBS | Wisent | 311-420-CL | |
| Drug injection system | Harvard Apparatus | PY2 70-2131 | PHD 22/2200 MRI compatible Syringe Pump |
| Eye lubricant | Optixcare | 50-218-8442 | |
| F10 Media | Wisent | 318-050-CL | |
| FBS | Wisent | 081-105 | |
| Froggarose | FroggaBio | A87 | |
| Gel Molecular Imager | BioRad | GelDocXR | |
| Glutamax | Wisent | 609-065-EL | |
| Heat Lamp | Morganville Scientific | HL0100 | Similar to this product |
| Intravascular Polyethylene tubing (0.015" ID x 0.043" OD, 20G) | SAI infusion | PE-20-100 | |
| Isoflurane | Sigma | 792632 | |
| M25FV24C Cell line | Gladdy Lab | N/A | |
| Microliter Syringe | Hamilton | 01-01-7648 | |
| Molecular Imager Gel Doc XR | Biorad | 170-8170 | |
| Mouse holder | The 3D printing material used was ABS-M30i, and it was printed on FDM Fortus 380mc machine | N/A | Dimensions: length = 43 mm, outer radius = 15 mm, inner width (where the mouse would sit) = 20.7 mm. |
| MyRun Machine | Cosmo Bio Co Ltd | CBJ-IMR-001-EX | |
| Nanodrop 8000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-8000-GL | |
| p53 primers | Eurofins | N/A | Custom Primers |
| PCR tubes | Diamed | SSI3131-06 | |
| Penicillin/Streptomycin | Wisent | 450-200-EL | |
| Proteus software | Pichardo lab | N/A | |
| Respiratory monitoring system | SAII | Model 1030 | MR-compatible monitoring and gating system for small animals |
| Small Bore HIFU device, LabFUS | Image Guided Therapy | N/A | LabFUS, Image Guided Therapy, Pessac, France Number of elements 8 frequency 2.5 MHz diameter 25 mm radius of curvature 20 mm Focal spot size 0.6 mm x 0.6 mm x 2.0 mm Motor: axes 2 Generator: Number of channels 8 Maximum electrical power/channel Wel 4 Maximum electrical power Wel 32 Bandwidth 0.5 – 5 MHz Control per channel: Freq., Phase and. amplitude Measurements per channel: Vrms, Irms, cos(theta) Duty Cycle at 100% power % 100% for 1 min. Transducer: Number of elements 8 frequency 2.5 MHz diameter 25 mm radius of curvature 20 mm Focal spot size 0.6 mm x 0.6 mm x 2.0 mm |
| SYBR Safe | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| TAE | Wisent | 811-540-FL | |
| Tail vein catheter (27G 0.5" ) | Terumo Medical Corp | 15253 | |
| Thermal probes | Rugged Monitoring | L201-08 | |
| Trypan blue | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin | Wisent | 325-052-EL | |
| Ultrasound Gel | Aquasonic | PLI 01-08 |
Riferimenti
- Skapek, S. X., et al. Rhabdomyosarcoma. Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), (2019).
- Ferrari, A., et al. Impact of rhabdomyosarcoma treatment modalities by age in a population-based setting. Journal of Adolescent and Young Adult Oncology. 10 (3), 309-315 (2021).
- . Pediatric rhabdomyosarcoma surgery: Background, anatomy, pathophysiology Available from: https://emedicine.medscape.com/article/939156-overview#a2 (2019)
- Ognjanovic, S., Linabery, A. M., Charbonneau, B., Ross, J. A. Trends in childhood rhabdomyosarcoma incidence and survival in the United States, 1975-2005. Cancer. 115 (18), 4218-4226 (2009).
- Mulrooney, D. A., et al. Cardiac outcomes in a cohort of adult survivors of childhood and adolescent cancer: retrospective analysis of the Childhood Cancer Survivor Study cohort. BMJ. 339, (2009).
- Lipshultz, S. E., Cochran, T. R., Franco, V. I., Miller, T. L. Treatment-related cardiotoxicity in survivors of childhood cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 10 (12), 697-710 (2013).
- Winter, S., Fasola, S., Brisse, H., Mosseri, V., Orbach, D. Relapse after localized rhabdomyosarcoma: Evaluation of the efficacy of second-line chemotherapy. Pediatric Blood & Cancer. 62 (11), 1935-1941 (2015).
- Wood, B. J., et al. Phase I study of heat-deployed liposomal doxorubicin during radiofrequency ablation for hepatic malignancies. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 23 (2), 248-255 (2012).
- Bulbake, U., Doppalapudi, S., Kommineni, N., Khan, W. Liposomal formulations in clinical use: an updated review. Pharmaceutics. 9 (2), 12 (2017).
- Zagar, T. M., et al. Two phase I dose-escalation/pharmacokinetics studies of low temperature liposomal doxorubicin (LTLD) and mild local hyperthermia in heavily pretreated patients with local regionally recurrent breast cancer. International Journal of Hyperthermia. 30 (5), 285-294 (2014).
- . A phase I study of lyso-thermosensitive liposomal doxorubicin and MR-HIFU for pediatric refractory solid tumors Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02536183 (2019)
- PanDox: targeted doxorubicin in pancreatic tumours (PanDox). University of Oxford Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04852367 (2021)
- . Image-guided targeted doxorubicin delivery with hyperthermia to optimize loco-regional control in breast cancer (i-GO) Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03749850 (2018)
- De Vita, A., et al. Lysyl oxidase engineered lipid nanovesicles for the treatment of triple negative breast cancer. Scientific Reports. 11 (1), 5107 (2021).
- Sapareto, S. A., Dewey, W. C. Thermal dose determination in cancer therapy. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 10 (6), 787-800 (1984).
- Kok, H. P., et al. Heating technology for malignant tumors: a review. International Journal of Hyperthermia. 37 (1), 711-741 (2020).
- Kokuryo, D., Kumamoto, E., Kuroda, K. Recent technological advancements in thermometry. Advanced Drug Delivery Reviews. 163, 19-39 (2020).
- Bongiovanni, A., et al. 3-T magnetic resonance-guided high-intensity focused ultrasound (3 T-MR-HIFU) for the treatment of pain from bone metastases of solid tumors. Support Care Cancer. 30 (7), 5737-5745 (2022).
- Seifert, G., et al. Regional hyperthermia combined with chemotherapy in paediatric, adolescent and young adult patients: current and future perspectives. Radiation Oncology. 11, 65 (2016).
- Dewhirst, M. W., Lee, C. -. T., Ashcraft, K. A. The future of biology in driving the field of hyperthermia. International Journal of Hyperthermia. 32 (1), 4-13 (2016).
- Dewhirst, M. W., Vujaskovic, Z., Jones, E., Thrall, D. Re-setting the biologic rationale for thermal therapy. International Journal of Hyperthermia. 21 (8), 779-790 (2005).
- Repasky, E. A., Evans, S. S., Dewhirst, M. W. Temperature matters! And why it should matter to tumor immunologists. Cancer Immunology Research. 1 (4), 210-216 (2013).
- Hijnen, N., et al. Thermal combination therapies for local drug delivery by magnetic resonance-guided high-intensity focused ultrasound. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (24), E4802-E4811 (2017).
- Shultz, L. D., et al. Human cancer growth and therapy in immunodeficient mouse models. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (7), 694-708 (2014).
- De Vita, A., et al. Deciphering the genomic landscape and pharmacological profile of uncommon entities of adult rhabdomyosarcomas. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11564 (2021).
- McKinnon, T., et al. Functional screening of FGFR4-driven tumorigenesis identifies PI3K/mTOR inhibition as a therapeutic strategy in rhabdomyosarcoma. Oncogene. 37 (20), 2630-2644 (2018).
- Zaporzan, B., et al. MatMRI and MatHIFU: software toolboxes for real-time monitoring and control of MR-guided HIFU. Journal of Therapeutic Ultrasound. 1, (2013).
- Dunne, M., et al. Heat-activated drug delivery increases tumor accumulation of synergistic chemotherapies. Journal of Controlled Release. 308, 197-208 (2019).
- Zhao, Y. X., Hu, X. Y., Zhong, X., Shen, H., Yuan, Y. High-intensity focused ultrasound treatment as an alternative regimen for myxofibrosarcoma. Dermatologic Therapy. 34 (2), 14816 (2021).
- Vanni, S., et al. Myxofibrosarcoma landscape: diagnostic pitfalls, clinical management and future perspectives. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 14, 17588359221093973 (2022).
