個々の骨格筋からの静止幹細胞集団の分離
Summary
このプロトコルは、マウスの個々の骨格筋からの筋幹細胞および線維脂肪原性前駆細胞の単離について説明しています。このプロトコルには、単一筋解剖、蛍光活性化細胞選別による幹細胞の単離、免疫蛍光染色による純度評価、および5-エチニル-2′-デオキシウリジン取り込みアッセイによるS期侵入の定量的測定が含まれます。
Abstract
骨格筋には、組織の恒常性と修復に寄与する成体幹細胞の明確な集団があります。骨格筋幹細胞(MuSC)は新しい筋肉を作る能力を持っていますが、線維脂肪原性前駆細胞(FAP)は間質支持組織に寄与し、線維芽細胞や脂肪細胞を作る能力を持っています。MuSCとFAPはどちらも、静止と呼ばれる長期の可逆的な細胞周期の出口の状態で存在します。静止状態は、それらの機能の鍵です。静止幹細胞は、通常、単一のサンプルに一緒にプールされた複数の筋肉組織から精製されます。しかし、最近の研究では、異なる筋肉から単離されたMuSCの分子プロファイルと静止深度に明確な違いがあることが明らかになりました。本プロトコルは、個々の骨格筋からのMuSCおよびFAPの単離および研究について説明し、幹細胞活性化の分子分析を実行するための戦略を提示します。横隔膜、上腕三頭筋、グラシリス、前脛骨筋(TA)、腓腹筋(GA)、ヒラメ筋、長指伸筋(EDL)、咬筋など、さまざまな発達起源、厚さ、機能の筋肉を分離して消化する方法について詳しく説明します。MuSCおよびFAPは、蛍光活性化セルソーティング(FACS)によって精製され、免疫蛍光染色および5-エチニル-2′-デオキシウリジン(EdU)取り込みアッセイによって分析されます。
Introduction
骨格筋は、筋幹細胞(MuSC)の存在により、再生能力が高い。MuSCは筋線維上、基底膜の下に位置し、長期にわたる可逆的な細胞周期出口1,2,3,4の静止状態で存在します。損傷を受けると、MuSCは活性化して細胞周期に入り、分化して融合して新しい筋線維を形成することができる増幅前駆細胞を生じさせます2,5。以前の研究では、MuSCが筋肉の再生に絶対に不可欠であることが示されています6,7,8。さらに、単一のMuSCは、新しい幹細胞と新しい筋線維の両方を生着させて生成することができます9。骨格筋はまた、線維脂肪原性前駆細胞(FAP)と呼ばれる間葉系間質細胞の集団を有しており、筋肉再生中のMuSC機能をサポートする上で重要な役割を果たします6,10,11,12。
筋肉の再生を調整する可能性があるため、MuSCとFAPがどのように機能するかを理解することに大きな関心が寄せられています。静止性MuSCは転写因子Pax7およびSprouty1の発現、ならびに細胞表面タンパク質カルシトニン受容体によって示され、静止性FAPは細胞表面タンパク質血小板由来成長因子受容体α(PDGFRa)によって示されます10,12,13,14,15。.以前の研究では、細胞表面マーカーと蛍光活性化セルソーティング(FACS)を使用して骨格筋からMuSCとFAPを精製できることが示されています9、15、16、17、18、19、20、21。これらのプロトコルはMuSCとFAPを研究する能力を大幅に向上させましたが、1つの欠点は、これらのプロトコルのほとんどがさまざまな筋肉組織のプールからMuSCを分離する必要があることです。私たちや他の人々からの最近の研究は、異なる組織から単離されたMuSC間の細胞表現型と遺伝子発現レベルの違いを明らかにしました22,23。横隔膜、上腕三頭筋、およびグラシリスからのMuSCは、下肢筋からのMuSCよりも速い活性化を示します22、一方、外眼筋からのMuSCは、横隔膜および下肢筋肉からのMuSCよりも速い分化を示します23。
このプロトコルでは、個々の骨格筋からのMuSCとFAPの分離について説明します(図1)。これには、横隔膜、上腕三頭筋、グラシリス、前脛骨筋(TA)、ヒラメ筋、長指伸筋(EDL)、腓腹筋(GA)、および咬筋の解剖が含まれます。解剖された筋肉は、続いてコラゲナーゼII(コラーゲンのPro-X-Gly-Proアミノ酸配列を特異的に標的とし、結合組織の分解と組織の解離を可能にするプロテアーゼ24)およびディスパーゼ(フィブロネクチンとコラーゲンIVを切断し、さらなる細胞解離を可能にするプロテアーゼ)を使用した酵素消化によって解離されます25).MuSCおよびFAPは、FACSによってシングルセル懸濁液から単離されます。細胞分析のためのダウンストリームアッセイの例として、幹細胞の活性化は5-エチニル-2′-デオキシウリジン(EdU)取り込みをアッセイすることによって決定され、細胞純度は細胞タイプ特異的マーカーPax7およびPDGFRaの免疫蛍光染色によって決定される。
Protocol
本プロトコルは、オーフス大学の動物飼育ガイドラインおよび地域の倫理規則に従って実施されました。 注:動物実験および死後のげっ歯類サンプルの取り扱いに関する地元の倫理委員会の規則を必ず遵守してください。マウスはアレルゲンの潜在的な供給源です。可能な場合は、排気換気をオンにして、アレルゲンへの過度の暴露を避けるためにワークスペースの上に?…
Representative Results
個々の骨格筋の分離に関するプロトコル(図2)に従って、地元の繁殖プログラムから中止された3匹のスイスのオスの近交系マウスから、グラシリス、TA、EDL、GA、ヒラメ筋、上腕三頭筋、マッサージ師、および横隔膜筋を分離しました(図2)。組織解離および抗体染色に続いて、個々の筋肉由来のMuSCおよびFAPをFACSによって精製した(図3<…
Discussion
良好な歩留まりを達成するために、このプロトコルの実行にはいくつかのステップが重要です。個々の筋肉は、バルク分離プロトコルで使用される筋肉の量と比較して小さな体積を有する。これにより、解剖中に筋肉が乾燥するリスクがあり、収量が低下します。これを防ぐためには、解剖直後に筋肉に培地を加えることが重要です。さらに、解剖に時間がかかる場合は、筋肉が空気にさら?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
細胞選別は、デンマークのオーフス大学のFACSコア施設で実施されました。図は Biorender.com を使用して作成されました。ウサギ抗PDGFRa抗体を共有してくれたJ.ファラップ博士に感謝します。この作業は、E.P.へのAUFF開始助成金と、ノボノルディスクフォンデンからEP(0071113)およびA.D.M.(0071116)への開始パッケージ助成金によってサポートされました。
Materials
| 1.5 mL tube( PCR performance tested, PP, 30,000 xg, DNA/DNase-/RNase-free, Low DNA binding, Sterile ) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 72.706.700 | 1.5 mL tube |
| 15 mL tube (PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, IATA, DNA/DNase-/RNase-free, Non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 62.554.502 | 15 mL tube |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube | Falcon, Fisher Scientific | 352054 | FACS tube without strainer cap |
| 5 mL polystyrene Round-bottom tube with cell-strainer cap | Falcon, Fisher Scientific | 352235 | FACS tube with strainer cap |
| 5 mL tube (PP, non sterile autoclavable) | VWR collection | 525.0946 | 5 mL tube |
| 50 mL tube( PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, ADR, DNA/DNase-/RNase-free, non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 62.547.254 | 50 mL tube |
| Alexa Fluor 555 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot: 2387458 (Cat # A31572) | |
| Alexa Fluor 647 donkey-anti mouse IgG (H+L) | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot: 2420713 (Cat#A31571) | |
| ARIA 3 | BD | FACS, Core facility Aarhus University | |
| Centrifuge 5810 | eppendorf | EP022628188 | Centrifuge |
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye | Invitrogen, Thermo Fisher | Lot: 2387287 (Cat# C10337) | Cell Proliferation Kit |
| Collagen from calf-skin | Bioreagent, Sigma Aldrich | Source: SLCK6209 (Cat# C8919) | |
| Collagenase type II | Worthington, Fisher Scientific | Lot: 40H20248 (cat# L5004177 ) | Collagenase |
| Dispase | Gibco, Fisher Scientific | Lot: 2309415 (cat# 17105-041 ) | Dispase |
| Donkey serum (non-sterile) | Sigma Aldrich, Merck | Lot: 2826455 (Cat# S30-100mL) | |
| Dumont nr. 5, 110 mm | Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1606.327 | Straight forceps with fine tips |
| Dumont nr. 7, 115 mm | Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1606.335 | Curved forceps |
| F-10 Nutrient mixture (Ham) (1x), +L-glutamine | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 2453614 (cat# 31550-023) | |
| FITC anti-mouse CD31 | BioLegend, NordicBioSite | MEC13.3 (Cat # 102506) | |
| FITC Anti-mouse CD45 | BioLegend, NordicBioSite | 30-F11 (Cat# 103108) | |
| Glacial acetic acid (100%) | EMSURE, Merck | K44104563 9Cat # 1000631000) | |
| Head over head mini-tube rotator | Fisher Scientific | 15534080 (Model no. 88861052) | Head over head mini-tube rotator |
| Horse serum | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 2482639 (cat# 10368902 ) | |
| Isotemp SWB 15 | FisherBrand, Fisher Scientific | 15325887 | Shaking water bath |
| MS2 mini-shaker | IKA | Vortex unit | |
| Needle 20 G (0.9 mm x 25 mm) | BD microlance, Fisher Scientific | 304827 | 20G needle |
| Neutral formalin buffer 10% | CellPath, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | Lot: 03822014 (Cat # HOU/1000.1002) | |
| Non-pyrogenic cell strainer (40 µM) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 83.3945.040 | Cell strainer |
| Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) | BioLegend, NordicBioSite | D7 (Cat# 108120) | |
| Pax7 primary antibody | DSHB | Lot: 2/3/22-282ug/mL (Cat# AB 528428) | |
| PBS 10x powder concentrate | Fisher BioReagents, Fisher Scientific | BP665-1 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD106 (VCAM1) | BioLegend, NordicBioSite | 429 (MVCAM.A) (Cat # 105720) | |
| Pen/strep | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 163589 (cat# 11548876 ) | |
| Pipette tips p10 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2140-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
| Pipette tips p1000 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2279-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
| Pipette tips p20 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2149P-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
| Pipette tips p200 | Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific | 2069-05 | Low retention, pre-sterilized, filter tips |
| Protective underpad | Abena | ACTC-7712 | 60 x 40cm, 8 layers |
| Rainin, pipet-lite XLS | Mettler Toledo, Thermo Scientific | 2140-05, 2149P-05, 2279-05, 2069-05 | Pipettes (P10, P20, P200, P1000) |
| Recombinant anti-PDGFR-alpha | RabMAb, abcam | AB134123 | |
| Scalpel (shaft no. 3) | Hounisen, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1902.502 | Scalpel |
| Scalpel blade no. 11 | Heinz Herenz, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1902.0911 | Scalpel |
| Scanlaf mars | Labogene | class 2 cabinet: Mars | Flow bench |
| ScanR | Olympus | Microscope, Core facility Aarhus University | |
| Scissors | FST | 14568-09 | |
| Series 8000 DH | Thermo Scientific | 3540-MAR | Incubator |
| Serological pipette 10 mL | VWR | 612-3700 | Sterile, non-pyrogenic |
| Serological pipette 5 mL | VWR, Avantor delivered by VWR | 612-3702 | Sterile, non-pyrogenic |
| Syringe 5 mL, Luer tip (6%), sterile | BD Emerald, Fisher Scientific | 307731 | Syringe |
| TC Dish 100, standard | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 83.3902 | Petri dish |
| Tissue Culture (TC)-treated surface, black polystyrene, flat bottom, sterile, lid, pack of 20 | Corning, Sigma Aldrich | 3764 | 96-well Half bottom plate |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich, Merck | Source: SLCJ6163 (Cat # T8787) |
Riferimenti
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Citazione di questo articolo
Frimand, Z., Das Barman, S., Kjær, T. R., Porpiglia, E., de Morrée, A. Isolation of Quiescent Stem Cell Populations from Individual Skeletal Muscles. J. Vis. Exp. (190), e64557, doi:10.3791/64557 (2022).