हाइड्रोजेल में रहते हुए पूरे ऑर्गेनोइड्स और स्फेरॉइड की संवर्धन, ठंड, प्रसंस्करण और इमेजिंग
Summary
वर्तमान अध्ययन विभिन्न माइक्रोस्कोप के तहत पूरे स्फेरॉइड और ऑर्गेनोइड्स की खेती, ठंड, पिघलने, प्रसंस्करण, धुंधला, लेबलिंग और जांच करने के तरीकों का वर्णन करता है, जबकि वे एक बहुउद्देशीय उपकरण के भीतर एक हाइड्रोगेल में बरकरार रहते हैं।
Abstract
सेल कल्चर लैब्स में तीन-आयामी बढ़ती संरचनाएं ऑर्गेनोइड्स और स्फेरॉइड, दो-आयामी संस्कृति मॉडल की तुलना में बेहतर मॉडल के रूप में तेजी से मान्यता प्राप्त हो रही हैं, क्योंकि वे मानव शरीर की बेहतर नकल करते हैं और पशु अध्ययन पर फायदे हैं। हालांकि, इन अध्ययनों को आमतौर पर प्रजनन क्षमता और स्थिरता के साथ समस्याओं का सामना करना पड़ता है। लंबी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के दौरान – विभिन्न सेल कल्चर वाहिकाओं, पिपेटिंग और सेंट्रीफ्यूजिंग के बीच ऑर्गेनोइड और स्फेरॉइड के हस्तांतरण के साथ – ये अतिसंवेदनशील और नाजुक 3 डी बढ़ती संरचनाएं अक्सर क्षतिग्रस्त या खो जाती हैं। अंततः, परिणाम काफी प्रभावित होते हैं, क्योंकि 3 डी संरचनाएं समान विशेषताओं और गुणवत्ता को बनाए नहीं रख सकती हैं। यहां वर्णित विधियां इन तनावपूर्ण चरणों को कम करती हैं और प्रसंस्करण अनुक्रम में ऑर्गेनोइड और स्फेरॉइड के लिए एक सुरक्षित और सुसंगत वातावरण सुनिश्चित करती हैं, जबकि वे अभी भी एक बहुउद्देशीय उपकरण में हाइड्रोगेल में हैं। शोधकर्ता एकल बहुउद्देशीय उपकरण का उपयोग करके कॉन्फोकल से इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप तक विभिन्न उच्च तकनीक उपकरणों के तहत ऑर्गेनोइड्स या स्फेरॉइड की संरचना की जांच कर सकते हैं, फ्रीज कर सकते हैं, पिघला सकते हैं, प्रक्रिया कर सकते हैं, दाग, लेबल कर सकते हैं। यह तकनीक प्रसंस्करण के दौरान 3 डी बढ़ती संरचनाओं के लिए एक स्थिर और सुरक्षात्मक वातावरण बनाए रखते हुए अध्ययन की प्रजनन क्षमता, विश्वसनीयता और वैधता में सुधार करती है। इसके अलावा, तनावपूर्ण कदमों को खत्म करने से हैंडलिंग त्रुटियों को कम किया जाता है, समय कम हो जाता है, और संदूषण का खतरा कम हो जाता है।
Introduction
सेल अनुसंधान और चिकित्सा का भविष्य 3 डी सेल संस्कृतियों 1,2,3 के भीतर निहित है। ऑर्गनॉइड और स्फेरॉइड मॉडल बेहतर मॉडल बनाकर इन विट्रो प्रयोगों और पशु मॉडल के बीच की खाई को बंद करते हैं जो मानव शरीर के विकास, शरीर विज्ञान और बीमारियों 4,5,6,7,8,9 की नकल करते हैं। हालांकि, इन मॉडलों की प्रजनन क्षमता और पुनरावृत्ति चुनौतीपूर्ण बनी हुई है। इसके अलावा, वर्तमान प्रौद्योगिकियों के साथ इन संरचनाओं को संभालने, कटाई, स्थानांतरित करने और सेंट्रीफ्यूज करने से कई स्थितियों में ऑर्गेनोइड्स और स्फेरॉइड का नुकसान या क्षति होती है, जिससे परिणामों पर काफी प्रभाव पड़ता है।
हिस्टोलॉजिकल स्टेनिंग, इम्यूनोहिस्टोकेमिकल स्टेनिंग, इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग और क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए कई प्रोटोकॉल के बावजूद, प्रयोगात्मक स्थितियों को मानकीकृत करने, इन नाजुक संरचनाओं को खोने या नुकसान पहुंचाए बिना उन्हें संभालने और संसाधित करने से संबंधित कोई सार्वभौमिक दृष्टिकोण नहीं है। वर्तमान प्रोटोकॉल भी अविश्वसनीय रूप से लंबे हैं, कुछ दिनों से कई हफ्तों तक बारी-बारी से, और इसमें विभिन्न अभिकर्मकों 10,11,12,13,14 के साथ जटिल प्रक्रियाएं शामिल हैं। इसके अतिरिक्त, सेल कल्चर वाहिकाओं और क्रायोवियल्स के बीच 3 डी बढ़ती संरचनाओं की कटाई, पिपेटिंग, सेंट्रीफ्यूजिंग और स्थानांतरित करने से संरचनाओं और यांत्रिक बलों की स्थिति में परिवर्तन होता है, और अंततः ऑर्गेनोइड्स और स्फेरॉइड के भेदभाव और परिपक्वता को प्रभावित करता है। यह बताया गया है कि ऊतक टोपोलॉजी, कोशिकाओं की स्थिति, और यांत्रिक बल सेल भेदभाव और परिपक्वता 6,15,16,17 को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित करते हैं।
इसलिए, स्थिर गुणवत्ता के साथ ऑर्गेनोइड और स्फेरॉइड उत्पन्न करने के लिए वर्तमान पारंपरिक प्रौद्योगिकियों में सुधार करना वांछनीय है। एक विधि / डिवाइस जो सेंट्रीफ्यूजेशन और ऊपर वर्णित अन्य चरणों को छोड़ देगा और कई प्रक्रियाओं की शुरुआत से अंत तक एक सुरक्षित वातावरण में सामग्री प्रदान करेगा, सबसे सुसंगत और विश्वसनीय डेटा तक पहुंचने के लिए फायदेमंद होगा। इसके अतिरिक्त, यह समय, श्रम और लागत की बाधाओं को कम करेगा।
यहां वर्णित बहुउद्देशीय उपकरण (एमडी) ऑर्गेनोइड और स्फेरॉइड (पूरक चित्रा 1) की कई प्रक्रियाओं के लिए एक सुरक्षित वातावरण प्रदान करता है। यह उपकरण और पूरक प्रोटोकॉल कटाई, पाइपिंग, ट्रांसफरिंग और सेंट्रीफ्यूजिंग चरणों को समाप्त करते हैं। अनुक्रमिक प्रक्रियाओं के दौरान ऑर्गेनोइड और स्फेरॉइड अपने इन विट्रो वातावरण में रहते हैं। इस वातावरण में मुख्य रूप से प्राकृतिक या सिंथेटिक बाह्य मैट्रिक्स घटक शामिल हैं, जैसे व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हाइड्रोगेल। दूसरे शब्दों में, यहां वर्णित विधियां ऑर्गेनोइड / स्फेरॉइड के पूरे माउंट नमूने को हाइड्रोगेल ड्रॉप में अभी भी संसाधित, जांच और जमे हुए होने की अनुमति देती हैं।
बायोकंपैटिबल डिवाइस 60 डिग्री सेल्सियस और -160 डिग्री सेल्सियस के बीच के तापमान के लिए प्रतिरोधी है, जो -160 डिग्री सेल्सियस पर तरल नाइट्रोजन टैंक में ऑर्गेनोइड्स / स्टेरॉयड को बहाल करना या 60 डिग्री सेल्सियस पर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए राल ब्लॉक तैयार करना संभव बनाता है। डिवाइस में आला को 3 डी बढ़ती संरचनाओं के लिए एक सीमित स्थान को परिभाषित करने और पिछले अध्ययनों 18,19,20,21,22,23 के आधार पर स्फेरॉइड या ऑर्गेनोइड के गठन को प्रोत्साहित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। डिवाइस का वह हिस्सा पारदर्शी है और इसमें एक विशिष्ट प्लास्टिक है जो उच्च ऑप्टिकल गुणवत्ता प्रदान करता है (अपवर्तक सूचकांक: 1.43; abbe मान: 58; मोटाई: 7.8 mil [0.0078 in या 198 μm])। आला और आसपास के ‘साइड’ भाग दोनों ऑटोफ्लोरेसेंस का कारण बनते हैं। केंद्र में पारदर्शी आला में 80 मिमी2 क्षेत्र है, जबकि साइड भाग 600 मिमी2 है। कंटेनर की गहराई 15 मिमी है, और मोटाई 1.5 मिमी है। ये विशेषताएं, डिवाइस के आकार और डिजाइन के अलावा, विभिन्न प्रकार के उच्च तकनीक माइक्रोस्कोप के तहत अवलोकन करना और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपिक परीक्षाओं के लिए नमूने तैयार करना संभव बनाती हैं (चित्रा 2)। डिवाइस की समापन प्रणाली दो स्थिति प्रदान करती है, एक फ्रीजर में सील की जाती है और दूसरी इनक्यूबेटर में गैस प्रवाह की अनुमति देती है। सीसीके 8 प्रसार और साइटोटॉक्सिसिटी परख पारंपरिक सेल संस्कृति व्यंजनों (पूरक चित्रा 2) की तुलना में कोशिकाओं पर समान प्रभाव प्रदर्शित करते हैं। ट्रिपैन ब्लू बहिष्करण परीक्षण एमडी (चित्रा 3) में सेल संस्कृति के दौरान उच्च सेल व्यवहार्यता (94%) प्रदर्शित करता है।
एकल उपकरण में एक नमूने के लिए की जा सकने वाली प्रक्रियाओं में (1) संवर्धन, (2) हिस्टोलॉजिकल धुंधलापन, (3) इम्यूनोस्टेनिंग, इम्यूनोहिस्टोकेमिकल और इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग सहित, (4) फ्रीजिंग, (5) पिघलना, (6) ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत जांच करना, जैसे ब्राइटफील्ड, डार्कफील्ड, फ्लोरेसेंस, कॉन्फोकल और सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोप, (7) स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के तहत कोटिंग और सीधे जांच करना, या (8) ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के लिए तैयारी करना शामिल है। चित्र 2)।
हिस्टोलॉजिकल स्टेनिंग, इम्यूनोहिस्टोकेमिकल लेबलिंग, या फ्लोरोसेंटली लेबलिंग ऑर्गेनोइड्स और स्फेरॉइड 10,11,12,13,14,24,25 के लिए अलग-अलग पद्धतियां मौजूद हैं। हाइड्रोगेल से उनकी कटाई वर्तमान तकनीक का पहला और प्रमुख कदम है। इस चरण के बाद, कुछ विधियां पूरे-माउंट इम्यूनो-लेबलिंग की अनुमति देती हैं। काटे गए ऑर्गेनोइड्स पैराफिन में एम्बेडेड होते हैं, वर्गीकृत होते हैं, और दूसरों में धुंधला और इम्यूनोस्टेनिंग के लिए लेबल किया जाता है। हालांकि, अनुभाग पूरे नमूने को प्रस्तुत नहीं कर सकते हैं और संरचना के 3 डी आर्किटेक्चर से संबंधित केवल सीमित डेटा प्रदान कर सकते हैं। इसके अलावा, इन 3 डी संरचनाओं को नुकसान और एंटीजेनिसिटी का नुकसान इन प्रौद्योगिकियों के प्रसिद्ध दुष्प्रभाव हैं।
इस लेख में सूक्ष्म परीक्षाओं के लिए पूरक नए प्रोटोकॉल अभी भी एक हाइड्रोगेल में पूरे माउंट नमूनों के विश्लेषण की अनुमति देते हैं। यहां वर्णित प्रोटोकॉल में दो नए विकसित फॉर्मूलेशन शामिल हैं: इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (एस-आईएचसी) के लिए समाधान और इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग (एस-आईएफ) के लिए समाधान। इन समाधानों के साथ विधियां शोधकर्ताओं को अधिक सटीक डेटा प्राप्त करने की अनुमति देती हैं, क्योंकि पारंपरिक वर्कफ़्लोज़ का कोई हानिकारक प्रभाव नहीं होता है, जैसे कि सेंट्रीफ्यूजिंग, पिपेटिंग और नाजुक संरचनाओं का स्थानांतरण। यहां वर्णित प्रोटोकॉल कटाई, अवरुद्ध, समाशोधन और एंटीजन पुनर्प्राप्ति चरणों की आवश्यकता को भी समाप्त करता है, और पूरी प्रक्रिया को 6-8 घंटे तक छोटा कर देता है। इसके अलावा, कार्यप्रणाली एक ही एस-आईएफ में एक से तीन एंटीबॉडी को एक साथ जोड़ने की अनुमति देती है। इसलिए, कई लेबलिंग प्रयोगों के बाद भी एक ही दिन परिणाम प्राप्त करना संभव है, जो यहां वर्णित प्रोटोकॉल का एक और लाभ है; पारंपरिक होल-माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग प्रोटोकॉल आमतौर पर 3 दिनों और कई हफ्तों 10,11,12,13,14 के बीच लेते हैं।
पैराफिन एम्बेडिंग, एक और हानिकारक कदम जो एंटीजेनेसिटी को कम करता है, को भी छोड़ दिया जाता है। सूक्ष्म परीक्षा की शुरुआत से अंत तक 3 डी संरचना अपने इन विट्रो वातावरण में रहती है। चूंकि 3 डी संरचना अपनी बढ़ती स्थितियों में बनी हुई है, इसलिए प्रोटीन अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण डेटा विवो स्थितियों में बेहतर नकल करते हैं। अधिक सटीक परिणामों की उम्मीद है, क्योंकि कार्यप्रणाली नमूने की एंटीजन अभिव्यक्ति को प्रभावित करने वाले चरणों को समाप्त करती है। तालिका 1 और तालिका 2 प्रदर्शित करती है कि ये नए प्रोटोकॉल चरणों को कैसे समाप्त करते हैं, प्रयोगशाला में समय और श्रम बचाते हैं, और पारंपरिक वर्कफ़्लो की तुलना में लागत और अपशिष्ट उत्पादों को कम करते हैं।
ऊपर वर्णित महत्वपूर्ण चरणों के अलावा, एक और समस्या उच्च सेल व्यवहार्यता दर 26,27,28,29,30,31 के साथ नमूने की 3 डी संरचना को संरक्षित करने के लिए क्रायोप्रिजर्वेशन माध्यम और विधि प्रदान कर रही है। क्रायोप्रिजर्वेशन एक स्थिर मॉडल सिस्टम बनाने और ऑर्गेनोइड्स और स्फेरॉइड32,33 के बायोबैंकिंग को सक्षम करने के लिए आवश्यक है। संपूर्ण मूल 3 डी संरचना को बायोबैंकिंग स्वास्थ्य या बीमारी की प्राकृतिक स्थिति के अधिक वफादार पुनर्मूल्यांकन की अनुमति देगा। मुख्य विचार क्रायोप्रिजर्वेशन की सुविधा और विश्वसनीयता और ऑर्गेनोइड / स्फेरॉइड का पिघलना है। अधिकांश वर्तमान प्रौद्योगिकियों में पोस्ट-पिघलना ऑर्गेनॉइड रिकवरी बहुत कम है, अक्सर 50% से कम। हालांकि, हाल के अध्ययनों ने26,27,28,29 की बेहतर जीवित रहने की दर के साथ आशाजनक परिणाम दिखाए हैं। ली एट अल ने प्रदर्शित किया कि 78% स्फेरॉइड कोशिकाएं क्रायोप्रिजर्वेशन के बाद बच गईं जब उन्होंने विस्कॉन्सिन विश्वविद्यालय के समाधान का उपयोग किया जिसमें 15% डीएमएसओ28 था। अराई एट अल.29 के अध्ययन में सेल उत्तरजीविता अनुपात बढ़कर 83% हो गया। हालांकि, क्रायोप्रिजर्वेशन के बाद के परिणाम काफी प्रभावित होते हैं क्योंकि 3 डी संरचनाएं समान विशेषताओं और गुणवत्ता को बनाए नहीं रख सकती हैं। इसके अलावा, दवा और नैदानिक सेटिंग्स में अच्छे विनिर्माण अभ्यास के लिए सीरम-मुक्त अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है। पारंपरिक वर्कफ़्लोज़ धीमी-ठंड विधि के लिए भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) युक्त माध्यम का उपयोग करते हैं, जो दोनों विकलांगता से जुड़े होते हैं। एफबीएस एक पशु-व्युत्पन्न उत्पाद है और इसमें बैच विविधताएं हो सकती हैं। डीएमएसओ एक बहुत ही सफल क्रायोप्रोटेक्टेंट है, लेकिन लंबे समय तक जोखिम, विशेष रूप से पिघलने के दौरान, साइटोटोक्सिक प्रभाव30,31 का कारण बन सकता है।
यह लेख हाइड्रोजेल में रहते हुए भी पूरे ऑर्गेनोइड या स्फेरॉइड की ठंड / पिघलने की पद्धति का वर्णन करता है। अध्ययन में ऑर्गेनोइड्स और स्फेरॉइड को फ्रीज करने के लिए दो सूत्रों का उपयोग किया जाता है: (1) पारंपरिक फ्रीजिंग समाधान (एफएस) युक्त 10% डीएमएसओ और (2) एक सीरम- और डीएमएसओ-मुक्त क्रायोप्रिजर्वेशन माध्यम। इस क्रायोप्रिजर्वेशन माध्यम में बाह्य मैट्रिक्स घटक होते हैं, जो वर्तमान सूत्रों से अलग होते हैं। बाह्य मैट्रिक्स में मैक्रोमोलेक्यूल्स, प्रोटिओग्लाइकेन्स और रेशेदार प्रोटीन के दो मुख्य वर्ग शामिल हैं, जो सेलुलर घटकों के लिए भौतिक मचान के लिए आवश्यक हैं, लेकिन ऊतक मोर्फोजेनेसिस, भेदभाव और होमियोस्टेसिस 34,35,36,37,38,39,40 के लिए आवश्यक प्रक्रियाओं को भी शुरू करते हैं। . कोलेजन तन्यता शक्ति प्रदान करते हैं, सेल आसंजन को विनियमित करते हैं, केमोटैक्सिस और प्रवासन का समर्थन करते हैं, और प्रत्यक्ष ऊतक विकास37. इसके अलावा, इलास्टिन फाइबर ऊतकों को पुनरावृत्ति प्रदान करते हैं जो बार-बार खिंचाव से गुजरतेहैं। एक तीसरा रेशेदार प्रोटीन, फाइब्रोनेक्टिन, अंतरालीय बाह्य मैट्रिक्स के संगठन को निर्देशित करता है और कोशिका लगाव की मध्यस्थता में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और एक बाह्य मेकेनो-नियामक39 के रूप में कार्य करता है। डु एट अल ने प्राकृतिक एक्टोमायोसिन मॉडल सिस्टम41 पर चिकन कोलेजन हाइड्रोलाइसेट के क्रायोप्रोटेक्टिव प्रभाव का प्रदर्शन किया है। उनके परिणाम बताते हैं कि कोलेजन हाइड्रोलाइसेट बर्फ क्रिस्टल के विकास को रोक सकता है, वाणिज्यिक क्रायोप्रोटेक्टेंट्स के समान प्रोटीन फ्रीज-विकृतीकरण और ऑक्सीकरण को कम कर सकता है, और फ्रीज-पिघलना चक्र के बाद बेहतर जेल संरचना प्रदान कर सकता है। इसलिए, क्रायोप्रिजर्वेशन मीडिया में बाह्य मैट्रिक्स घटकों को जोड़ना नमूने के लिए अधिक सुरक्षित और सुरक्षात्मक वातावरण प्रदान करता है और ठंड-पिघलने के बाद जीवित संरचनाओं को ठीक करने का समर्थन करता है।
इसके अतिरिक्त, वर्तमान अध्ययन साइटोप्लाज्मिक झिल्ली और जीवित ऑर्गेनोइड और स्फेरॉइड के नाभिक को लेबल करने के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, जबकि वे अभी भी हाइड्रोगेल में हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
एमडी, यहां वर्णित योगों और प्रोटोकॉल का पूरक है, अधिक नियंत्रित वातावरण में ऑर्गेनोइड और स्फेरॉइड के तेजी से और सहज 3 डी विकास की सुविधा प्रदान करता है और उसी स्थिति में प्रयोग जारी रखता है। नमूना पूरी प?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम आरेख तैयार करने के लिए शिकागो विश्वविद्यालय से डेल मर्टेस के आभारी हैं, इस्तांबुल मेडिपोल यूनिवर्सिटी रिसर्च इंस्टीट्यूट फॉर हेल्थ साइंसेज एंड टेक्नोलॉजीज में तकनीकी सहायता के लिए डॉ मेहमत सेरिफ आयदीन के लिए और पांडुलिपि के संपादन के लिए माल्टेप विश्वविद्यालय के डॉ राणा काज़ेमी के आभारी हैं।
Materials
| Absolute Ethanol (EtOH) | Merck | 8187602500 | Dilute in dH2O to make 30%, 50%, 70%, 80%, 90% and 96% solution and store at RT |
| Acetone | Merck | 8222512500 | Store at RT |
| Alexa fluor wheat germ agglutinin and Hoechst in Hank's balanced salt solution (HBSS) | Invitrogen | I34406 | Image-IT LIVE Plasma Membrane and Nuclear Labeling Kit, Store at -20 °C |
| Alpha-1-Fetoprotein (AFP) Concentrated and Prediluted Polyclonal Antibody | Biocare Medical | CP 028 A | Store at +4 °C |
| Anti-albumin antibody | Abcam | EPR20195 | Store at +4 °C, Dilution: 1:50 |
| Anti-beta galactosidase antibody, Chicken polyclonal | Abcam | 134435 | Store at +4 °C, Dilution: 1:25 |
| Anti-cytokeratin 5 | Abcam | 53121 | Store at +4 °C, Dilution: 1:100 |
| Arginase-1 Concentrated and Prediluted Rabbit Monoclonal Antibody | Biocare Medical | ACI 3058 A, B | Store at +4 °C, Dilution: 1:50 |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C1016-500G | Dissolve in Karnovsky's fixative to make 2 mM CaCl2; store at RT |
| Cell Counting Kit 8 (WST-8 / CCK8) | Abcam | ab228554 | |
| Centrifuge tubes, 15 mL | Nest | 601051 | |
| Centrifuge tubes, 50 mL | Nest | 602052 | |
| Class II Microbiological Safety Cabinet Bio II Advance Plus | Telstar | EN12469 | |
| CO2 Incubator | Panasonic | KM-CC17RU2 | |
| Copper Grids | Electron Microscopy Sciences | G100-Cu | Ultra-thin sections put on the grids; 100 lines/inch square mesh |
| Critical Point Dryer | Leica | EM CPD300 | For drying biological samples for SEM applications in absolute acetone |
| DAB/AEC chromogen solution mixture | Sigma Aldrich | AEC101 | Store at +4 °C |
| Diamond knife | Diatome | Ultra 45°, 40-US | Use for ultra-thin sections for TEM |
| Dimethyl sulfoxide for molecular biology | Biofroxx | 67-68-5 | |
| Disposable Plastic Pasteur Pippettes | Nest | ||
| DMEM – Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 41966-029 | Store at +4 °C |
| Eosin Y Solution Alcoholic | Bright Slide | 2.BS01-105-1000 | |
| Epon resin | Sigma | 45359-1EA-F | Epoxy Embedding Medium kit, Store at +4 °C |
| Fetal Bovine Serum with Additive Fortifier | Pan Biotech | P30-3304 | Store at +4 °C |
| Freezing Solution (FS) | Cellorama | CellO-F | Store at +4 °C |
| Glass knife maker | Leica | EM KMR3 | For make glass knives in 8 mm thickness |
| Glass knife strips (Size 8 mm x 25.4 mm x 400 mm) | Leica | 7890-08 | Use for ultra- or semi-thin sections for TEM |
| Glutaraldehyde Aqueous Solution, EM grade, 25% | Electron Microscopy Sciences | 16210 | Dilute in dH2O to make 2.5% solution and store at +4 °C |
| Glycerol solution | Sigma Aldrich | 56-81-5 | Store at -20 C, Dilution :1:100 |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) Secondary Antibody,Alexa, 647 | Invitrogen | A32933 | Store at RT |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488 | Invitrogen | 35502 | Store at +4 °C, Dilution :1:50 |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550 | Invitrogen | 84540 | Store at +4 °C, Dilution :1:50 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488 | Invitrogen | 35552 | Store at +4 °C, Dilution :1:50 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550 | Invitrogen | 84541 | Store at +4 °C |
| Hematoxylin Harris | Bright Slide | 2.BS01-104-1000 | |
| HepG2 cells | ATCC | HB-8065 | Store in nitrogen tank |
| Human/Rat OV-6 Antibody Monoclonal Mouse IgG1 Clone # OV-6 | R&D Systems | MAB2020 | Store at -20 °C |
| Hydrogel | Corning | 354248 | Matrigel, Basement Membrane Matrix High Concentration (HC), LDEV-free, 10 mL, Store at -20 °C |
| Hydrogel | Corning | 354234 | Matrigel, Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL, Store at -20 °C |
| Hydrogel | ThermoFischer Scientific | A1413201 | Geltrex, LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix |
| Hydrogel | Biotechne, R&D Systems | BME001-01 | Cultrex Ultramatrix RGF BME, Store at -20 °C |
| Karnovsky's fixative | %2 PFA, %2.5 Glutaraldehyde in 0.15 M Cacodylate Buffer, 2 mM CaCl2; prepare fresh; use for TEM & SEM samples | ||
| L-Aspartic acid | Sigma | 11189-100G | Store at RT |
| Lead aspartate solution | Dissolve 40 mg aspartic acid in 10 mL ddH2O and add 66 mg lead nitrate. Solution stabilize at 60 °C and adjust pH to 5; prepare fresh | ||
| Lead nitrate | Electron Microscopy Sciences | 17900 | Store at RT |
| Leica Confocal Microscope | Leica | DMi8 | |
| LSM 700 Laser Scanning Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Microplate reader | Biotek Synergy | ||
| Multipurpose Device (MD) | Cellorama | CellO-M | |
| Nuclear-DNA stain | Invitrogen | H3569 | Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) – 10 mg/mL Solution in Water, Store at +4 °C |
| Nuclear-DNA stain | ThermoFischer Scientific | 62248 | DAPI solution, Store at +4 °C |
| Osmium Tetroxide (OsO4) ,4% | Electron Microscopy Sciences | 19190 | Dilute in dH2O to make 2% solution; store at +4 °C and in airtight container; protect light |
| Ov6 antibody | R&D systems | MAB2020 | Store at +4 °C |
| Paraformaldehyde (PFA) solution, 4% | Sigma | 1.04005.1000 | Dissolve 4% PFA in dH2O and boil, cool and aliquot; store at -20 °C |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS, 1 L | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Store at +4 °C |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), tablets | MP Biomedicals, LLC | 2810305 | |
| Post-fixative solution | %2 OsO4, %2.5 Potassium Ferrocyanide in dH2O; prepare fresh | ||
| Potassium Ferrocyanide aqueous solution, 5% | Electron Microscopy Sciences | 26603-01 | Store at RT |
| Primovert – Inverted Bright Field Microscope – ZEISS | Zeiss | Item no.: 491206-0001-000 | |
| Round bottom microcentrifuge tubes, 2 mL | Nest | 620611 | |
| Scanning Electron Microscopy with STEM attachment | Zeiss | GeminiSEM 500 | We use Inlens Secondary Electron (SE) detector at 2-3 kV for scanning electron micrographs and aSTEM detector at 30 kV for transmission electron micrographs. |
| SensiTek HRP Anti-Polyvalent Lab Pack | ScyTek Laboratories | SHP125 | Store at +4 °C |
| Sodium Cacodylate Buffer, 0.4 M, pH 7.2 | Electron Microscopy Sciences | 11655 | Dilute in dH2O to make 0.2 M and store at +4 °C |
| Sodium/Potassium ATPase alpha 1 antibody [M7-PB-E9] | GeneTex | GTX22871 | Store at -20 °C |
| Solution for Immunofluorescence Labeling (S-IF) | Cellorama | CellO-IF | Store at +4 °C |
| Solution for Immunohistochemistry (S-IHC) | Cellorama | CellO-P | Store at +4 °C |
| Specimen trimming device | Leica | EM TRIM2 | For prepare epon sample block to ultramicrotome |
| Sputter coater | Leica | EM ACE200 | Coat the SEM samples with 6 nm gold/palladium for 90 s |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | Sigma | 223220-5G | Dilute in dH2O to make 0.5% solution and filter with 0.22 µm membrane filter; store at RT; prepare fresh |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Ultra gel super glue | Pattex | PSG2C | For glue polymerized epon block with sample to holder epon block |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | For prepare high-quality ultra- or semi-thin sections for transmission electron microscopy (TEM) |
| Universal Pipette Tips, 10 µL | Nest | 171215-1101 | |
| Universal Pipette Tips, 1000 µL | Isolab | L-002 | |
| Universal Pipette Tips, 200 µL | Nest | 110919HA01 | |
| Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | Dilute in dH2O to make 2% solution and filter with 0.22 µm membrane filter; keep tightly closed container store at RT |
Riferimenti
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
- Bartfeld, S., Clevers, H. Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment. Journal of Molecular Medicine. 95 (7), 729-738 (2017).
- Marsee, A., et al. Building consensus on definition and nomenclature of hepatic, pancreatic, and biliary organoids. Cell Stem Cell. 28 (5), 816-832 (2021).
- Hautefort, I., Poletti, M., Papp, D., Korcsmaros, T. Everything you always wanted to know about organoid-based models (and never dared to ask). Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 14 (2), 311-331 (2022).
- Kakni, P., Truckenmüller, R., Habibović, P., Giselbrecht, S. Challenges to, and prospects for, reverse engineering the gastrointestinal tract using organoids. Trends in Biotechnology. 40 (8), 932-944 (2022).
- Eglen, R. M., Reisine, T. Human iPS cell-derived patient tissues and 3D cell culture part 2: spheroids, organoids, and disease modeling. SLAS Technology: Translating Life Sciences Innovation. 24 (1), 18-27 (2019).
- Chatzinikolaidou, M. Cell spheroids: the new frontiers in in vitro models for cancer drug validation. Drug Discovery Today: Technologies. 21 (9), 1553-1560 (2016).
- Rios, A. C., Clevers, H. Imaging organoids: a bright future ahead. Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared Organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- Renner, H., Otto, M., Grabos, M., Schöler, H. R., Bruder, J. M. Fluorescence-based single-cell analysis of whole-mount-stained and cleared microtissues and organoids for high throughput screening. Bio-protocol. 11 (12), (2021).
- Edwards, S. J., et al. High-resolution imaging of tumor spheroids and organoids enabled by expansion microscopy. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 208 (2020).
- Bergdorf, K. N., et al. Immunofluorescent staining of cancer spheroids and fine-needle aspiration-derived organoids. STAR Protocols. 2 (2), 100578 (2021).
- Foty, R. A., Pfleger, C. M., Forgacs, G., Steinberg, M. S. Surface tensions of embryonic tissues predict their mutual envelopment behavior. Development. 122 (5), 1611-1620 (1996).
- Jia, D., Dajusta, D., Foty, R. A. Tissue surface tensions guide in vitro self-assembly of rodent pancreatic islet cells. Developmental Dynamics. 236 (8), 2039-2049 (2007).
- Foty, R. A., Steinberg, M. S. The differential adhesion hypothesis: a direct evaluation. Biologia dello sviluppo. 278 (1), 255-263 (2005).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
- Sant, S., Johnston, P. A. The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery. Drug Discovery Today: Technologies. 23, 27-36 (2017).
- Marrero, B., Messina, J. L., Heller, R. Generation of a tumor spheroid in a microgravity environment as a 3D model of melanoma. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 45 (9), 523-534 (2009).
- Napolitano, A. P., et al. Scaffold-free three-dimensional cell culture utilizing micromolded nonadhesive hydrogels. Biotechniques. 43 (4), 494-500 (2007).
- Ferreira, L. P., Gaspar, V. M., Mano, J. F. Design of spherically structured 3D in vitro tumor models-Advances and prospects. Acta Biomaterialia. 75, 11-34 (2018).
- Kim, S., et al. Spatially arranged encapsulation of stem cell spheroids within hydrogels for the regulation of spheroid fusion and cell migration. Acta Biomaterialia. 142, 60-72 (2022).
- Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Current Opinion in Cell Biology. 5 (5), 633-640 (2002).
- Sargenti, A., et al. A new method for the study of biophysical and morphological parameters in 3D cell cultures: Evaluation in LoVo spheroids treated with crizotinib. PLoS One. 16 (6), 0252907 (2021).
- Jeong, Y., et al. Vitrification for cryopreservation of 2D and 3D stem cells culture using high concentration of cryoprotective agents. BMC Biotechnology. 20 (1), 45-54 (2020).
- Lee, J. H., Jung, D. H., Lee, D. H., Park, J. K., Lee, S. K. Effect of spheroid aggregation on susceptibility of primary pig hepatocytes to cryopreservation. Transplantation Proceedings. 44 (4), 1015-1017 (2012).
- Lee, B. E., et al. A simple and efficient cryopreservation method for mouse small intestinal and colon organoids for regenerative medicine. Biochemical and Biophysical Research Communications. 595, 14-21 (2022).
- Arai, K., Murata, D., Takao, S., Verissiomo, A. R., Nakayama, K. Cryopreservation method for spheroids andfabrication of scaffold-free tubular constructs. PLoS One. 15 (4), (2020).
- Awan, M., et al. Dimethyl sulfoxide: a central player since the dawn of cryobiology, is efficacy balanced by toxicity. Regenerative Medicine. 15 (3), 1463-1491 (2020).
- Erol, O. D., Pervin, B., Seker, M. E., Aertes-Kaya, F. Effects of storage media, supplements and cryopreservation methods on quality of stem cells. World Journal of Stem Cells. 13 (9), 1197-1214 (2021).
- De Angelis, M. L., et al. Colorectal cancer spheroid biobanks: multi-level approaches to drug sensitivity studies. Cell Biology and Toxicology. 34 (6), 459-469 (2018).
- Botti, G., Di Bonito, M., Cantile, M. Organoid biobanks as a new tool for pre-clinical validation of candidate drug efficacy and safety. International Journal of Physiology Pathophysiology and Pharmacology. 13 (1), 17-21 (2021).
- Jarvelainen, H., Sainio, A., Koulu, M., Wight, T. N., Penttinen, R. Extracellular matrix molecules: potential targets in pharmacotherapy. Pharmacological Reviews. 61 (2), 198-223 (2009).
- Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of extracellular matrix, scaffolds, and signaling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22, 287-309 (2006).
- Schaefer, L., Schaefer, R. M. Proteoglycans: from structural compounds to signaling molecules. Cell and Tissue Research. 339 (1), 237-246 (2010).
- Rozario, T., DeSimone, D. W. The extracellular matrix in development and morphogenesis: a dynamic view. Biologia dello sviluppo. 341 (1), 126-140 (2010).
- Wise, S. G., Weiss, A. S. Tropoelastin. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (3), 494-497 (2009).
- Smith, M. L., et al. Force-induced unfolding of fibronectin in the extracellular matrix of living cells. PLoS Biol. 5 (10), (2007).
- Carvallo, M. P., Costa, E. C., Miguel, S. P., Correia, I. J. Tumor spheroid assembly on hyaluronic acid-based structures: A review. Carbohydrate Polymers. 150, 139-148 (2016).
- Du, L., Betti, M. Chicken collagen hydrolysate cryoprotection of natural actomyosin: Mechanism studies during freeze-thaw cycles and simulated digestion. Food Chemistry. 211, 791-802 (2016).
- Wang, X., et al. The significance of arginase-1 expression in the diagnosis of liver cancer: A protocol for a systematic review. Medicina. 99 (9), 19159 (2020).
- Radwan, N. A., Ahmed, N. S. The diagnostic value of arginase-1 immunostaining in differentiating hepatocellular carcinoma from metastatic carcinoma and cholangiocarcinoma as compared to HepPar-1. Diagnostic Pathology. 7, 149 (2012).
- Chen, A., Guo, Z., Fang, L., Blan, S. Application of fused organoid models to study human brain development and neural disorders. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 133 (2020).
- Xiang, Y., et al. Fusion of regionally specified hPSC-derived organoids models human brain development and interneuron migration. Cell Stem Cell. 21 (3), 383-398 (2017).
- Kosheleva, N. V., et al. Cell spheroid fusion: beyond liquid drops model. Scientific Reports. 10 (1), 12614 (2020).
- Arai, K., Murata, D., Takao, S., Verissiomo, A. R., Nakayama, K. Cryopreservation method for spheroids and fabrication of scaffold-free tubular constructs. PloS One. 15 (4), 0243248 (2020).
