Il presente protocollo descrive la generazione di modelli di coltura tumorale 3D da cellule tumorali primarie e la valutazione della loro sensibilità ai farmaci utilizzando saggi di vitalità cellulare ed esami microscopici.
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Articolo metodologico
Stabilire sferoidi 3-dimensionali da campioni tumorali derivati dal paziente e valutare la loro sensibilità ai farmaci
In questo articolo
Sommario
Abstract
Nonostante i notevoli progressi nella comprensione della biologia tumorale, la stragrande maggioranza dei candidati farmaci oncologici che entrano negli studi clinici falliscono, spesso a causa della mancanza di efficacia clinica. Questo alto tasso di fallimento illumina l'incapacità degli attuali modelli preclinici di prevedere l'efficacia clinica, principalmente a causa della loro inadeguatezza nel riflettere l'eterogeneità del tumore e il microambiente tumorale. Queste limitazioni possono essere affrontate con modelli di coltura tridimensionali (3D) (sferoidi) stabiliti da campioni di tumore umano derivati da singoli pazienti. Queste colture 3D rappresentano la biologia del mondo reale meglio delle linee cellulari stabilite che non riflettono l'eterogeneità del tumore. Inoltre, le colture 3D sono migliori dei modelli di coltura bidimensionale (2D) (strutture monostrato) poiché replicano elementi dell'ambiente tumorale, come ipossia, necrosi e adesione cellulare, e preservano la forma e la crescita naturale delle cellule. Nel presente studio, è stato sviluppato un metodo per preparare colture primarie di cellule tumorali da singoli pazienti che sono 3D e crescono in sferoidi multicellulari. Le cellule possono essere derivate direttamente da tumori del paziente o xenotrapianti derivati dal paziente. Il metodo è ampiamente applicabile ai tumori solidi (ad esempio, colon, seno e polmone) ed è anche conveniente, in quanto può essere eseguito nella sua interezza in un tipico laboratorio di ricerca sul cancro / biologia cellulare senza fare affidamento su attrezzature specializzate. Qui viene presentato un protocollo per generare modelli di coltura tumorale 3D (sferoidi multicellulari) da cellule tumorali primarie e valutare la loro sensibilità ai farmaci utilizzando due approcci complementari: un saggio di vitalità cellulare (MTT) e esami microscopici. Questi sferoidi multicellulari possono essere utilizzati per valutare potenziali candidati farmacologici, identificare potenziali biomarcatori o bersagli terapeutici e studiare i meccanismi di risposta e resistenza.
Introduzione
Gli studi in vitro e in vivo rappresentano approcci complementari per lo sviluppo di trattamenti contro il cancro. I modelli in vitro consentono il controllo della maggior parte delle variabili sperimentali e facilitano le analisi quantitative. Spesso fungono da piattaforme di screening a basso costo e possono essere utilizzati anche per studi meccanicistici1. Tuttavia, la loro rilevanza biologica è intrinsecamente limitata, in quanto tali modelli riflettono solo parzialmente il microambiente tumorale1. Al contrario, i modelli in vivo, come gli xenotrapianti derivati dal paziente (PDX), cattura....
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Protocollo
La raccolta di campioni di tumore umano utilizzati per le colture di cellule tumorali primarie è stata eseguita secondo i protocolli approvati dal comitato di revisione istituzionale (IRB) presso il Rabin Medical Center con il consenso informato scritto dei pazienti. I pazienti eleggibili per la partecipazione allo studio includevano pazienti con cancro adulto e pediatrico di sesso maschile e femminile con cancro al seno, al colon, al fegato, ai polmoni, neuroendocrino, ovarico o pancreatico non metastatico, qualsiasi cancro pediatrico o qualsiasi cancro metastatico. L'unico criterio di esclusione era la mancanza di capacità di fornire il consenso informato.
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Risultati
Questo protocollo presenta procedure per generare una coltura omogenea di sferoidi da cellule tumorali primarie, valutando quantitativamente l'efficacia del farmaco sulla coltura sferoidale (saggio MTT) e determinando l'effetto dei farmaci in studio sulla morfologia sferoide. Vengono presentati i dati degli esperimenti rappresentativi in sferoidi generati da colture cellulari di cancro al colon e al seno. Esperimenti simili sono stati eseguiti utilizzando altri tipi di tumore, tra cui colangiocarcinoma, gastrico, polmona.......
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Discussione
Il presente protocollo descrive un metodo semplice per generare colture cellulari primarie 3D (sferoidi) derivate da campioni tumorali umani. Questi sferoidi possono essere utilizzati per varie analisi, tra cui la valutazione di potenziali candidati farmaci e combinazioni di farmaci, l'identificazione di potenziali biomarcatori o bersagli terapeutici e lo studio dei meccanismi di risposta e resistenza. Il protocollo utilizza cellule tumorali primarie derivate direttamente da campioni di pazienti o cellule tumorali da mod.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 5 Fluorouracile | TEVA Israele | lotto 16c22NA | Fluorouracile, Adrucil |
| Accutase | Gibco | A1110501 | StemPro Accutase Dissociazione cellulare |
| Cisplatino | TEVA Israele | 20B06LA | Abiplatino, |
| Cultrex | Trevigen | 3632-010-02 | Matrice di membrana basale, tipo 3 |
| DMSO (dimetilsolfossido) | Sigma Aldrich | D2650-100ML | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2391595 | |
| Flurometro Lettore ELISA | Biotek | Synergy H1 | Gen5 3.11 |
| Acido cloridrico (HCl) | Sigma Aldrich 320331 | per la soluzione di arresto | |
| ImageJ | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA& | nbsp; Versione 1.52a | Software open source ImageJ |
| Isopropanolo | Gadot | P180008215 | per soluzione di arresto |
| L-glutammina | Gibco | 1843977 | |
| MTT | Sigma Aldrich | M5655-1G | 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro |
| Aminoacidi non essenziali | Gibco | 11140050 | |
| Palbociclib | Med Chem Express | CAS # 571190-30-2 | |
| PBS | Gibco | 14190094 | soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS)*Senza |
| penicillina di calcio e magnesio... streptomicina | Invitrogen | 2119399 | |
| Senza fenolo RPMI 1640 | Industrie biologiche, Israele | 01-103-1A | |
| Serbatoio di Pippeting | Alexred | RED LTT012025 | |
| Terreno di coltura RPMI-1640 | Gibco | 11530586 | |
| Sunitinib | Med Chem Express | CAS # 341031-54-7 | |
| Trastuzumab | F. Hoffmann - La Roche Ltd, Basilea, Switherland | 10172154 IL | Herceptin |
| Trypan blue 0,5% soluzione | Industrie biologiche, Israele | 03-102-1B | |
| Piastra a 96 pozzetti con attacco ultrabasso | Greiner Bio-one | 650970 | |
| Vinorelbine | Ebewe | 11733027-03 | Navelbine |
Riferimenti
- Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In vitro tumor models: Advantages, disadvantages, variables, and selecting the right platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12(2016).
- Yoshida, G. J.
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Ristampe e permessi
