Automatisering av mikronukleusanalysen ved hjelp av bildestrømningscytometri og kunstig intelligens
Summary
Mikronukleusanalysen (MN) er en veletablert test for å kvantifisere DNA-skade. Å score analysen ved hjelp av konvensjonelle teknikker som manuell mikroskopi eller funksjonsbasert bildeanalyse er imidlertid arbeidskrevende og utfordrende. Denne artikkelen beskriver metodikken for å utvikle en kunstig intelligensmodell for å skåre MN-analysen ved hjelp av avbildningsflowcytometridata.
Abstract
Mikronukleusanalysen (MN) brukes over hele verden av reguleringsorganer for å evaluere kjemikalier for genetisk toksisitet. Analysen kan utføres på to måter: ved å score MN i en gang delt, cytokinesisblokkerte binukleerte celler eller fullt delte mononukleerte celler. Historisk sett har lysmikroskopi vært gullstandardmetoden for å score analysen, men den er arbeidskrevende og subjektiv. Flowcytometri har blitt brukt de siste årene for å skåre analysen, men er begrenset av manglende evne til visuelt å bekrefte viktige aspekter ved cellulære bilder. Imaging flow cytometry (IFC) kombinerer bildeopptak med høy gjennomstrømning og automatisert bildeanalyse, og har blitt brukt til raskt å skaffe bilder av og score alle viktige hendelser i MN-analysen. Nylig har det blitt demonstrert at kunstig intelligens (AI) metoder basert på konvolusjonelle nevrale nettverk kan brukes til å score MN-analysedata innhentet av IFC. Denne rapporten beskriver alle trinnene for å bruke AI-programvare til å opprette en dyplæringsmodell for å score alle viktige hendelser og bruke denne modellen til å automatisk score tilleggsdata. Resultatene fra AI-dyplæringsmodellen kan sammenlignes godt med manuell mikroskopi, og muliggjør derfor helautomatisk skåring av MN-analysen ved å kombinere IFC og AI.
Introduction
Mikronukleusanalysen (MN) er grunnleggende i genetisk toksikologi for å evaluere DNA-skade i utviklingen av kosmetikk, legemidler og kjemikalier til menneskelig bruk 1,2,3,4. Mikrokjerner er dannet av hele kromosomer eller kromosomfragmenter som ikke innlemmes i kjernen etter deling og kondenserer til små, sirkulære legemer atskilt fra kjernen. Dermed kan MN brukes som et endepunkt for å kvantifisere DNA-skade i gentoksisitetstesting1.
Den foretrukne metoden for å kvantifisere MN er innenfor en gang delte binucleated celler (BNCs) ved å blokkere deling ved hjelp av Cytochalasin-B (Cyt-B). I denne versjonen av analysen vurderes cytotoksisitet også ved å skåre mononukleerte (MONO) og polynukleerte (POLY) celler. Analysen kan også utføres ved å score MN i ikke-blokkerte MONO-celler, som er raskere og lettere å score, med cytotoksisitet som vurderes ved bruk av celletall før og etter eksponering for å vurdere spredning 5,6.
Fysisk skåring av analysen har historisk blitt utført ved manuell mikroskopi, da dette muliggjør visuell bekreftelse av alle viktige hendelser. Manuell mikroskopi er imidlertid utfordrende og subjektivt1. Dermed har automatiserte teknikker blitt utviklet, inkludert mikroskoplysbildeskanning og flowcytometri, hver med sine egne fordeler og begrensninger. Mens lysbildeskanningsmetoder gjør det mulig å visualisere viktige hendelser, må lysbilder opprettes med optimal celletetthet, noe som kan være vanskelig å oppnå. I tillegg mangler denne teknikken ofte cytoplasmatisk visualisering, noe som kan kompromittere poengsummen til MONO- og POLY-celler 7,8. Mens flowcytometri gir høy gjennomstrømningsdatafangst, må cellene lyseres, og dermed ikke tillate bruk av Cyt-B-formen av analysen. I tillegg, som en ikke-avbildningsteknikk, gir konvensjonell flowcytometri ikke visuell validering av viktige hendelser 9,10.
Derfor har bildeblødningscytometri (IFC) blitt undersøkt for å utføre MN-analysen. ImageStreamX Mk II kombinerer hastigheten og den statistiske robustheten til konvensjonell flowcytometri med de høyoppløselige bildeegenskapene til mikroskopi i ett enkelt system11. Det har vist seg at ved å bruke IFC kan høyoppløselige bilder av alle viktige hendelser tas og automatisk scores ved hjelp av funksjonsbaserte12,13 eller kunstig intelligens (AI) teknikker14,15. Ved å bruke IFC til å utføre MN-analysen, er automatisk scoring av mange flere celler sammenlignet med mikroskopi på kortere tid oppnåelig.
Dette arbeidet avviker fra en tidligere beskrevet arbeidsflyt for bildeanalyse16 og diskuterer alle trinnene som kreves for å utvikle og trene en Random Forest (RF) og/eller konvolusjonell nevral nettverksmodell (CNN) ved hjelp av Amnis AI-programvaren (heretter referert til som “AI-programvare”). Alle nødvendige trinn er beskrevet, inkludert utfylling av sannhetsdata ved hjelp av AI-assisterte merkingsverktøy, tolkning av modellopplæringsresultater og anvendelse av modellen for å klassifisere tilleggsdata, som tillater beregning av gentoksisitet og cytotoksisitet15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Arbeidet som presenteres her beskriver bruken av dype læringsalgoritmer for å automatisere scoringen av MN-analysen. Flere nyere publikasjoner har vist at intuitive, interaktive verktøy gjør det mulig å lage dype læringsmodeller for å analysere bildedata uten behov for dyptgående beregningskunnskap18,19. Protokollen beskrevet i dette arbeidet ved hjelp av en brukergrensesnittdrevet programvarepakke er designet for å fungere godt med svært store datafile…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ingen.
Materials
| 15 mL centrifuge tube | Falcon | 352096 | |
| Cleanser – Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546931 | Fill container with 200 mL of Cleanser. https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/ 1/0/asc/2/8546931///0/1//0/ |
| Colchicine | MilliporeSigma | 64-86-8 | |
| Corning bottle-top vacuum filter | MilliporeSigma | CLS430769 | 0.22 µm filter, 500 mL bottle |
| Cytochalasin B | MilliporeSigma | 14930-96-2 | 5 mg bottle |
| Debubbler – 70% Isopropanol | MilliporeSigma | 1.3704 | Fill container with 200 mL of Debubbler. http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | MilliporeSigma | 67-68-5 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | EMD Millipore | BSS-1006-B | PBS Ca++MG++ Free |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
| Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences, Inc. | 04018 | This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed. Irritating to the eyes, respiratory systems and skin. May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes. Potential cancer hazard. http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/ |
| Guava Muse Cell Analyzer | Luminex | 0500-3115 | A standard configuration Guava Muse Cell Analyzer was used. |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | 10 mg/mL solution |
| Mannitol | MilliporeSigma | 69-65-8 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids 100X | HyClone | SH30238.01 | |
| MIFC – ImageStreamX Mark II | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405 nm, 488 nm, and 642 nm lasers was used. |
| MIFC analysis software – IDEAS | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | "Image analysis sofware" The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII) |
| MIFC software – INSPIRE | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | "Image acquisition software" This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII) |
| Amnis AI software | Luminex, a DiaSorin company | 100221 | "AI software" This is the software that permits the creation of artificial intelligence models to analyze data |
| Mitomycin C | MilliporeSigma | 50-07-7 | |
| NEAA Mixture 100x | Lonza BioWhittaker | 13-114E | |
| Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X | Gibco | 15070063 | |
| Potassium Chloride (KCl) | MilliporeSigma | P9541 | |
| Rinse – Ultrapure water or deionized water | NA | NA | Use any ultrapure water or deionized water. Fill container with 900 mL of Rinse. |
| RNase | MilliporeSigma | 9001-99-4 | |
| RPMI-1640 Medium 1x | HyClone | SH30027.01 | |
| Sheath – PBS | MilliporeSigma | BSS-1006-B | This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x Ca++MG++ free. Fill container with 900 mL of Sheath. |
| Sterile water | HyClone | SH30529.01 | |
| Sterilizer – 0.4%–0.7% Hypochlorite | VWR | JT9416-1 | This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water. Fill container with 200 mL of Sterilzer. |
| T25 flask | Falcon | 353109 | |
| T75 flask | Falcon | 353136 | |
| TK6 cells | MilliporeSigma | 95111735 |
Riferimenti
- Fenech, M., et al. HUMN project initiative and review of validation, quality control and prospects for further development of automated micronucleus assays using image cytometry systems. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 216 (5), 541-552 (2013).
- OECD. Test No. 487: In Vitro Mammalian Cell Micronucleus Test. Section 4. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. , (2016).
- Fenech, M. The in vitro micronucleus technique. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 455 (1), 81-95 (2000).
- Bonassi, S., et al. An increased micronucleus frequency in peripheral blood lymphocytes predicts the risk of cancer in humans. Carcinogenesis. 28 (3), 625-631 (2007).
- Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols. 2 (5), 1084-1104 (2007).
- Fenech, M. Commentary on the SFTG international collaborative study on the in vitro micronucleus test: To Cyt-B or not to Cyt-B. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 607 (1), 9-12 (2006).
- Seager, A. L., et al. Recommendations, evaluation and validation of a semi-automated, fluorescent-based scoring protocol for micronucleus testing in human cells. Mutagenesis. 29 (3), 155-164 (2014).
- Rossnerova, A., Spatova, M., Schunck, C., Sram, R. J. Automated scoring of lymphocyte micronuclei by the MetaSystems Metafer image cytometry system and its application in studies of human mutagen sensitivity and biodosimetry of genotoxin exposure. Mutagenesis. 26 (1), 169-175 (2011).
- Bryce, S. M., Bemis, J. C., Avlasevich, S. L., Dertinger, S. D. In vitro micronucleus assay scored by flow cytometry provides a comprehensive evaluation of cytogenetic damage and cytotoxicity. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 630 (1), 78-91 (2007).
- Avlasevich, S. L., Bryce, S. M., Cairns, S. E., Dertinger, S. D. In vitro micronucleus scoring by flow cytometry: Differential staining of micronuclei versus apoptotic and necrotic chromatin enhances assay reliability. Environmental and Molecular Mutagenesis. 47 (1), 56-66 (2006).
- Basiji, D. A. Principles of Amnis imaging flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 1389, 13-21 (2016).
- Rodrigues, M. A. Automation of the in vitro micronucleus assay using the Imagestream® imaging flow cytometer. Cytometry Part A. 93 (7), 706-726 (2018).
- Verma, J. R., et al. Investigating FlowSight® imaging flow cytometry as a platform to assess chemically induced micronuclei using human lymphoblastoid cells in vitro. Mutagenesis. 33 (4), 283-289 (2018).
- Wills, J. W., et al. Inter-laboratory automation of the in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning. Archives of Toxicology. 95 (9), 3101-3115 (2021).
- Rodrigues, M. A., et al. The in vitro micronucleus assay using imaging flow cytometry and deep learning. Npj Systems Biology and Applications. 7 (1), 20 (2021).
- Rodrigues, M. A. An automated method to perform the in vitro micronucleus assay using multispectral imaging flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (147), e59324 (2019).
- Lovell, D. P., et al. Analysis of negative historical control group data from the in vitro micronucleus assay using TK6 cells. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 825, 40-50 (2018).
- Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).
- Hennig, H., et al. An open-source solution for advanced imaging flow cytometry data analysis using machine learning. Methods. 112, 201-210 (2017).
