टिक सेल लाइनों में फ्लोरोसेंट प्रोटीन-व्यक्त शटल वेक्टर के साथ रिकेट्सिया एसपीपी को बदलने के लिए एक इलेक्ट्रोपोरेशन विधि
Summary
इलेक्ट्रोपोरेशन जीनस रिकेट्सिया में बहिर्जात डीएनए को पेश करने के लिए एक तेजी से, व्यापक रूप से अपनाया गया तरीका है। यह प्रोटोकॉल जीनस रिकेट्सिया में इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया के परिवर्तन के लिए एक उपयोगी इलेक्ट्रोपोरेशन विधि प्रदान करता है।
Abstract
रिकेट्सियोस जीनस रिकेट्सिया से संबंधित इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया की एक विस्तृत श्रृंखला के कारण होते हैं जिन्हें संक्रमित आर्थ्रोपोड वैक्टर के काटने के माध्यम से कशेरुक मेजबानों को प्रेषित किया जा सकता है। आज तक, निदान में कठिनाई के कारण उभरते या फिर से उभरने वाले महामारी रिकेट्सियोस एक सार्वजनिक स्वास्थ्य जोखिम बने हुए हैं, क्योंकि नैदानिक विधियां सीमित हैं और मानकीकृत या सार्वभौमिक रूप से सुलभ नहीं हैं। संकेतों और लक्षणों की पहचान की कमी के परिणामस्वरूप गलत निदान एंटीबायोटिक उपचार में देरी और खराब स्वास्थ्य परिणामों का परिणाम हो सकता है। रिकेट्सिया विशेषताओं की एक व्यापक समझ अंततः बीमारी के बेहतर नियंत्रण और रोकथाम के साथ नैदानिक निदान, मूल्यांकन और उपचार में सुधार करेगी।
रिकेट्सियल जीन के कार्यात्मक अध्ययन रोगजनन में उनकी भूमिका को समझने के लिए महत्वपूर्ण हैं। यह पेपर शटल वेक्टर pRAM18dSFA के साथ रिकेट्सिया पार्करी स्ट्रेन टेट के हेल के इलेक्ट्रोपोरेशन और एंटीबायोटिक दवाओं (स्पेक्टिनोमाइसिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन) के साथ टिक सेल कल्चर में रूपांतरित आर पार्करी के चयन के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन करता है। कोंफोकल इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके टिक कोशिकाओं में रूपांतरित आर पार्केरी के स्थानीयकरण के लिए एक विधि भी वर्णित है, जो वेक्टर सेल लाइनों में परिवर्तन की जांच के लिए एक उपयोगी तकनीक है। इसी तरह के दृष्टिकोण अन्य रिकेट्सिया के परिवर्तन के लिए भी उपयुक्त हैं।
Introduction
रिकेट्सियोस इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया की एक विस्तृत श्रृंखला के कारण होते हैं जो जीनस रिकेट्सिया (परिवार रिकेट्सियासी, ऑर्डर रिकेट्सियल्स) से संबंधित हैं। जीनस रिकेट्सिया को फाइटोजेनेटिक विशेषताओं 1,2 के आधार पर चार प्रमुख समूहों में वर्गीकृत किया गया है: धब्बेदार बुखार समूह (एसएफजी), जिसमें वे रिकेट्सिया शामिल हैं जो सबसे गंभीर और घातक टिक-जनित रिकेट्सियोसिस का कारण बनते हैं (उदाहरण के लिए, रिकेट्सिया रिकेट्सी, रॉकी माउंटेन स्पॉटेड फीवर का प्रेरक एजेंट), टाइफस समूह (टीजी, उदाहरण के लिए, रिकेट्सिया प्रोवाज़ेकी, महामारी टाइफस का एजेंट), संक्रमणकालीन समूह (टीआरजी, उदाहरण के लिए, रिकेट्सिया फेलिस, पिस्सू जनित धब्बेदार बुखार का प्रेरक एजेंट), और पैतृक समूह (एजी, जैसे, रिकेट्सिया बेली)।
सबसे पुराने ज्ञात वेक्टर जनित रोगों में से, रिकेट्सियोस मुख्य रूप से संक्रमित आर्थ्रोपोड वैक्टर के काटने के माध्यम से रोगजनकों के संचरण के बाद प्राप्त किए जाते हैं, जिसमें टिक्स, पिस्सू, जूँ और घुन 3,4 शामिल हैं। यद्यपि प्रभावी एंटीबायोटिक दवाओं की खोज ने उपचार के परिणामों में सुधार किया, उभरते और फिर से उभरने वाले महामारी रिकेट्सियोसिस पारंपरिक रोकथाम और नियंत्रण रणनीतियों को चुनौती देना जारी रखते हैं। वेक्टर इंटरैक्शन की व्यापक समझ अंततः इन प्राचीन बीमारियों को रोकने और ठीक करने के लिए नए दृष्टिकोण विकसित करने के लिए एक मजबूत आधार स्थापित करेगी।
प्रकृति में, बैक्टीरिया में क्षैतिज जीन स्थानांतरण (एचजीटी) संयुग्मन, पारगमन और परिवर्तनके माध्यम से होता है। इन विट्रो बैक्टीरियल परिवर्तन इन एचजीटी अवधारणाओं का उपयोग करता है, हालांकि रिकेट्सिया की इंट्रासेल्युलर प्रकृति कुछ चुनौतियां प्रस्तुत करती है। रिकेट्सिया की विभिन्न प्रजातियों में प्रतिबंधित विकास की स्थिति और खराब समझे गए संयुग्मन और पारगमन प्रणालियों ने रिकेट्सिया 6,7,8 में संयुग्मन और पारगमन विधियों के आवेदन को रोक दिया है। अन्य बाध्यकारी इंट्रासेल्युलर बैक्टीरियल जेनेरा (जैसे, क्लैमाइडिया, कॉक्सिएला, एनाप्लाज्मा और एर्लिचिया) की तुलना में, जीनस रिकेट्सिया सेल साइटोप्लाज्म के भीतर विकास और प्रतिकृति रणनीतियों के संबंध में भिन्न होता है, जो उनकी अनूठी जीवनशैली विशेषताओं के कारण रिकेट्सिया के आनुवंशिक संशोधन के लिए विशिष्ट चुनौतियां लागू करता है।
रिकेट्सिया के आनुवंशिक संशोधन का प्रयास करते समय प्रारंभिक बाधा सफल परिवर्तन प्राप्त करना है। इस प्रकार, उच्च परिवर्तन दक्षता के साथ एक व्यवहार्य दृष्टिकोण डिजाइन करना रिकेट्सिया के लिए आनुवंशिक उपकरण विकसित करने के लिए बेहद मूल्यवान होगा। यहां, हम इलेक्ट्रोपोरेशन पर ध्यान केंद्रित करते हैं, एक व्यापक रूप से मान्यता प्राप्त परिवर्तन विधि जिसका उपयोग रिकेट्सिया की कई प्रजातियों में बहिर्जात डीएनए को सफलतापूर्वक पेश करने के लिए किया गया है, जिसमें रिकेट्सिया प्रोवाज़ेकी, रिकेट्सिया टाइफी, रिकेट्सिया कोनोरी, रिकेट्सिया पार्केरी, रिकेट्सिया मोंटनेंसिस, रिकेट्सिया बेली, रिकेट्सिया मोरी और रिकेट्सिया बुचनेरी10,11,12 शामिल हैं। , 13,14,15,16.
यह पेपर आर पार्करी स्ट्रेन टेट के हेल (परिग्रहण: GCA_000965145.1) के इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन करता है, जिसमें रिकेट्सिया एंबलियोमैटिस स्ट्रेन एएआर / एससी प्लास्मिड पीआरएएम 18 से प्राप्त शटल वेक्टर पीआरएएम 18 डीएसएफए को एमकेएटी, एक दूर-लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन और एडीए को एन्कोड करने के लिए इंजीनियर किया गया है, जो स्पेक्टिनोमाइसिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन प्रतिरोध 13,15,20 प्रदान करता है। पार्केरी टिक सेल लाइनों में एंटीबायोटिक चयन के तहत व्यवहार्य और स्थिर रूप से बनाए रखा जाता है। इसके अलावा, हम दिखाते हैं कि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से लाइव टिक कोशिकाओं में रूपांतरित आर पार्केरी के स्थानीयकरण का उपयोग वेक्टर सेल लाइनों में परिवर्तन दरों की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, हम शटल प्लास्मिड pRAM18dSFA पर एन्कोड किए गए बहिर्जात डीएनए को इलेक्ट्रोपोरेशन का उपयोग करके रिकेट्सिया में पेश करने के लिए एक विधि का प्रदर्शन करते हैं। इस प्रक्रिया में, सेल-फ्री रिकेट्सिया को मेजबा?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम टिमोथी जे कर्टी और बेंजामिन कुल को उनकी व्यावहारिक चर्चाओं और सुझावों के लिए धन्यवाद देते हैं। इस अध्ययन को एनआईएच (2R01AI049424) से U.G.M. को अनुदान और मिनेसोटा कृषि प्रयोग स्टेशन (MIN-17-078) से U.G.M. को अनुदान द्वारा वित्तीय रूप से समर्थित किया गया था।
Materials
| 0.1 cm gap gene pulser electroporation cuvette | Bio-Rad | 1652083 | |
| 2 μm pore size filter | GE Healthcare Life Sciences Whatman | 6783-2520 | |
| 5 mL Luer-lock syringe | BD | 309646 | |
| 60-90 silicon carbide grit | LORTONE, inc | 591-056 | |
| absolute methanol | Fisher Scientific | A457-4 | |
| Bacto tryptose phosphate broth | BD | 260300 | |
| Cytospin centrifuge Cytospin4 | Thermo Fisher Scientific | A78300003 | The rotor is detatchable so the whole rotor can be put into the hood to load infectious samples |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | QIAGEN | 12362 | used to obtain endotoxin-free pRAM18dSFA plasmid |
| extended fine tip transfer pipet | Perfector Scientific | TP03-5301 | |
| fetal bovine serum | Gemini Bio | 900-108 | The FBS batch has to be tested to make sure ISE6 cells will grow well in it. |
| Gene Pulser II electroporator with Pulse Controller PLUS | Bio-Rad | 165-2105 & 165-2110 | |
| hemocytometer | Thermo Fisher Scientific | 267110 | |
| HEPES | Millipore-Sigma | H4034 | |
| ImageJ Fiji | National Institute of Health | raw image editing | |
| KaryoMAX Giemsa stain | Gibco | 2021-10-30 | |
| Leibovitz's L-15 medium | Gibco | 41300039 | |
| lipoprotein concentrate | MP Biomedicals | 191476 | |
| Nikon Diaphot | Nikon | epifluorescence microscope | |
| NucBlue Live ReadyProbes Reagent | Thermo Fisher Scientific | R37605 | |
| Olympus Disc Scanning Unit (DSU) confocal microscope | Olympus | ||
| Petroff-Hausser Counting Chamber | Hausser Scientific | Chamber 3900 | |
| sodium bicarbonate | Millipore-Sigma | S5761 | |
| Vortex | Fisher Vortex Genie 2 | 12-812 |
Riferimenti
- Gillespie, J. J., et al. Plasmids and rickettsial evolution: Insight from Rickettsia felis. PLoS One. 2 (3), 266 (2007).
- Murray, G. G., Weinert, L. A., Rhule, E. L., Welch, J. J. The phylogeny of Rickettsia using different evolutionary signatures: How tree-like is bacterial evolution. Systematic Biology. 65 (2), 265-279 (2016).
- Parola, P., Paddock, C. D., Raoult, D. Tick-borne rickettsioses around the world: Emerging diseases challenging old concepts. Clinical Microbiology Reviews. 18 (4), 719-756 (2005).
- Fang, R., Blanton, L. S., Walker, D. H. Rickettsiae as emerging infectious agents. Clinics in Laboratory Medicine. 37 (2), 383-400 (2017).
- Von Wintersdorff, C. J., et al. Dissemination of antimicrobial resistance in microbial ecosystems through horizontal gene transfer. Frontiers in Microbiology. 7, 173 (2016).
- Winkler, H. H. Rickettsia species (as organisms). Annual Review of Microbiology. 44 (1), 131-153 (1990).
- Wood, D. O., Azad, A. F. Genetic manipulation of rickettsiae: A preview. Infection and Immunity. 68 (11), 6091-6093 (2000).
- Perlman, S. J., Hunter, M. S., Zchori-Fein, E. The emerging diversity of Rickettsia. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1598), 2097-2106 (2006).
- McClure, E. E., et al. Engineering of obligate intracellular bacteria: Progress, challenges and paradigms. Nature Reviews Microbiology. 15 (9), 544-558 (2017).
- Rachek, L. I., Tucker, A. M., Winkler, H. H., Wood, D. O. Transformation of Rickettsia prowazekii to rifampin resistance. Journal of Bacteriology. 180 (8), 2118-2124 (1998).
- Troyer, J. M., Radulovic, S., Azad, A. F. Green fluorescent protein as a marker in Rickettsia typhi transformation. Infection and Immunity. 67 (7), 3308-3311 (1996).
- Kim, H. K., Premaratna, R., Missiakas, D. M., Schneewind, O. Rickettsia conorii O antigen is the target of bactericidal Weil-Felix antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (39), 19659-19664 (2019).
- Burkhardt, N. Y., et al. Development of shuttle vectors for transformation of diverse Rickettsia species. PLoS One. 6 (12), 29511 (2011).
- Welch, M. D., Reed, S. C., Lamason, R. L., Serio, A. W. Expression of an epitope-tagged virulence protein in Rickettsia parkeri using transposon insertion. PloS One. 7 (5), 37310 (2012).
- Oliver, J. D., Burkhardt, N. Y., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. Motility characteristics are altered for Rickettsia bellii transformed to overexpress a heterologous rickA gene. Applied and Environmental Microbiology. 80 (3), 1170-1176 (2014).
- Kurtti, T. J., Burkhardt, N. Y., Heu, C. C., Munderloh, U. G. Fluorescent protein expressing Rickettsia buchneri and Rickettsia peacockii for tracking symbiont-tick cell interactions. Veterinary Sciences. 3 (4), 34 (2016).
- Oliver, J. D., Chávez, A. S., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. An Ixodes scapularis cell line with a predominantly neuron-like phenotype. Experimental and Applied Acarology. 66 (3), 427-442 (2015).
- Grabowski, J. M., Gulia-Nuss, M., Kuhn, R. J., Hill, C. A. RNAi reveals proteins for metabolism and protein processing associated with Langat virus infection in Ixodes scapularis (black-legged tick) ISE6 cells. Parasites & Vectors. 10 (1), 1-4 (2017).
- Al-Rofaai, A., Bell-Sakyi, L. Tick cell Lines in research on tick control. Frontiers in Physiology. 11, 152 (2020).
- Wang, X. R., et al. Mitochondrion-dependent apoptosis is essential for Rickettsia parkeri infection and replication in vector cells. mSystems. 6 (2), 01209-01220 (2021).
- Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73 (10), 3283-3290 (2007).
- Riley, S. P., Macaluso, K. R., Martinez, J. J. Electrotransformation and clonal isolation of Rickettsia species. Current Protocols in Microbiology. 39, 1-20 (2015).
- Burkhardt, N. Y., et al. Examination of rickettsial host range for shuttle vectors based on dnaA and parA genes from the pRM plasmid of Rickettsia monacensis. Applied and Environmental Microbiology. 88 (7), 00210-00222 (2022).
- Kurtti, T. J., et al. Rickettsia buchneri sp. nov., a rickettsial endosymbiont of the blacklegged tick Ixodes scapularis. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 65, 965 (2015).
- Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Formulation of medium for tick cell culture. Experimental & Applied Acarology. 7 (3), 219-229 (1989).
- Bell-Sakyi, L. Continuous cell lines from the tick Hyalomma anatolicum anatolicum. The Journal of Parasitology. 77 (6), 1006-1008 (1991).
- Mattila, J. T., Burkhardt, N. Y., Hutcheson, H. J., Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Isolation of cell lines and a rickettsial endosymbiont from the soft tick Carios capensis (Acari: Argasidae: Ornithodorinae). Journal of Medical Entomology. 44 (6), 1091-1101 (2007).
- Bell-Sakyi, L., Růžek, D., Gould, E. A. Cell lines from the soft tick Ornithodoros moubata. Experimental and Applied Acarology. 49 (3), 209-219 (2009).
