Görüntüleme Akış Sitometrisi ve Yapay Zeka Kullanılarak Mikronükleus Testinin Otomasyonu
Summary
Mikroçekirdek (MN) testi, DNA hasarını ölçmek için iyi kurulmuş bir testtir. Bununla birlikte, manuel mikroskopi veya özellik tabanlı görüntü analizi gibi geleneksel teknikleri kullanarak tahlilin puanlanması zahmetli ve zordur. Bu makalede, görüntüleme akışı sitometri verilerini kullanarak MN testini puanlamak için bir yapay zeka modeli geliştirme metodolojisi açıklanmaktadır.
Abstract
Mikroçekirdek (MN) testi, genetik toksisite için kimyasalları değerlendirmek için dünya çapında düzenleyici kurumlar tarafından kullanılmaktadır. Tahlil iki şekilde gerçekleştirilebilir: MN’yi bir kez bölünmüş, sitokinez bloke edilmiş binüklee hücrelerde veya tamamen bölünmüş monoçekirdekli hücrelerde puanlayarak. Tarihsel olarak, ışık mikroskobu testi puanlamak için altın standart yöntem olmuştur, ancak zahmetli ve özneldir. Akış sitometrisi son yıllarda testi puanlamak için kullanılmıştır, ancak hücresel görüntülerin temel yönlerini görsel olarak doğrulayamama ile sınırlıdır. Görüntüleme akışı sitometrisi (IFC), yüksek verimli görüntü yakalama ve otomatik görüntü analizini birleştirir ve MN testindeki tüm önemli olayların görüntülerini hızlı bir şekilde elde etmek ve puanlamak için başarıyla uygulanmıştır. Son zamanlarda, IFC tarafından elde edilen MN tahlil verilerini puanlamak için evrişimli sinir ağlarına dayanan yapay zeka (AI) yöntemlerinin kullanılabileceği gösterilmiştir. Bu makalede, tüm önemli olayları puanlamak üzere bir derin öğrenme modeli oluşturmak ve ek verileri otomatik olarak puanlamak için bu modeli uygulamak üzere yapay zeka yazılımını kullanmaya yönelik tüm adımlar açıklanmaktadır. AI derin öğrenme modelinden elde edilen sonuçlar, manuel mikroskopi ile iyi bir şekilde karşılaştırılır, bu nedenle IFC ve AI’yı birleştirerek MN testinin tam otomatik puanlamasını sağlar.
Introduction
Mikronükleus (MN) testi, genetik toksikolojide, insan kullanımı için kozmetik, ilaç ve kimyasalların geliştirilmesinde DNA hasarını değerlendirmek için temeldir 1,2,3,4. Mikroçekirdekler, bölünmeyi takiben çekirdeğe dahil olmayan ve çekirdekten ayrı küçük, dairesel cisimler halinde yoğunlaşan tüm kromozomlardan veya kromozom parçalarından oluşur. Bu nedenle, MN, genotoksisite testi1’de DNA hasarını ölçmek için bir son nokta olarak kullanılabilir.
MN’yi ölçmek için tercih edilen yöntem, Sitokalasin-B (Cyt-B) kullanarak bölünmeyi bloke ederek bir kez bölünmüş binüklee hücreler (BNC’ler) içindedir. Tahlilin bu versiyonunda, sitotoksisite, monoçekirdekli (MONO) ve poliçekirdekli (POLY) hücrelerin puanlanmasıyla da değerlendirilir. Tahlil ayrıca, bloke edilmemiş MONO hücrelerinde MN’nin puanlanmasıyla da yapılabilir, bu da daha hızlı ve skorlanması daha kolaydır, sitotoksisite proliferasyonu değerlendirmek için maruziyet öncesi ve sonrası hücre sayıları kullanılarak değerlendirilir 5,6.
Tahlilin fiziksel puanlaması tarihsel olarak manuel mikroskopi ile gerçekleştirilmiştir, çünkü bu tüm önemli olayların görsel olarak doğrulanmasına izin verir. Bununla birlikte, manuel mikroskopi zorlu ve özneldir1. Böylece, mikroskop slayt taraması ve akış sitometrisi de dahil olmak üzere, her biri kendi avantajlarına ve sınırlamalarına sahip otomatik teknikler geliştirilmiştir. Slayt tarama yöntemleri önemli olayların görselleştirilmesine izin verirken, slaytlar optimum hücre yoğunluğunda oluşturulmalıdır, bu da elde edilmesi zor olabilir. Ek olarak, bu teknik genellikle MONO ve POLY hücrelerinin puanlamasını tehlikeye atabilecek sitoplazmik görselleştirmeden yoksundur 7,8. Akış sitometrisi yüksek verimli veri yakalama sunarken, hücreler lize edilmelidir, böylece tahlilin Cyt-B formunun kullanılmasına izin verilmez. Ek olarak, görüntüleme dışı bir teknik olarak, geleneksel akış sitometrisi anahtar olayların görsel doğrulamasını sağlamaz9,10.
Bu nedenle, MN testini gerçekleştirmek için görüntüleme akım sitometrisi (IFC) araştırılmıştır. ImageStreamX Mk II, geleneksel akış sitometrisinin hızını ve istatistiksel sağlamlığını mikroskopinin yüksek çözünürlüklü görüntüleme yetenekleriyle tek bir sistemde birleştirir11. IFC kullanılarak, tüm önemli olayların yüksek çözünürlüklü görüntülerinin yakalanabileceği ve özellik tabanlı 12,13 veya yapay zeka (AI) teknikleri14,15 kullanılarak otomatik olarak puanlanabileceği gösterilmiştir. MN testini gerçekleştirmek için IFC’yi kullanarak, mikroskopiye kıyasla çok daha fazla hücrenin daha kısa sürede otomatik skorlaması elde edilebilir.
Bu çalışma, daha önce açıklanan bir görüntü analizi iş akışı16’dan sapmaktadır ve Amnis AI yazılımını (bundan böyle “AI yazılımı” olarak anılacaktır) kullanarak bir Rastgele Orman (RF) ve / veya evrişimli sinir ağı (CNN) modeli geliştirmek ve eğitmek için gereken tüm adımları tartışmaktadır. AI destekli etiketleme araçlarını kullanarak zemin gerçeği verilerinin doldurulması, model eğitim sonuçlarının yorumlanması ve modelin ek verileri sınıflandırmak için uygulanması, genotoksisite ve sitotoksisitenin hesaplanmasına izin verilmesi dahil olmak üzere gerekli tüm adımlar açıklanmaktadır15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada sunulan çalışma, MN testinin puanlamasını otomatikleştirmek için derin öğrenme algoritmalarının kullanımını açıklamaktadır. Son zamanlarda yapılan birkaç yayın, sezgisel, etkileşimli araçların, derinlemesine hesaplama bilgisine ihtiyaç duymadan görüntü verilerini analiz etmek için derin öğrenme modellerinin oluşturulmasına izin verdiğini göstermiştir18,19. Kullanıcı arayüzü güdümlü bir yazılım paketi kullanılara…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hiç kimse.
Materials
| 15 mL centrifuge tube | Falcon | 352096 | |
| Cleanser – Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546931 | Fill container with 200 mL of Cleanser. https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/ 1/0/asc/2/8546931///0/1//0/ |
| Colchicine | MilliporeSigma | 64-86-8 | |
| Corning bottle-top vacuum filter | MilliporeSigma | CLS430769 | 0.22 µm filter, 500 mL bottle |
| Cytochalasin B | MilliporeSigma | 14930-96-2 | 5 mg bottle |
| Debubbler – 70% Isopropanol | MilliporeSigma | 1.3704 | Fill container with 200 mL of Debubbler. http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | MilliporeSigma | 67-68-5 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | EMD Millipore | BSS-1006-B | PBS Ca++MG++ Free |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
| Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences, Inc. | 04018 | This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed. Irritating to the eyes, respiratory systems and skin. May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes. Potential cancer hazard. http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/ |
| Guava Muse Cell Analyzer | Luminex | 0500-3115 | A standard configuration Guava Muse Cell Analyzer was used. |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | 10 mg/mL solution |
| Mannitol | MilliporeSigma | 69-65-8 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids 100X | HyClone | SH30238.01 | |
| MIFC – ImageStreamX Mark II | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405 nm, 488 nm, and 642 nm lasers was used. |
| MIFC analysis software – IDEAS | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | "Image analysis sofware" The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII) |
| MIFC software – INSPIRE | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | "Image acquisition software" This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII) |
| Amnis AI software | Luminex, a DiaSorin company | 100221 | "AI software" This is the software that permits the creation of artificial intelligence models to analyze data |
| Mitomycin C | MilliporeSigma | 50-07-7 | |
| NEAA Mixture 100x | Lonza BioWhittaker | 13-114E | |
| Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X | Gibco | 15070063 | |
| Potassium Chloride (KCl) | MilliporeSigma | P9541 | |
| Rinse – Ultrapure water or deionized water | NA | NA | Use any ultrapure water or deionized water. Fill container with 900 mL of Rinse. |
| RNase | MilliporeSigma | 9001-99-4 | |
| RPMI-1640 Medium 1x | HyClone | SH30027.01 | |
| Sheath – PBS | MilliporeSigma | BSS-1006-B | This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x Ca++MG++ free. Fill container with 900 mL of Sheath. |
| Sterile water | HyClone | SH30529.01 | |
| Sterilizer – 0.4%–0.7% Hypochlorite | VWR | JT9416-1 | This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water. Fill container with 200 mL of Sterilzer. |
| T25 flask | Falcon | 353109 | |
| T75 flask | Falcon | 353136 | |
| TK6 cells | MilliporeSigma | 95111735 |
References
- Fenech, M., et al. HUMN project initiative and review of validation, quality control and prospects for further development of automated micronucleus assays using image cytometry systems. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 216 (5), 541-552 (2013).
- OECD. Test No. 487: In Vitro Mammalian Cell Micronucleus Test. Section 4. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. , (2016).
- Fenech, M. The in vitro micronucleus technique. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 455 (1), 81-95 (2000).
- Bonassi, S., et al. An increased micronucleus frequency in peripheral blood lymphocytes predicts the risk of cancer in humans. Carcinogenesis. 28 (3), 625-631 (2007).
- Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols. 2 (5), 1084-1104 (2007).
- Fenech, M. Commentary on the SFTG international collaborative study on the in vitro micronucleus test: To Cyt-B or not to Cyt-B. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 607 (1), 9-12 (2006).
- Seager, A. L., et al. Recommendations, evaluation and validation of a semi-automated, fluorescent-based scoring protocol for micronucleus testing in human cells. Mutagenesis. 29 (3), 155-164 (2014).
- Rossnerova, A., Spatova, M., Schunck, C., Sram, R. J. Automated scoring of lymphocyte micronuclei by the MetaSystems Metafer image cytometry system and its application in studies of human mutagen sensitivity and biodosimetry of genotoxin exposure. Mutagenesis. 26 (1), 169-175 (2011).
- Bryce, S. M., Bemis, J. C., Avlasevich, S. L., Dertinger, S. D. In vitro micronucleus assay scored by flow cytometry provides a comprehensive evaluation of cytogenetic damage and cytotoxicity. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 630 (1), 78-91 (2007).
- Avlasevich, S. L., Bryce, S. M., Cairns, S. E., Dertinger, S. D. In vitro micronucleus scoring by flow cytometry: Differential staining of micronuclei versus apoptotic and necrotic chromatin enhances assay reliability. Environmental and Molecular Mutagenesis. 47 (1), 56-66 (2006).
- Basiji, D. A. Principles of Amnis imaging flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 1389, 13-21 (2016).
- Rodrigues, M. A. Automation of the in vitro micronucleus assay using the Imagestream® imaging flow cytometer. Cytometry Part A. 93 (7), 706-726 (2018).
- Verma, J. R., et al. Investigating FlowSight® imaging flow cytometry as a platform to assess chemically induced micronuclei using human lymphoblastoid cells in vitro. Mutagenesis. 33 (4), 283-289 (2018).
- Wills, J. W., et al. Inter-laboratory automation of the in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning. Archives of Toxicology. 95 (9), 3101-3115 (2021).
- Rodrigues, M. A., et al. The in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning. Npj Systems Biology and Applications. 7 (1), 20 (2021).
- Rodrigues, M. A. An automated method to perform the in vitro micronucleus assay using multispectral imaging flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (147), e59324 (2019).
- Lovell, D. P., et al. Analysis of negative historical control group data from the in vitro micronucleus assay using TK6 cells. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 825, 40-50 (2018).
- Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).
- Hennig, H., et al. An open-source solution for advanced imaging flow cytometry data analysis using machine learning. Methods. 112, 201-210 (2017).
