En elektroporationsmetod för att omvandla Rickettsia spp.
Summary
Elektroporering är en snabb, allmänt antagen metod för att införa exogent DNA i släktet Rickettsia. Detta protokoll ger en användbar elektroporationsmetod för omvandling av obligatoriska intracellulära bakterier i släktet Rickettsia.
Abstract
Rickettsioses orsakas av ett brett spektrum av obligatoriska intracellulära bakterier som tillhör släktet Rickettsia som kan överföras till ryggradsdjursvärdar genom bett av infekterade leddjursvektorer. Hittills är nya eller återuppkommande epidemiska rickettsioses fortfarande en folkhälsorisk på grund av svårigheten att diagnostisera, eftersom diagnostiska metoder är begränsade och inte standardiserade eller allmänt tillgängliga. Feldiagnos till följd av bristande erkännande av tecken och symtom kan leda till försenad antibiotikabehandling och dåliga hälsoutfall. En omfattande förståelse av Rickettsia-egenskaper skulle i slutändan förbättra klinisk diagnos, bedömning och behandling med förbättrad kontroll och förebyggande av sjukdomen.
Funktionella studier av rickettsialgener är avgörande för att förstå deras roll i patogenesen. Detta dokument beskriver ett förfarande för elektroporering av Rickettsia parkeri-stammen Tate’s Hell med skyttelvektorn pRAM18dSFA och valet av transformerad R. parkeri i fästcellsodling med antibiotika (spektinomycin och streptomycin). En metod beskrivs också för lokalisering av transformerad R. parkeri i fästingceller med hjälp av konfokal immunofluorescensmikroskopi, en användbar teknik för att kontrollera transformation i vektorcellinjer. Liknande tillvägagångssätt är också lämpliga för omvandling av andra rickettsiae.
Introduction
Rickettsioses orsakas av ett brett spektrum av obligatoriska intracellulära bakterier som tillhör släktet Rickettsia (familj Rickettsiaceae, ordning Rickettsiales). Släktet Rickettsia klassificeras i fyra huvudgrupper baserat på fylogenetiska egenskaper1,2: den fläckiga febergruppen (SFG), som innehåller de rickettsiae som orsakar de allvarligaste och dödligaste fästingburna rickettsioserna (t.ex. Rickettsia rickettsii, orsaksmedlet för Rocky Mountain Spotted Fever), tyfusgruppen (TG, t.ex. Rickettsia prowazekii, agenten för epidemisk tyfus), övergångsgruppen (TRG, t.ex. Rickettsia felis, orsaksmedlet för loppburen fläckig feber) och förfädersgruppen (AG, t.ex. Rickettsia bellii).
Bland de äldsta kända vektorburna sjukdomarna förvärvas rickettsioses huvudsakligen efter överföring av patogenerna genom bett av infekterade leddjursvektorer, inklusive fästingar, loppor, löss och kvalster 3,4. Även om upptäckten av effektiva antibiotika förbättrade behandlingsresultaten, fortsätter nya och återuppkommande epidemiska rickettsioses att utmana traditionella förebyggande och kontrollstrategier. Således skulle en omfattande förståelse av rickettsia / värd / vektorinteraktioner i slutändan skapa en stark grund för att utveckla nya metoder för att förebygga och bota dessa gamla sjukdomar.
I naturen sker horisontell genöverföring (HGT) i bakterier genom konjugering, transduktion och transformation5. In vitro bakteriell transformation använder dessa HGT-koncept, även om rickettsiaes intracellulära natur innebär vissa utmaningar. De begränsade tillväxtförhållandena och dåligt förstådda konjugerings- och transduktionssystemen hos olika arter av rickettsiae har förhindrat tillämpningen av konjugerings- och transduktionsmetoder i rickettsiae 6,7,8. Jämfört med andra obligatoriska intracellulära bakteriesläkten (t.ex. klamydia, Coxiella, Anaplasma och Ehrlichia) skiljer sig släktet Rickettsia med avseende på tillväxt- och replikationsstrategierna inom cellcytoplasman, vilket innebär specifika utmaningar för den genetiska modifieringen av rickettsiae på grund av deras unika livsstilsegenskaper9.
Det första hindret att övervinna när man försöker genetisk modifiering av rickettsiae är att uppnå framgångsrik omvandling. Således skulle utformningen av ett genomförbart tillvägagångssätt med hög transformationseffektivitet vara extremt värdefullt för att utveckla genetiska verktyg för rickettsiae. Här fokuserar vi på elektroporation, en allmänt erkänd transformationsmetod som har använts för att framgångsrikt introducera exogent DNA i flera arter av rickettsiae, inklusive Rickettsia prowazekii, Rickettsia typhi, Rickettsia conorii, Rickettsia parkeri, Rickettsia montanensis, Rickettsia bellii, Rickettsia peacockii och Rickettsia buchneri10,11,12 ,13,14,15,16.
Detta dokument beskriver ett förfarande för elektroporering av R. parkeri-stammen Tate’s Hell (anslutning: GCA_000965145.1) med skyttelvektorn pRAM18dSFA härledd från Rickettsia amblyommatis-stammen AaR / SC-plasmid pRAM18 konstruerad för att koda mKATE, ett långt rött fluorescerande protein, och aadA, vilket ger spektinomycin och streptomycinresistens13,15,20. Transformerade R. parkeri är livskraftiga och stabilt underhållna under antibiotikaval i fästingcellinjer. Dessutom visar vi att lokaliseringen av transformerade R. parkeri i levande fästingceller via konfokalmikroskopi kan användas för att bedöma kvaliteten på transformationshastigheter i vektorcellinjer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här demonstrerar vi en metod för att införa exogent DNA kodat på skyttelplasmiden pRAM18dSFA i rickettsiae med hjälp av elektroporation. I denna procedur renades cellfri rickettsiae från värdceller, transformerades med en rickettsial shuttlevektor och släpptes ut på fästceller för infektion. Dessutom beskrivs ett konfokalt immunofluorescensförfarande för att detektera röd fluorescensproteinuttryckande R. parkeri i fästingceller. Liknande metoder är tillämpliga på andra Rickettsia-arter…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Timothy J. Kurtti och Benjamin Cull för deras insiktsfulla diskussioner och förslag. Denna studie stöddes ekonomiskt av ett bidrag till U.G.M. från NIH (2R01AI049424) och ett bidrag till U.G.M. från Minnesota Agricultural Experiment Station (MIN-17-078).
Materials
| 0.1 cm gap gene pulser electroporation cuvette | Bio-Rad | 1652083 | |
| 2 μm pore size filter | GE Healthcare Life Sciences Whatman | 6783-2520 | |
| 5 mL Luer-lock syringe | BD | 309646 | |
| 60-90 silicon carbide grit | LORTONE, inc | 591-056 | |
| absolute methanol | Fisher Scientific | A457-4 | |
| Bacto tryptose phosphate broth | BD | 260300 | |
| Cytospin centrifuge Cytospin4 | Thermo Fisher Scientific | A78300003 | The rotor is detatchable so the whole rotor can be put into the hood to load infectious samples |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | QIAGEN | 12362 | used to obtain endotoxin-free pRAM18dSFA plasmid |
| extended fine tip transfer pipet | Perfector Scientific | TP03-5301 | |
| fetal bovine serum | Gemini Bio | 900-108 | The FBS batch has to be tested to make sure ISE6 cells will grow well in it. |
| Gene Pulser II electroporator with Pulse Controller PLUS | Bio-Rad | 165-2105 & 165-2110 | |
| hemocytometer | Thermo Fisher Scientific | 267110 | |
| HEPES | Millipore-Sigma | H4034 | |
| ImageJ Fiji | National Institute of Health | raw image editing | |
| KaryoMAX Giemsa stain | Gibco | 2021-10-30 | |
| Leibovitz's L-15 medium | Gibco | 41300039 | |
| lipoprotein concentrate | MP Biomedicals | 191476 | |
| Nikon Diaphot | Nikon | epifluorescence microscope | |
| NucBlue Live ReadyProbes Reagent | Thermo Fisher Scientific | R37605 | |
| Olympus Disc Scanning Unit (DSU) confocal microscope | Olympus | ||
| Petroff-Hausser Counting Chamber | Hausser Scientific | Chamber 3900 | |
| sodium bicarbonate | Millipore-Sigma | S5761 | |
| Vortex | Fisher Vortex Genie 2 | 12-812 |
Riferimenti
- Gillespie, J. J., et al. Plasmids and rickettsial evolution: Insight from Rickettsia felis. PLoS One. 2 (3), 266 (2007).
- Murray, G. G., Weinert, L. A., Rhule, E. L., Welch, J. J. The phylogeny of Rickettsia using different evolutionary signatures: How tree-like is bacterial evolution. Systematic Biology. 65 (2), 265-279 (2016).
- Parola, P., Paddock, C. D., Raoult, D. Tick-borne rickettsioses around the world: Emerging diseases challenging old concepts. Clinical Microbiology Reviews. 18 (4), 719-756 (2005).
- Fang, R., Blanton, L. S., Walker, D. H. Rickettsiae as emerging infectious agents. Clinics in Laboratory Medicine. 37 (2), 383-400 (2017).
- Von Wintersdorff, C. J., et al. Dissemination of antimicrobial resistance in microbial ecosystems through horizontal gene transfer. Frontiers in Microbiology. 7, 173 (2016).
- Winkler, H. H. Rickettsia species (as organisms). Annual Review of Microbiology. 44 (1), 131-153 (1990).
- Wood, D. O., Azad, A. F. Genetic manipulation of rickettsiae: A preview. Infection and Immunity. 68 (11), 6091-6093 (2000).
- Perlman, S. J., Hunter, M. S., Zchori-Fein, E. The emerging diversity of Rickettsia. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1598), 2097-2106 (2006).
- McClure, E. E., et al. Engineering of obligate intracellular bacteria: Progress, challenges and paradigms. Nature Reviews Microbiology. 15 (9), 544-558 (2017).
- Rachek, L. I., Tucker, A. M., Winkler, H. H., Wood, D. O. Transformation of Rickettsia prowazekii to rifampin resistance. Journal of Bacteriology. 180 (8), 2118-2124 (1998).
- Troyer, J. M., Radulovic, S., Azad, A. F. Green fluorescent protein as a marker in Rickettsia typhi transformation. Infection and Immunity. 67 (7), 3308-3311 (1996).
- Kim, H. K., Premaratna, R., Missiakas, D. M., Schneewind, O. Rickettsia conorii O antigen is the target of bactericidal Weil-Felix antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (39), 19659-19664 (2019).
- Burkhardt, N. Y., et al. Development of shuttle vectors for transformation of diverse Rickettsia species. PLoS One. 6 (12), 29511 (2011).
- Welch, M. D., Reed, S. C., Lamason, R. L., Serio, A. W. Expression of an epitope-tagged virulence protein in Rickettsia parkeri using transposon insertion. PloS One. 7 (5), 37310 (2012).
- Oliver, J. D., Burkhardt, N. Y., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. Motility characteristics are altered for Rickettsia bellii transformed to overexpress a heterologous rickA gene. Applied and Environmental Microbiology. 80 (3), 1170-1176 (2014).
- Kurtti, T. J., Burkhardt, N. Y., Heu, C. C., Munderloh, U. G. Fluorescent protein expressing Rickettsia buchneri and Rickettsia peacockii for tracking symbiont-tick cell interactions. Veterinary Sciences. 3 (4), 34 (2016).
- Oliver, J. D., Chávez, A. S., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. An Ixodes scapularis cell line with a predominantly neuron-like phenotype. Experimental and Applied Acarology. 66 (3), 427-442 (2015).
- Grabowski, J. M., Gulia-Nuss, M., Kuhn, R. J., Hill, C. A. RNAi reveals proteins for metabolism and protein processing associated with Langat virus infection in Ixodes scapularis (black-legged tick) ISE6 cells. Parasites & Vectors. 10 (1), 1-4 (2017).
- Al-Rofaai, A., Bell-Sakyi, L. Tick cell Lines in research on tick control. Frontiers in Physiology. 11, 152 (2020).
- Wang, X. R., et al. Mitochondrion-dependent apoptosis is essential for Rickettsia parkeri infection and replication in vector cells. mSystems. 6 (2), 01209-01220 (2021).
- Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73 (10), 3283-3290 (2007).
- Riley, S. P., Macaluso, K. R., Martinez, J. J. Electrotransformation and clonal isolation of Rickettsia species. Current Protocols in Microbiology. 39, 1-20 (2015).
- Burkhardt, N. Y., et al. Examination of rickettsial host range for shuttle vectors based on dnaA and parA genes from the pRM plasmid of Rickettsia monacensis. Applied and Environmental Microbiology. 88 (7), 00210-00222 (2022).
- Kurtti, T. J., et al. Rickettsia buchneri sp. nov., a rickettsial endosymbiont of the blacklegged tick Ixodes scapularis. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 65, 965 (2015).
- Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Formulation of medium for tick cell culture. Experimental & Applied Acarology. 7 (3), 219-229 (1989).
- Bell-Sakyi, L. Continuous cell lines from the tick Hyalomma anatolicum anatolicum. The Journal of Parasitology. 77 (6), 1006-1008 (1991).
- Mattila, J. T., Burkhardt, N. Y., Hutcheson, H. J., Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Isolation of cell lines and a rickettsial endosymbiont from the soft tick Carios capensis (Acari: Argasidae: Ornithodorinae). Journal of Medical Entomology. 44 (6), 1091-1101 (2007).
- Bell-Sakyi, L., Růžek, D., Gould, E. A. Cell lines from the soft tick Ornithodoros moubata. Experimental and Applied Acarology. 49 (3), 209-219 (2009).
