En elektroporeringsmetode for å transformere Rickettsia spp. med en fluorescerende proteinuttrykkende skyttelvektor i krysscellelinjer
Summary
Elektroporering er en rask, bredt vedtatt metode for å introdusere eksogent DNA i slekten Rickettsia. Denne protokollen gir en nyttig elektroporeringsmetode for transformasjon av obligatoriske intracellulære bakterier i slekten Rickettsia.
Abstract
Rickettsioses er forårsaket av et bredt spekter av obligatoriske intracellulære bakterier som tilhører slekten Rickettsia som kan overføres til vertebrate verter gjennom bitt av infiserte leddyrvektorer. Til dags dato forblir nye eller gjenoppståtte epidemiske rickettsioser en folkehelserisiko på grunn av vanskeligheten med diagnosen, da diagnostiske metoder er begrensede og ikke standardiserte eller universelt tilgjengelige. Feildiagnostisering som følge av manglende gjenkjennelse av tegn og symptomer kan føre til forsinket antibiotikabehandling og dårlige helseutfall. En omfattende forståelse av Rickettsia-egenskaper vil til slutt forbedre klinisk diagnose, vurdering og behandling med forbedret kontroll og forebygging av sykdommen.
Funksjonelle studier av rickettsiale gener er avgjørende for å forstå deres rolle i patogenesen. Dette papiret beskriver en prosedyre for elektroporering av Rickettsia parkeri-stammen Tate’s Hell med skyttelvektoren pRAM18dSFA og valg av transformert R. parkeri i krysscellekultur med antibiotika (spektinomycin og streptomycin). En metode er også beskrevet for lokalisering av transformert R. parkeri i kryssceller ved bruk av konfokal immunfluorescensmikroskopi, en nyttig teknikk for å kontrollere transformasjon i vektorcellelinjer. Lignende tilnærminger er også egnet for transformasjon av andre rickettsiae.
Introduction
Rickettsioses er forårsaket av et bredt spekter av obligatoriske intracellulære bakterier som tilhører slekten Rickettsia (familie Rickettsiaceae, orden Rickettsiales). Slekten Rickettsia er klassifisert i fire hovedgrupper basert på fylogenetiske egenskaper1,2: flekkfebergruppen (SFG), som inneholder de rickettsiae som forårsaker de mest alvorlige og dødelige flåttbårne rickettsiosene (f.eks. Rickettsia rickettsii, årsaksmidlet til Rocky Mountain Spotted Fever), tyfusgruppen (TG, f.eks. Rickettsia prowazekii, agenten for epidemisk tyfus), overgangsgruppen (TRG, f.eks. Rickettsia felis, det forårsakende middelet til loppebåren flekkfeber), og forfedregruppen (AG, f.eks. Rickettsia bellii).
Blant de eldste kjente vektorbårne sykdommene er rickettsioser hovedsakelig anskaffet etter overføring av patogenene gjennom biter av infiserte leddyrvektorer, inkludert flått, lopper, lus og midd 3,4. Selv om oppdagelsen av effektive antibiotika forbedret behandlingsresultatene, fortsetter nye og gjenoppståtte epidemiske rickettsioses å utfordre tradisjonelle forebyggings- og kontrollstrategier. Dermed vil en omfattende forståelse av rickettsia / vert / vektorinteraksjoner til slutt etablere et sterkt fundament for å utvikle nye tilnærminger for å forebygge og kurere disse gamle sykdommene.
I naturen skjer horisontal genoverføring (HGT) i bakterier gjennom konjugering, transduksjon og transformasjon5. In vitro bakteriell transformasjon benytter disse HGT-konseptene, selv om den intracellulære naturen til rickettsiae gir noen utfordringer. De begrensede vekstforholdene og dårlig forstått konjugerings- og transduksjonssystemer i forskjellige arter av rickettsiae har forhindret anvendelse av konjugerings- og transduksjonsmetoder i rickettsiae 6,7,8. Sammenlignet med andre obligatoriske intracellulære bakterielle slekter (f.eks. Chlamydia, Coxiella, Anaplasma og Ehrlichia), er slekten Rickettsia forskjellig med hensyn til vekst- og replikasjonsstrategiene i cellecytoplasma, noe som pålegger spesifikke utfordringer for genetisk modifisering av rickettsiae på grunn av deres unike livsstilsegenskaper9.
Den første hindringen å overvinne når man forsøker genetisk modifisering av rickettsiae er å oppnå vellykket transformasjon. Dermed vil utforming av en gjennomførbar tilnærming med høy transformasjonseffektivitet være ekstremt verdifull for å utvikle genetiske verktøy for rickettsiae. Her fokuserer vi på elektroporering, en bredt anerkjent transformasjonsmetode som har blitt brukt til å introdusere eksogent DNA med suksess i flere arter av rickettsiae, inkludert Rickettsia prowazekii, Rickettsia typhi, Rickettsia conorii, Rickettsia parkeri, Rickettsia montanensis, Rickettsia bellii, Rickettsia peacockii og Rickettsia buchneri10,11,12 ,13,14,15,16.
Dette papiret beskriver en prosedyre for elektroporering av R. parkeri-stammen Tate’s Hell (tiltredelse: GCA_000965145.1) med skyttelvektoren pRAM18dSFA avledet fra Rickettsia amblyommatis-stammen AaR / SC plasmid pRAM18 konstruert for å kode mKATE, et langt rødt fluorescerende protein, og aadA, som gir spektinomycin og streptomycinresistens13,15,20. Transformert R. parkeri er levedyktig og stabilt opprettholdt under antibiotikavalg i krysscellelinjer. I tillegg viser vi at lokalisering av transformert R. parkeri i levende flåttceller via konfokalmikroskopi kan brukes til å vurdere kvaliteten på transformasjonshastigheter i vektorcellelinjer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her demonstrerer vi en metode for å introdusere eksogent DNA kodet på skyttelplasmidet pRAM18dSFA i rickettsiae ved hjelp av elektroporering. I denne prosedyren ble cellefri rickettsiae renset fra vertsceller, transformert med en rickettsial shuttle vektor, og frigjort på flåttceller for infeksjon. Også beskrevet er en konfokal immunfluorescensprosedyre for å oppdage rød fluorescensprotein-uttrykkende R. parkeri i kryssceller. Lignende metoder gjelder for andre Rickettsia-arter , og med ytterlige…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Timothy J. Kurtti og Benjamin Cull for deres innsiktsfulle diskusjoner og forslag. Denne studien ble økonomisk støttet av et tilskudd til U.G.M. fra NIH (2R01AI049424) og et tilskudd til U.G.M. fra Minnesota Agricultural Experiment Station (MIN-17-078).
Materials
| 0.1 cm gap gene pulser electroporation cuvette | Bio-Rad | 1652083 | |
| 2 μm pore size filter | GE Healthcare Life Sciences Whatman | 6783-2520 | |
| 5 mL Luer-lock syringe | BD | 309646 | |
| 60-90 silicon carbide grit | LORTONE, inc | 591-056 | |
| absolute methanol | Fisher Scientific | A457-4 | |
| Bacto tryptose phosphate broth | BD | 260300 | |
| Cytospin centrifuge Cytospin4 | Thermo Fisher Scientific | A78300003 | The rotor is detatchable so the whole rotor can be put into the hood to load infectious samples |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | QIAGEN | 12362 | used to obtain endotoxin-free pRAM18dSFA plasmid |
| extended fine tip transfer pipet | Perfector Scientific | TP03-5301 | |
| fetal bovine serum | Gemini Bio | 900-108 | The FBS batch has to be tested to make sure ISE6 cells will grow well in it. |
| Gene Pulser II electroporator with Pulse Controller PLUS | Bio-Rad | 165-2105 & 165-2110 | |
| hemocytometer | Thermo Fisher Scientific | 267110 | |
| HEPES | Millipore-Sigma | H4034 | |
| ImageJ Fiji | National Institute of Health | raw image editing | |
| KaryoMAX Giemsa stain | Gibco | 2021-10-30 | |
| Leibovitz's L-15 medium | Gibco | 41300039 | |
| lipoprotein concentrate | MP Biomedicals | 191476 | |
| Nikon Diaphot | Nikon | epifluorescence microscope | |
| NucBlue Live ReadyProbes Reagent | Thermo Fisher Scientific | R37605 | |
| Olympus Disc Scanning Unit (DSU) confocal microscope | Olympus | ||
| Petroff-Hausser Counting Chamber | Hausser Scientific | Chamber 3900 | |
| sodium bicarbonate | Millipore-Sigma | S5761 | |
| Vortex | Fisher Vortex Genie 2 | 12-812 |
Riferimenti
- Gillespie, J. J., et al. Plasmids and rickettsial evolution: Insight from Rickettsia felis. PLoS One. 2 (3), 266 (2007).
- Murray, G. G., Weinert, L. A., Rhule, E. L., Welch, J. J. The phylogeny of Rickettsia using different evolutionary signatures: How tree-like is bacterial evolution. Systematic Biology. 65 (2), 265-279 (2016).
- Parola, P., Paddock, C. D., Raoult, D. Tick-borne rickettsioses around the world: Emerging diseases challenging old concepts. Clinical Microbiology Reviews. 18 (4), 719-756 (2005).
- Fang, R., Blanton, L. S., Walker, D. H. Rickettsiae as emerging infectious agents. Clinics in Laboratory Medicine. 37 (2), 383-400 (2017).
- Von Wintersdorff, C. J., et al. Dissemination of antimicrobial resistance in microbial ecosystems through horizontal gene transfer. Frontiers in Microbiology. 7, 173 (2016).
- Winkler, H. H. Rickettsia species (as organisms). Annual Review of Microbiology. 44 (1), 131-153 (1990).
- Wood, D. O., Azad, A. F. Genetic manipulation of rickettsiae: A preview. Infection and Immunity. 68 (11), 6091-6093 (2000).
- Perlman, S. J., Hunter, M. S., Zchori-Fein, E. The emerging diversity of Rickettsia. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1598), 2097-2106 (2006).
- McClure, E. E., et al. Engineering of obligate intracellular bacteria: Progress, challenges and paradigms. Nature Reviews Microbiology. 15 (9), 544-558 (2017).
- Rachek, L. I., Tucker, A. M., Winkler, H. H., Wood, D. O. Transformation of Rickettsia prowazekii to rifampin resistance. Journal of Bacteriology. 180 (8), 2118-2124 (1998).
- Troyer, J. M., Radulovic, S., Azad, A. F. Green fluorescent protein as a marker in Rickettsia typhi transformation. Infection and Immunity. 67 (7), 3308-3311 (1996).
- Kim, H. K., Premaratna, R., Missiakas, D. M., Schneewind, O. Rickettsia conorii O antigen is the target of bactericidal Weil-Felix antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (39), 19659-19664 (2019).
- Burkhardt, N. Y., et al. Development of shuttle vectors for transformation of diverse Rickettsia species. PLoS One. 6 (12), 29511 (2011).
- Welch, M. D., Reed, S. C., Lamason, R. L., Serio, A. W. Expression of an epitope-tagged virulence protein in Rickettsia parkeri using transposon insertion. PloS One. 7 (5), 37310 (2012).
- Oliver, J. D., Burkhardt, N. Y., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. Motility characteristics are altered for Rickettsia bellii transformed to overexpress a heterologous rickA gene. Applied and Environmental Microbiology. 80 (3), 1170-1176 (2014).
- Kurtti, T. J., Burkhardt, N. Y., Heu, C. C., Munderloh, U. G. Fluorescent protein expressing Rickettsia buchneri and Rickettsia peacockii for tracking symbiont-tick cell interactions. Veterinary Sciences. 3 (4), 34 (2016).
- Oliver, J. D., Chávez, A. S., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. An Ixodes scapularis cell line with a predominantly neuron-like phenotype. Experimental and Applied Acarology. 66 (3), 427-442 (2015).
- Grabowski, J. M., Gulia-Nuss, M., Kuhn, R. J., Hill, C. A. RNAi reveals proteins for metabolism and protein processing associated with Langat virus infection in Ixodes scapularis (black-legged tick) ISE6 cells. Parasites & Vectors. 10 (1), 1-4 (2017).
- Al-Rofaai, A., Bell-Sakyi, L. Tick cell Lines in research on tick control. Frontiers in Physiology. 11, 152 (2020).
- Wang, X. R., et al. Mitochondrion-dependent apoptosis is essential for Rickettsia parkeri infection and replication in vector cells. mSystems. 6 (2), 01209-01220 (2021).
- Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73 (10), 3283-3290 (2007).
- Riley, S. P., Macaluso, K. R., Martinez, J. J. Electrotransformation and clonal isolation of Rickettsia species. Current Protocols in Microbiology. 39, 1-20 (2015).
- Burkhardt, N. Y., et al. Examination of rickettsial host range for shuttle vectors based on dnaA and parA genes from the pRM plasmid of Rickettsia monacensis. Applied and Environmental Microbiology. 88 (7), 00210-00222 (2022).
- Kurtti, T. J., et al. Rickettsia buchneri sp. nov., a rickettsial endosymbiont of the blacklegged tick Ixodes scapularis. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 65, 965 (2015).
- Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Formulation of medium for tick cell culture. Experimental & Applied Acarology. 7 (3), 219-229 (1989).
- Bell-Sakyi, L. Continuous cell lines from the tick Hyalomma anatolicum anatolicum. The Journal of Parasitology. 77 (6), 1006-1008 (1991).
- Mattila, J. T., Burkhardt, N. Y., Hutcheson, H. J., Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Isolation of cell lines and a rickettsial endosymbiont from the soft tick Carios capensis (Acari: Argasidae: Ornithodorinae). Journal of Medical Entomology. 44 (6), 1091-1101 (2007).
- Bell-Sakyi, L., Růžek, D., Gould, E. A. Cell lines from the soft tick Ornithodoros moubata. Experimental and Applied Acarology. 49 (3), 209-219 (2009).
