Rilevazione di proteine prioniche anomale mediante immunoistochimica

Sommario

L'immunomarcatura della proteina prionica anomala utilizzando protocolli immunoistochimici richiede specifiche metodologie di preparazione di campioni e anticorpi anti-PrP. Il presente protocollo descrive i passaggi chiave del demasking degli epitopi per garantire una corretta etichettatura immunologica della PrP e per ridurre al minimo la colorazione di fondo non specifica. Inoltre, questo approccio considera le misure di biosicurezza quando si conducono studi di immunoistochimica con i tessuti infetti da prioni.

Abstract

Le proteine prioniche anomale (PrP^Sc) sono l'isoforma associata alla malattia della proteina prionica cellulare e i marcatori diagnostici delle encefalopatie spongiformi trasmissibili (TSE). Queste malattie neurodegenerative colpiscono l'uomo e diverse specie animali e comprendono la scrapie, l'encefalopatia spongiforme bovina zoonotica (BSE), la malattia del deperimento cronico dei cervidi (CWD) e la malattia da prioni del cammello (CPD) recentemente identificata. La diagnosi di TSE si basa sull'immunorilevazione della PrP^Sc mediante l'applicazione sia dell'immunoistochimica (IHC) che dei metodi immunoblot occidentali (WB) sui tessuti dell'encefalo, vale a dire il tronco cerebrale (livello obex). IHC è un metodo ampiamente utilizzato che utilizza anticorpi primari (monoclonali o policlonali) contro antigeni di interesse nelle cellule di una sezione tissutale. Il legame anticorpo-antigene può essere visualizzato da una reazione di colore che rimane localizzata nell'area del tessuto o della cellula in cui l'anticorpo è stato preso di mira. Pertanto, nelle malattie da prioni, come in altri campi di ricerca, le tecniche di immunoistochimica non sono utilizzate solo per scopi diagnostici, ma anche negli studi di patogenesi. Tali studi prevedono la rilevazione dei modelli e dei tipi di PrP^Sc da quelli precedentemente descritti per identificare i nuovi ceppi prionici. Poiché la BSE può infettare l'uomo, si raccomanda di utilizzare strutture e/o pratiche di laboratorio di biosicurezza di livello 3 (BSL-3) per manipolare campioni di bovini, piccoli ruminanti e cervidi inclusi nella sorveglianza delle TSE. Inoltre, si raccomandano attrezzature di contenimento e dedicate ai prioni, quando possibile, per limitare la contaminazione. La procedura PrP^Sc IHC consiste in una fase di epitopo dell'acido formico che agisce anche come misura di inattivazione dei prioni, poiché i tessuti fissati in formalina e incorporati in paraffina utilizzati in questa tecnica rimangono infettivi. Nell'interpretare i risultati, è necessario prestare attenzione a distinguere l'immunomarcatura non specifica dall'etichettatura target. A tal fine, è importante riconoscere gli artefatti dell'immunomarcatura ottenuti in animali di controllo TSE-negativi noti per differenziarli da specifici tipi di immunomarcatura PrP^Sc , che possono variare tra ceppi di TSE, specie ospiti e genotipo prnp , ulteriormente descritti nel presente documento.

Introduzione

Secondo l'ipotesi prionica, l'isoforma anomala (PrP^Sc) è l'unico componente primario dell'agente infettivo nelle encefalopatie spongiformi trasmissibili (TSE). La conferma per la diagnosi di TSE si basa sull'immunorilevazione della PrP^Sc mediante l'applicazione di protocolli immunoistochimici (IHC) e/o metodi immunoblot occidentali (WB) dei tessuti dell'encefalo¹.

L'IHC è un metodo che impiega anticorpi monoclonali o, in alcuni casi, policlonali (come anticorpi primari) come primo passo nell'immunocolorazione di antigeni di interesse specificamente mirati situati nelle cellule di una sezione tis....

Protocollo

La procedura IHC qui descritta è una componente del progetto di ricerca FAIRJ-CT98-7021, "The establishment of a European network for the surveillance of ruminant TSE and the standardization and harmonization of the process and criteria for the identification of suspect cases". Segue i criteri diagnostici definiti dall'Organizzazione mondiale per la salute animale, WOAH (precedentemente denominato Office International des Épizooties, OIE)¹ e European Reference Laboratory for animal TSE ^8,11. La procedura IHC descritta è anche accreditata secondo NPISOIEC17025 (requisiti generali per la ....

Risultati

Dato che è possibile una marcatura immunomarcatrice bersaglio non specifica, è importante accertare il livello di immunomarcatura non specifica negli animali di controllo noti TSE-negativi. Questo è un passo importante per interpretare correttamente specifici immunolabeling PrP^{Sc 7} (Figura 2). È stato notato che la marcatura non bersaglio da parte di anticorpi anti-PrP si verifica come colorazione intraneuronale discreta del particolato fine (più .......

Discussione

Le TSE sono potenziali malattie zoonotiche. Dopo la comparsa della BSE nel 1986 nel Regno Unito, il Portogallo è diventato uno degli Stati membri dell'Unione europea con una maggiore incidenza di questa malattia^14,15. Al fine di controllare questa malattia, altre TSE che sono emerse (scrapie classica e atipica, varianti della BSE, e attualmente la sorveglianza della malattia del deperimento cronico nei cervidi), meccanismi di sorveglianza sono stati sviluppati da.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Etanolo assoluto	Labchem	LB0507-9010	Non dituled
			Diluito al 90%, 70% e 50% in acqua distillata
Complesso avidina-biotina e perossidasi Kit Vectastain Elite ABC Perossidasi	Vector Laboratories	PK-6100	Preparare e mescolare delicatamente 30 minuti prima dell'uso secondo le istruzioni del kit. Non mescolare dopo essere stati in piedi.
Anticorpo secondario biotinilato (IgG H+L anti-topo equino)	Vector Laboratories	BA-2000-1.5	Diluire a 1/200 in TBS con il 10% di siero normale di cavallo. Preparare il volume richiesto in base al numero di sezioni.
Cromogeno Diaminobenzidina - DAB, kit substrato, perossidasi	Vector Laboratories	SK-4100	Preparare prima dell'uso secondo le istruzioni del kit. Utilizzare 400 µ L di soluzione per sezione.
Camera a pressione di DakoCytomation Pascal	DAKO	S2800
Ehrlich' s Ematossilina:
Ematossilina	Merck	115938	Sciogliere 2 g di ematossilina in 100 ml di etanolo assoluto. Aggiungere 100 ml di acqua distillata, 10 ml di acido acetico glaciale e 15 g di allume di potassio mescolando costantemente. Aggiungere 100 ml di glicerina. Il processo di ossidazione naturale dura 2 mesi, prima dell'uso.
Etanolo assoluto	Labchem	LB0507-9010
Acido acetico glaciale	Merck	101830
Allume di potassio	Merck	1.01047.1000
Glicerina	Merck	1.04091.1000
Soluzione di blocco perossidasi endogena (concentrazione 3% H2O2):			40 mL Perossido di idrogeno (30% p/p) in 360 mL Metanolo. Preparare prima dell'uso
Perossido di idrogeno (30% p/p)	Scharlau	HI0136
Metanolo	Sigma Aldrich	322415-2L
Acido formico 98%	Merck	1.00264.1000	Microtomo non
diluito	Microtomo	Shandon-AS325	Shandon-AS325
Supporto di montaggio Entellan	Merck	107960	Pronto all'uso.
Siero normale (20%) blocco soluzione in TBS: Siero normale di cavallo	Gibco	16050-122	Preparare il volume finale in base al numero di sezioni nel saggio (200 µ L di soluzione per sezione).
Anticorpo primario anti-PrP Mouse MAb 2G11	BIORAD	MCA2460	PrP 146-R154R171182 Ovino compresa scrapie atipica, cervino, felino. Non adatto per bovini. A seconda del numero di sezioni nel test (200 &5; L di soluzione per sezione) e diluizione dell'anticorpo, preparare il volume finale in TBS integrato con il 10% del siero normale della specie in cui è stato sollevato l'anticorpo secondario (siero normale di cavallo) Diluizione abituale dell'anticorpo: MAb 2G11 1/100 ma la diluizione di lavoro deve essere stabilita in ogni nuovo lotto per ottenere la concentrazione per fornire l'etichettatura più forte con il fondo più basso. Per lo stoccaggio, congelare volumi di aliquote di almeno 10 μ L in microprovette sterili. Scongelare e utilizzare un'aliquota alla volta.
Anticorpo primario anti-PrP Mouse MAb 12F10	Cayman  Azienda chimica	189710	PrP142-160 Bovino, non adatto per ovino Diluizione anticorpale usuale: 1/200 ma deve essere stabilita anche la diluizione operativa. Preparare come MAb 2G11
Shandon CoverplateTM camera	Thermo Scientific
Shandon Sequenza® Centro di colorazione immunitaria	Thermo Scientific	73300001
Shandon Sequenza® Thermo	Scientific	di 73310017
tampone citrato (10 mM pH 6,1):			2,55 g di citrato trisodico diidrato e 0,255 g di acido citrico in un litro di acqua purificata. Regolare il pH della soluzione di lavoro a 6,1 utilizzando 10 mM di soluzione di acido citrico (1,05 g di acido citrico in 500 mL di acqua purificata) Preparare il giorno del test.
Citrato trisodico diidrato	Sigma-aldrich	S4641-500G
Acido citrico	Sigma Aldrich	C0759
Barattolo e cestello per la colorazione	Deltalab	19360
		19361
Vetrini per microscopio Superfrost Plus	VWR	631-0108
Soluzione salina tamponata con tris (TBS) (50 mM DI BASE TRIZMA; 0,8% NaCI; pH 7,6):			10xTBS (soluzione madre 0,5 M BASE TRIZMA; 8% NaCI; pH 7,6): TRIZMA BASE 60,57 g e NaCl 80 g in 800 mL di acqua purificata. Regolare il pH della soluzione madre utilizzando acido cloridrico al 37% e il volume finale a un litro con acqua purificata (mantenere 5± 3 ° C fino a 2 mesi) Diluire la soluzione madre TBS 1/10 il giorno del test.
TRIZMA BASE	Sigma Aldrich	T6066-1KG
Cloruro di sodio (NaCl)	Merck	106404
xilene	Reagenti Panreac Applied Chem ITW	251769	non diluiti

72110017 Soluzione