Cultura, congelamento, processamento e imagem de organoides e esferoides inteiros ainda em um hidrogel
Summary
O presente estudo descreve metodologias para cultivo, congelamento, descongelamento, processamento, coloração, marcação e exame de esferoides e organoides inteiros sob vários microscópios, enquanto permanecem intactos em um hidrogel dentro de um dispositivo multiuso.
Abstract
Organoides e esferoides, estruturas de crescimento tridimensionais em laboratórios de cultura de células, estão se tornando cada vez mais reconhecidos como modelos superiores em comparação com modelos de cultura bidimensionais, uma vez que imitam melhor o corpo humano e têm vantagens sobre os estudos em animais. No entanto, esses estudos comumente enfrentam problemas com reprodutibilidade e consistência. Durante os longos processos experimentais – com transferências de organoides e esferoides entre diferentes vasos de cultura celular, pipetagem e centrifugação – essas estruturas de crescimento 3D suscetíveis e frágeis são frequentemente danificadas ou perdidas. Em última análise, os resultados são significativamente afetados, uma vez que as estruturas 3D não podem manter as mesmas características e qualidade. Os métodos descritos aqui minimizam essas etapas estressantes e garantem um ambiente seguro e consistente para organoides e esferoides durante toda a sequência de processamento, enquanto eles ainda estão em um hidrogel em um dispositivo multiuso. Os pesquisadores podem crescer, congelar, descongelar, processar, manchar, rotular e, em seguida, examinar a estrutura de organoides ou esferoides sob vários instrumentos de alta tecnologia, de microscópios confocais a eletrônicos, usando um único dispositivo multiuso. Essa tecnologia melhora a reprodutibilidade, a confiabilidade e a validade dos estudos, mantendo um ambiente estável e protetor para as estruturas de crescimento 3D durante o processamento. Além disso, a eliminação de etapas estressantes minimiza os erros de manuseio, reduz o tempo gasto e diminui o risco de contaminação.
Introduction
O futuro da pesquisa e terapia celular está nas culturas de células 3D 1,2,3. Os modelos organoides e esferoides fecham a lacuna entre os experimentos in vitro e os modelos animais, criando melhores modelos que imitam o desenvolvimento, a fisiologia e as doenças do corpo humano 4,5,6,7,8,9. No entanto, a reprodutibilidade e repetibilidade desses modelos permanecem desafiadoras. Além disso, o manuseio, a colheita, a transferência e a centrifugação dessas estruturas com as tecnologias atuais resultam em perda ou dano dos organoides e esferoides em muitas condições, afetando significativamente os resultados.
Apesar de muitos protocolos de coloração histológica, coloração imuno-histoquímica, marcação por imunofluorescência e criopreservação, não existe uma abordagem universal relacionada à padronização de condições experimentais, manuseio e processamento dessas estruturas delicadas sem perdê-las ou danificá-las. Os protocolos atuais também são incrivelmente longos, alternando de alguns dias a várias semanas, e incluem procedimentos complexos com vários reagentes 10,11,12,13,14. Além disso, a colheita, pipetagem, centrifugação e transferência de estruturas de crescimento 3D entre vasos de cultura celular e criovianos causam mudanças no posicionamento das estruturas e forças mecânicas e, finalmente, afetam a diferenciação e maturação dos organoides e esferoides. Tem sido relatado que a topologia tecidual, o posicionamento das células e as forças mecânicas impactam significativamente a diferenciação e maturação celular 6,15,16,17.
Portanto, é desejável melhorar as tecnologias convencionais atuais para gerar organoides e esferoides com qualidade estável. Um método/dispositivo que pule a centrifugação e outras etapas descritas acima e forneça o material em um único ambiente seguro do início ao fim dos múltiplos processos seria benéfico para alcançar os dados mais consistentes e confiáveis. Além disso, isso reduzirá as restrições de tempo, mão de obra e custo.
O dispositivo multiuso (MD) descrito aqui fornece um único ambiente seguro para múltiplos processos de organoides e esferoides (Figura 1 Suplementar). Este dispositivo e protocolos complementares eliminam as etapas de colheita, pipetagem, transferência e centrifugação. Os organoides e esferoides permanecem em seu ambiente in vitro durante os processos sequenciais. Este ambiente compreende principalmente componentes de matriz extracelular naturais ou sintéticas, como hidrogéis comercialmente disponíveis. Em outras palavras, os métodos descritos aqui permitem que uma amostra inteira de organoides / esferoides seja processada, examinada e congelada enquanto ainda está em uma gota de hidrogel.
O dispositivo biocompatível é resistente a temperaturas entre 60 °C e -160 °C, o que torna viável restaurar os organoides/esteroides em um tanque de nitrogênio líquido a -160 °C ou preparar blocos de resina para microscopia eletrônica a 60 °C. O nicho no dispositivo foi projetado para definir um espaço limitado para estruturas de crescimento 3D e estimular a formação de esferoides ou organoides com base nos estudos anteriores 18,19,20,21,22,23. Essa parte do dispositivo é transparente e contém um plástico específico que fornece alta qualidade óptica (índice de refração: 1,43; valor de abbe: 58; espessura: 7,8 mil [0,0078 in ou 198 μm]). Tanto o nicho quanto a parte “lateral” circundante causam autofluorescência. O nicho transparente no centro tem uma área de 80 mm 2, enquanto a parte lateral é de 600 mm2. A profundidade do recipiente é de 15 mm e a espessura é de 1,5 mm. Essas características, além do tamanho e do design do dispositivo, possibilitam a realização de observações sob diferentes tipos de microscópio de alta tecnologia e o preparo das amostras para exames microscópicos eletrônicos (Figura 2). O sistema de fechamento do dispositivo fornece duas posições, uma selada no freezer e outra permitindo o fluxo de gás na incubadora. Os ensaios de proliferação e citotoxicidade da CCK8 demonstram efeitos semelhantes nas células em comparação com os pratos tradicionais de cultura celular (Figura 2 Suplementar). O teste de exclusão do azul de tripano demonstra alta viabilidade celular (94%) durante a cultura celular no DM (Figura 3).
Os processos que podem ser realizados para uma amostra no único dispositivo compreendem (1) cultura, (2) coloração histológica, (3) imunocoloração, incluindo marcação imuno-histoquímica e de imunofluorescência, (4) congelamento, (5) descongelamento, (6) exame sob microscópios ópticos, como microscópios ópticos, como microscópios de campo claro, campo escuro, fluorescência, confocal e super-resolução, (7) revestimento e exame diretamente sob um microscópio eletrônico de varredura, ou (8) preparação para microscopia eletrônica de transmissão ( Figura 2).
Existem diferentes metodologias para coloração histológica, marcação imuno-histoquímica ou marcação fluorescente de organoides e esferoides 10,11,12,13,14,24,25. Colhê-los do hidrogel é o primeiro e principal passo da tecnologia atual. Após esta etapa, alguns métodos permitem a imunomarcação de montagem completa. Os organoides colhidos são incorporados em parafina, seccionados e rotulados para coloração e imunocoloração em outros. No entanto, as seções podem não apresentar toda a amostra e fornecer apenas dados limitados relacionados à arquitetura 3D da estrutura. Além disso, danos a essas estruturas 3D e perda de antigenicidade são efeitos colaterais bem conhecidos dessas tecnologias.
Os novos protocolos complementares para exames microscópicos neste artigo permitem uma análise de amostras inteiras ainda em hidrogel. Os protocolos aqui descritos incluem duas formulações recém-desenvolvidas: solução para imuno-histoquímica (S-IHC) e solução para marcação por imunofluorescência (S-IF). Os métodos com essas soluções permitem que os pesquisadores obtenham dados mais precisos, uma vez que não há efeitos nocivos dos fluxos de trabalho tradicionais, como centrifugação, pipetagem e transferência das estruturas delicadas. O protocolo descrito aqui também elimina a necessidade de etapas de colheita, bloqueio, limpeza e recuperação de antígenos, e encurta todo o procedimento para 6-8 h. Além disso, a metodologia permite adicionar simultaneamente de um a três anticorpos ao mesmo S-IF. Portanto, é possível obter os resultados no mesmo dia mesmo após os múltiplos experimentos de rotulagem, o que é outra vantagem do protocolo descrito aqui; Os protocolos tradicionais de marcação por imunofluorescência de montagem completa geralmente levam entre 3 dias e várias semanas 10,11,12,13,14.
A incorporação de parafina, outra etapa prejudicial que reduz a antigenicidade, também é omitida. A estrutura 3D permanece em seu ambiente in vitro do início ao fim do exame microscópico. Como a estrutura 3D permanece em suas condições de crescimento, os dados de expressão e localização de proteínas imitam melhor as condições in vivo. Resultados mais precisos são esperados, uma vez que a metodologia elimina as etapas que afetam a expressão do antígeno da amostra. A Tabela 1 e a Tabela 2 demonstram como esses novos protocolos eliminam etapas, economizam tempo e mão de obra no laboratório e reduzem custos e desperdício de produtos em comparação com os fluxos de trabalho tradicionais.
Além das etapas cruciais descritas acima, outro problema é fornecer um meio e método de criopreservação para preservar a estrutura 3D da amostra com maiores taxas de viabilidade celular 26,27,28,29,30,31. A criopreservação é essencial para a criação de um sistema modelo estável e para viabilizar o biobanco de organoides e esferoides32,33. O biobanco de toda a estrutura 3D original permitirá uma recapitulação mais fiel do estado natural de saúde ou doença. As principais considerações são a conveniência e a confiabilidade da criopreservação e o descongelamento de organoides/esferoides. A recuperação de organoides pós-descongelamento é muito baixa na maioria das tecnologias atuais, muitas vezes inferior a 50%. No entanto, estudos recentes têm mostrado resultados promissores com melhora das taxas de sobrevida26,27,28,29. Lee et al. demonstraram que 78% das células esferoides sobreviveram após a criopreservação quando utilizaram a solução da Universidade de Wisconsin contendo 15% de DMSO28. A razão de sobrevida celular aumentou para 83% no estudo de Arai et al.29. No entanto, os resultados após a criopreservação são significativamente afetados, uma vez que as estruturas 3D não podem manter as mesmas características e qualidade. Além disso, os reagentes sem soro são necessários para as boas práticas de fabricação em ambientes farmacêuticos e de diagnóstico. Os fluxos de trabalho tradicionais usam um meio contendo soro fetal bovino (FBS) e dimetilsulfóxido (DMSO) para o método de congelamento lento, ambos associados a desvantagens. FBS é um produto derivado de animais e pode ter variações de lote. O DMSO é um crioprotetor muito bem-sucedido, mas a exposição a longo prazo, especialmente durante o descongelamento, pode causar efeitos citotóxicos30,31.
Este artigo também descreve a metodologia de congelamento/descongelamento de organoides inteiros ou esferoides ainda em um hidrogel. Duas fórmulas para congelamento de organoides e esferoides são utilizadas no estudo: (1) DMSO a 10% contendo solução de congelamento tradicional (FS) e (2) um meio de criopreservação sem soro e DMSO. Este meio de criopreservação contém componentes da matriz extracelular, que são diferentes das fórmulas atuais. A matriz extracelular compreende duas classes principais de macromoléculas, proteoglicanos e proteínas fibrosas, que são essenciais para o andaime físico para os constituintes celulares, mas também iniciam processos necessários para a morfogênese, diferenciação e homeostase tecidual 34,35,36,37,38,39,40 . Os colágenos proporcionam resistência à tração, regulam a adesão celular, suportam a quimiotaxia e a migração e o desenvolvimento direto dos tecidos37. Além disso, as fibras de elastina fornecem recuo aos tecidos que sofrem alongamento repetido38. Uma terceira proteína fibrosa, a fibronectina, direciona a organização da matriz extracelular intersticial e tem papel crucial na mediação da fixação celular e funciona como um mecano-regulador extracelular39. Du et al. demonstraram o efeito crioprotetor do hidrolisado de colágeno de frango sobre o sistema modelo de actomiosina natural41. Seus resultados sugerem que o hidrolisado de colágeno pode inibir o crescimento de cristais de gelo, reduzir a desnaturação e oxidação por congelamento de proteínas de forma semelhante aos crioprotetores comerciais e fornecer uma melhor estrutura de gel após os ciclos de congelamento-descongelamento. Portanto, a adição de componentes da matriz extracelular ao meio de criopreservação fornece um ambiente mais seguro e protetor para a amostra e suporta as estruturas vivas para curar após o congelamento-descongelamento.
Além disso, o presente estudo descreve um protocolo simples para marcar membranas citoplasmáticas e núcleos de organoides e esferoides vivos enquanto ainda estão no hidrogel.
Protocol
Representative Results
Discussion
O MD, complementando as formulações e protocolos aqui descritos, facilita o crescimento 3D rápido e espontâneo de organoides e esferoides em um ambiente mais controlado e continua o experimento nas mesmas condições. O espécime permanece no mesmo ambiente durante todo o processo, e quase 100% das arquiteturas de cultivo 3D permanecem intactas no recipiente. Isso melhora a homogeneidade durante os experimentos sequenciais e permite um período de cultura prolongado. Além disso, o número de etapas durante o process…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Somos gratos a Dale Mertes, da Universidade de Chicago, pela preparação de diagramas, ao Dr. Mehmet Serif Aydin por seu apoio técnico no Instituto de Pesquisa em Ciências e Tecnologias da Saúde da Universidade Medipol de Istambul e à Dra. Rana Kazemi, da Universidade de Maltepe, pela edição do manuscrito.
Materials
| Absolute Ethanol (EtOH) | Merck | 8187602500 | Dilute in dH2O to make 30%, 50%, 70%, 80%, 90% and 96% solution and store at RT |
| Acetone | Merck | 8222512500 | Store at RT |
| Alexa fluor wheat germ agglutinin and Hoechst in Hank's balanced salt solution (HBSS) | Invitrogen | I34406 | Image-IT LIVE Plasma Membrane and Nuclear Labeling Kit, Store at -20 °C |
| Alpha-1-Fetoprotein (AFP) Concentrated and Prediluted Polyclonal Antibody | Biocare Medical | CP 028 A | Store at +4 °C |
| Anti-albumin antibody | Abcam | EPR20195 | Store at +4 °C, Dilution: 1:50 |
| Anti-beta galactosidase antibody, Chicken polyclonal | Abcam | 134435 | Store at +4 °C, Dilution: 1:25 |
| Anti-cytokeratin 5 | Abcam | 53121 | Store at +4 °C, Dilution: 1:100 |
| Arginase-1 Concentrated and Prediluted Rabbit Monoclonal Antibody | Biocare Medical | ACI 3058 A, B | Store at +4 °C, Dilution: 1:50 |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C1016-500G | Dissolve in Karnovsky's fixative to make 2 mM CaCl2; store at RT |
| Cell Counting Kit 8 (WST-8 / CCK8) | Abcam | ab228554 | |
| Centrifuge tubes, 15 mL | Nest | 601051 | |
| Centrifuge tubes, 50 mL | Nest | 602052 | |
| Class II Microbiological Safety Cabinet Bio II Advance Plus | Telstar | EN12469 | |
| CO2 Incubator | Panasonic | KM-CC17RU2 | |
| Copper Grids | Electron Microscopy Sciences | G100-Cu | Ultra-thin sections put on the grids; 100 lines/inch square mesh |
| Critical Point Dryer | Leica | EM CPD300 | For drying biological samples for SEM applications in absolute acetone |
| DAB/AEC chromogen solution mixture | Sigma Aldrich | AEC101 | Store at +4 °C |
| Diamond knife | Diatome | Ultra 45°, 40-US | Use for ultra-thin sections for TEM |
| Dimethyl sulfoxide for molecular biology | Biofroxx | 67-68-5 | |
| Disposable Plastic Pasteur Pippettes | Nest | ||
| DMEM – Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 41966-029 | Store at +4 °C |
| Eosin Y Solution Alcoholic | Bright Slide | 2.BS01-105-1000 | |
| Epon resin | Sigma | 45359-1EA-F | Epoxy Embedding Medium kit, Store at +4 °C |
| Fetal Bovine Serum with Additive Fortifier | Pan Biotech | P30-3304 | Store at +4 °C |
| Freezing Solution (FS) | Cellorama | CellO-F | Store at +4 °C |
| Glass knife maker | Leica | EM KMR3 | For make glass knives in 8 mm thickness |
| Glass knife strips (Size 8 mm x 25.4 mm x 400 mm) | Leica | 7890-08 | Use for ultra- or semi-thin sections for TEM |
| Glutaraldehyde Aqueous Solution, EM grade, 25% | Electron Microscopy Sciences | 16210 | Dilute in dH2O to make 2.5% solution and store at +4 °C |
| Glycerol solution | Sigma Aldrich | 56-81-5 | Store at -20 C, Dilution :1:100 |
| Goat anti-chicken IgY (H+L) Secondary Antibody,Alexa, 647 | Invitrogen | A32933 | Store at RT |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488 | Invitrogen | 35502 | Store at +4 °C, Dilution :1:50 |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550 | Invitrogen | 84540 | Store at +4 °C, Dilution :1:50 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488 | Invitrogen | 35552 | Store at +4 °C, Dilution :1:50 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550 | Invitrogen | 84541 | Store at +4 °C |
| Hematoxylin Harris | Bright Slide | 2.BS01-104-1000 | |
| HepG2 cells | ATCC | HB-8065 | Store in nitrogen tank |
| Human/Rat OV-6 Antibody Monoclonal Mouse IgG1 Clone # OV-6 | R&D Systems | MAB2020 | Store at -20 °C |
| Hydrogel | Corning | 354248 | Matrigel, Basement Membrane Matrix High Concentration (HC), LDEV-free, 10 mL, Store at -20 °C |
| Hydrogel | Corning | 354234 | Matrigel, Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL, Store at -20 °C |
| Hydrogel | ThermoFischer Scientific | A1413201 | Geltrex, LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix |
| Hydrogel | Biotechne, R&D Systems | BME001-01 | Cultrex Ultramatrix RGF BME, Store at -20 °C |
| Karnovsky's fixative | %2 PFA, %2.5 Glutaraldehyde in 0.15 M Cacodylate Buffer, 2 mM CaCl2; prepare fresh; use for TEM & SEM samples | ||
| L-Aspartic acid | Sigma | 11189-100G | Store at RT |
| Lead aspartate solution | Dissolve 40 mg aspartic acid in 10 mL ddH2O and add 66 mg lead nitrate. Solution stabilize at 60 °C and adjust pH to 5; prepare fresh | ||
| Lead nitrate | Electron Microscopy Sciences | 17900 | Store at RT |
| Leica Confocal Microscope | Leica | DMi8 | |
| LSM 700 Laser Scanning Confocal Microscope | Zeiss | ||
| Microplate reader | Biotek Synergy | ||
| Multipurpose Device (MD) | Cellorama | CellO-M | |
| Nuclear-DNA stain | Invitrogen | H3569 | Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) – 10 mg/mL Solution in Water, Store at +4 °C |
| Nuclear-DNA stain | ThermoFischer Scientific | 62248 | DAPI solution, Store at +4 °C |
| Osmium Tetroxide (OsO4) ,4% | Electron Microscopy Sciences | 19190 | Dilute in dH2O to make 2% solution; store at +4 °C and in airtight container; protect light |
| Ov6 antibody | R&D systems | MAB2020 | Store at +4 °C |
| Paraformaldehyde (PFA) solution, 4% | Sigma | 1.04005.1000 | Dissolve 4% PFA in dH2O and boil, cool and aliquot; store at -20 °C |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS, 1 L | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Store at +4 °C |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), tablets | MP Biomedicals, LLC | 2810305 | |
| Post-fixative solution | %2 OsO4, %2.5 Potassium Ferrocyanide in dH2O; prepare fresh | ||
| Potassium Ferrocyanide aqueous solution, 5% | Electron Microscopy Sciences | 26603-01 | Store at RT |
| Primovert – Inverted Bright Field Microscope – ZEISS | Zeiss | Item no.: 491206-0001-000 | |
| Round bottom microcentrifuge tubes, 2 mL | Nest | 620611 | |
| Scanning Electron Microscopy with STEM attachment | Zeiss | GeminiSEM 500 | We use Inlens Secondary Electron (SE) detector at 2-3 kV for scanning electron micrographs and aSTEM detector at 30 kV for transmission electron micrographs. |
| SensiTek HRP Anti-Polyvalent Lab Pack | ScyTek Laboratories | SHP125 | Store at +4 °C |
| Sodium Cacodylate Buffer, 0.4 M, pH 7.2 | Electron Microscopy Sciences | 11655 | Dilute in dH2O to make 0.2 M and store at +4 °C |
| Sodium/Potassium ATPase alpha 1 antibody [M7-PB-E9] | GeneTex | GTX22871 | Store at -20 °C |
| Solution for Immunofluorescence Labeling (S-IF) | Cellorama | CellO-IF | Store at +4 °C |
| Solution for Immunohistochemistry (S-IHC) | Cellorama | CellO-P | Store at +4 °C |
| Specimen trimming device | Leica | EM TRIM2 | For prepare epon sample block to ultramicrotome |
| Sputter coater | Leica | EM ACE200 | Coat the SEM samples with 6 nm gold/palladium for 90 s |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | Sigma | 223220-5G | Dilute in dH2O to make 0.5% solution and filter with 0.22 µm membrane filter; store at RT; prepare fresh |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Ultra gel super glue | Pattex | PSG2C | For glue polymerized epon block with sample to holder epon block |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | For prepare high-quality ultra- or semi-thin sections for transmission electron microscopy (TEM) |
| Universal Pipette Tips, 10 µL | Nest | 171215-1101 | |
| Universal Pipette Tips, 1000 µL | Isolab | L-002 | |
| Universal Pipette Tips, 200 µL | Nest | 110919HA01 | |
| Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | Dilute in dH2O to make 2% solution and filter with 0.22 µm membrane filter; keep tightly closed container store at RT |
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