Den metaboliske status af humane retinale pigmentepitelceller (H-RPE) afspejler deres sundhed og funktion. Her præsenteres en optimeret protokol til undersøgelse af den metaboliske flux i realtid af H-RPE ved hjælp af respirometri med høj opløsning.
Metabolisk dysfunktion af retinale pigmentepitelceller (RPE) er en vigtig patogen drivkraft for retinale sygdomme såsom aldersrelateret makuladegeneration (AMD) og proliferativ vitreoretinopati (PVR). Da RPE er stærkt metabolisk aktive celler, afspejler ændringer i deres metaboliske status ændringer i deres sundhed og funktion. Respirometri med høj opløsning muliggør kinetisk analyse i realtid af de to store bioenergetiske veje, glykolyse og mitokondriel oxidativ phosphorylering (OXPHOS), gennem kvantificering af henholdsvis den ekstracellulære forsuringshastighed (ECAR) og iltforbrugshastigheden (OCR). Følgende er en optimeret protokol til udførelse af respirometri med høj opløsning på primære humane retinale pigmentepitelceller (H-RPE). Denne protokol giver en detaljeret beskrivelse af de trin, der er involveret i fremstilling af bioenergetiske profiler af RPE for at definere deres basale og maksimale OXPHOS og glykolytiske kapacitet. At udsætte H-RPE for forskellige lægemiddelinjektioner rettet mod mitokondrie- og glykolytmaskineriet resulterer i definerede bioenergetiske profiler, hvorfra vigtige metaboliske parametre kan beregnes. Denne protokol fremhæver BAM15’s forbedrede respons som afkoblingsmiddel sammenlignet med carbonylcyanid p-trifluoromethoxyphenylhydrazon (FCCP) for at inducere den maksimale respirationskapacitet i RPE. Denne protokol kan bruges til at studere RPE’s bioenergetiske status under forskellige sygdomstilstande og teste effekten af nye lægemidler til at genoprette RPE’s basale metaboliske status.
Retinale pigmentepitelceller (RPE) eksisterer som et monolag af pigmenterede epitelceller, der er strategisk placeret mellem fotoreceptorerne og det fenestrerede endotel i choriocapillaris. RPE er meget metabolisk aktive med adskillige funktioner, herunder (1) fagocytose af skurfotoreceptorskiver, (2) genbrug af visuelt pigment for at opretholde den visuelle cyklus, (3) transport af næringsstoffer, metabolitter, ioner og vand, (4) absorption af lys, (5) beskyttelse mod fotooxidation, (6) sekretion af væsentlige faktorer til støtte for retinal integritet og (7) dannelse af den ydre blod-retinale barriere1 . Degeneration af RPE er forbundet med metabolisk dysfunktion og mitokondriedefekter, hvilket fører til blændende øjensygdomme såsom aldersrelateret makuladegeneration (AMD) og proliferativ vitreoretinopati (PVR)2.
To vigtige bioenergetiske veje omfatter glykolyse, som forekommer i cytoplasmaet, og oxidativ phosphorylering (OXPHOS), som forekommer i mitokondrier. Under glykolyse omdannes et molekyle glucose til to molekyler pyruvat og en nettoproduktion af to molekyler adenosintrifosfat (ATP). I modsætning til glykolyse producerer OXPHOS langt højere niveauer af ATP (~ 32-38 molekyler ATP pr. Glukosemolekyle). Især forbruger OXPHOS ilt og kræver, at funktionelle mitokondrier forekommer, mens glykolyse forekommer i cytoplasmaet og ikke kræver ilt.
Før introduktionen af fluorescens- eller phosphorescensbaserede teknikker til undersøgelse af mitokondriel respiration blev iltniveauerne målt i permeabiliserede cellesuspensioner i kamre udstyret med en iltelektrode af Clark-typen3. Mens Clark-elektroden er meget billigere end fluorescensbaseret respirometri og fungerer i ikke-klæbende celler, er den relativt lav gennemstrømning, hvor hver åndedrætskørsel varer omkring 15-20 minutter og kræver langt større mængder celler til hver prøve3. Således har den fluorescensbaserede respirometriteknik stort set erstattet Clark-elektroden og er blevet en populær teknik inden for metabolisme og mitokondrieforskning.
Denne protokol beskriver en høj kapacitet, høj opløsning, fluorescensbaseret respirometri teknik, der kinetisk måler OXPHOS og glykolytiske bioenergetiske profiler af levende celler. Da processen med OXPHOS forbruger ilt, produceres den bioenergetiske profil for OXPHOS ved at kortlægge ændringer i iltforbrugshastigheden (OCR) over tid4. I denne teknik er to fluoroforer indlejret i sensorpatronhylsteret, der er forbundet med fiberoptiske bundter, der udsender lys og spænder fluoroforerne. Ændringer i fluoroforemission måles af meget følsomme fluorescenssensorer og overføres gennem det fiberoptiske bundt, der skal konverteres til en OCR-aflæsning5. Fluoroforen slukkes af ilt, hvilket muliggør bestemmelse af ekstracellulære iltniveauer i analysemediet, kendt som oxygenflux eller OCR. Den anden fluorofor er en pH-sensorsonde, der er følsom over for ændringer i protonefflux, som omdannes til et mål for ekstracellulær forsuringshastighed (ECAR). Under målinger sænkes de fiberoptiske bundter med indlejrede fluoroforer til 200 μm over cellemonolaget, hvilket skaber et forbigående mikrokammer, der muliggør hurtige aflæsninger i realtid. Når en 10% ændring i ilt- eller protonniveauer er detekteret, løftes sensorerne opad, hvilket tillader en større mængde medier at blande sig med de forbigående mikrokammermedier, hvilket gendanner OCR- og ECAR-værdier tilbage til baseline. Hver sensorpatron er udstyret med fire porte for at muliggøre sekventiel administration af op til fire forbindelser pr. brønd under analysen. Målinger kan indsamles før og efter injektion af forbindelserne i hver port, hvilket afslører nøgleoplysninger om cellernes metaboliske status.
Undersøgelse af disse to forskellige metaboliske veje kan give vigtige opdagelser vedrørende RPE’s metaboliske status efter eksponering for forskellige patogene stimuli og kan således bruges til at teste effektiviteten af lægemidler til at genoprette den metaboliske integritet af RPE 6,7,8. Fremkomsten af respirometri med høj kapacitet og tilgængeligheden af specifikke mitokondriehæmmere har stimuleret mere forskning i at definere de bioenergetiske profiler af RPE og identificere defekter i metabolisme og mitokondrier under sygdomstilstande 6,7,8,9,10,11,12,13 . Respirometri med høj opløsning har fremhævet nøglerollen som metabolisk omprogrammering af RPE i retinale patologier som AMD og PVR. To vigtige cytokiner involveret i patogenesen af AMD og PVR transformerer vækstfaktor-beta 2 (TGFβ2) og tumornekrosefaktor-alfa (TNFα). Induktionen af epitel-mesenkymal overgang (EMT) af TGFβ2 ledsages af mitokondriel dysfunktion, OXPHOS-undertrykkelse og en kompenserende stigning i glycolytisk kapacitet i RPE6. For nylig har det proinflammatoriske cytokin, TNFα, vist sig at inducere en signifikant opregulering af basal OXPHOS og reduceret glykolyse i H-RPE7. Administration af dimethylfumarat undertrykte signifikant TNFα-induceret inflammation i H-RPE og genoprettede mitokondriemorfologi og basale bioenergetiske profiler7. De divergerende metaboliske profiler induceret af disse to vækstfaktorer stimulerer spændende mekanistiske spørgsmål vedrørende involvering af metabolisk omprogrammering i retinale sygdomme. Følgende protokol beskriver trinene til vurdering af OXPHOS og glykolytiske bioenergetiske profiler i H-RPE ved hjælp af respirometri med høj opløsning.
Denne optimerede protokol til højopløsningsrespirometri af H-RPE involverer brugen af BAM15 som afkobler i stedet for den almindeligt anvendte FCCP. Mens tidligere undersøgelser af høj opløsning respirometri af RPE anvendte FCCP 9,24, synes BAM15 at inducere en mere robust induktion af maksimale respirationsniveauer i H-RPE sammenlignet med FCCP. Mens både FCCP og BAM15 er sikre at bruge i celler, rapporteres BAM15 at have færre bivirkninger i normale celler sammenlignet med FCCP eller carbonylcyanid-3-chlorphenylhydrazon (CCCP)25. Kenwood et al. viste, at BAM15 depolariserer mitokondrier uden at påvirke plasmamembranpotentialet og dermed inducerer en vedvarende maksimal mitokondriel respirationshastighed ved lav cytotoksicitet26. FCCP depolariserer derimod både mitokondrier og plasmamembranen og viser højere cytotoksicitet26.
Der er flere kritiske trin i protokollen, herunder at sikre, at cellerne er korrekt belagt i et sammenflydende, jævnt og homogent monolag af RPE i alle eksperimentelle brønde i mikropladen. Ældre RPE er stærkt afhængige af OXPHOS til energiproduktion, og cellerne skal derfor have lov til at modnes i mindst 1 måned for at sikre, at RPE genererer korrekte basale og maksimale OCR-aflæsninger under analysen. Afgasning af cellekulturpladen i 1 time ved 37 °C i en befugtet ovn (uden CO 2), inden den placeres i instrumentet, er afgørende for nøjagtige ECAR-aflæsninger, da CO2 kan påvirke analysemediets pH. Det er vigtigt at huske at hydrere sensorpatronen dagen før analysen for at sikre, at den giver pålidelige OCR- og ECAR-aflæsninger på analysedagen. Der skal udvises omhu for korrekt rekonstitution af de lægemidler, der skal injiceres, og alikvote de rekonstituerede lægemiddellagre i mindre mængder til langtidsopbevaring for at minimere fryse-/optøningscyklusser. Det er afgørende at forberede 10x lægemiddelopløsninger, der fortyndes i de respektive analysemedier (f.eks. Fortynd i Mito-stresstestanalysemedier til Mito-stresstesten) for at indregne fortyndingen fra injektion af lægemidlet i hver brønd fyldt med analysemedier. Ved hver efterfølgende lægemiddelinjektion er der flere medier i hver brønd, og derfor øges mængderne af lægemiddel, der fyldes med hver injektion, og man skal sørge for at følge de mængder, der er angivet i protokollen. Det er vigtigt at udføre kvalitetskontrol efter afslutningen af eksperimentet ved at undersøge sensorpatronen for at sikre, at der ikke er noget resterende lægemiddel tydeligt og observere cellekulturpladen under et mikroskop for at sikre, at det sammenflydende og homogene cellemonolag forbliver.
Ændringer af denne protokol inkluderer injektion af forskellige lægemidler i havnene og bestemmelse af, hvordan disse lægemidler påvirker OCR- og ECAR-aflæsninger. En populær ændring er at injicere et eksperimentelt lægemiddel efter eget valg som Port A, før du injicerer de sædvanlige Mito- eller glykolytiske stresstestlægemidler. Denne type protokol giver indsigt i, hvordan en akut injektion af det valgte lægemiddel påvirker de efterfølgende OXPHOS og glykolytiske parametre. Andre ændringer omfatter undersøgelse af forskellige celletyper; dette kræver indledende fejlfinding af den optimale såcelletæthed og optimering af analysemediet ved at sikre, at basale aflæsninger spænder fra 50-100 pmol / min for OCR og 10-20 mpH / min for ECAR. De optimale koncentrationer af de injicerede lægemidler skal bestemmes for hver ny celletype, der undersøges, ved at observere OCR- og ECAR-responserne på en seriel fortynding af lægemidlerne.
En vigtig begrænsning af protokollen er, at cellelevedygtigheden falder over tid, da cellerne ikke er i en CO2 -inkubator i deres normale vækstmedier, og analysen skal derfor afsluttes inden for 3-4 timer for at sikre maksimal cellelevedygtighed. Desuden kan eksponering for mitokondrietoksiner, der injiceres i hver brønd, yderligere mindske cellelevedygtigheden over tid. Når analysen er afsluttet, skal cellerne lyseres til evaluering af proteinindholdet for at normalisere OCR- og ECAR-aflæsninger, og derfor kan de samme celler ikke høstes til efterfølgende molekylærbiologiske assays.
Alternativer til Seahorse til bioenergetisk profilering inkluderer Oroboros Oxygraph 2k (O2k)27, BaroFuse28,29 og Resipher (Lucid Scientific)7. Oroboros O2k er et lukket to-kammer respirometer, der bruger S1 Clark-type polarografiske iltelektroder. Mens Oroboros O2k producerer meget følsomme målinger af metabolisk flux i realtid, er enheden arbejdskrævende, da operatøren skal injicere hvert lægemiddelmanuelt 30. BaroFuse er et nyt multikanals mikrofluidisk perfusionssystem, der bruger gastryk til at muliggøre flere parallelle perfusionseksperimenter og er knyttet til et iltdetekteringssystem til måling af OCR. Fordelen ved dette flowkultursystem er, at vævsfunktion og levedygtighed opretholdes i modsætning til Seahorse, hvor cellelevedygtigheden mindskes over længere assays. Resipher bruger meget følsomme optiske iltsensorer til at måle OCR, mens cellerne er i en 96-brønds plade i inkubatoren, hvilket muliggør kontinuerlige OCR-målinger over flere uger til måneder. Især måler disse instrumenter ikke ECAR, og derfor har Seahorse fordelen ved samtidig udforskning af både OXPHOS og glykolyse.
Forhør af bioenergetiske profiler i realtid af OXPHOS og glykolyse fremstår som en nøglefaktor i karakteriseringen af RPE’s sundhed og funktion. Respirometri med høj opløsning muliggør et effektivt middel til at sammenligne metabolisk status for normal og syg RPE og åbner dermed nye muligheder for screening af lægemiddeleffektivitet for nethindesygdomme som AMD og PVR. Fremtidige retninger for respirometri med høj opløsning på RPE inkluderer optimering af en protokol til undersøgelse af bioenergetiske profiler for stærkt polariserede RPE-monolag dyrket på transwellfiltre. Calton et al. (2016) opnåede dette med succes ved at skære en trekantet sektion af det polariserede RPE-monolag dyrket på transwellfiltre31. Yderligere udvidelse af metoden omfatter undersøgelse af de bioenergetiske profiler af induceret pluripotent stamcelleafledt RPE (iPSC-RPE), isoleret fra patienter med forskellige retinale degenerative tilstande32. Udforskning af, hvordan patogene cytokiner involveret i AMD og PVR påvirker den dynamiske karakter af RPE-metabolisme, kan afsløre metaboliske sårbarheder, der kan informere identifikationen af nye lægemiddelbare mål.
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev delvist støttet af tilskud fra: Fight for Sight Leonard & Robert Weintraub Postdoctoral Fellowship (D.Y.S.); BrightFocus Foundation Postdoc-stipendieprogram i makuladegenerationsforskning (M2021010F, D.Y.S.); Department of Defense, Spinal Vision Research Program under Award nr. VR180132 (M.S.-G. og L.A.K.); National Eye Institute of the National Institutes of Health under pris nr. R01EY027739 (L.A.K.). Der gives anerkendelse til donorerne af Macular Degeneration Research M2021010F, et program fra BrightFocus Foundation, til støtte for denne forskning. Skemaer blev oprettet med Biorender.com
2-Deoxy-D-glucose | Sigma | D8375-5G | Reconstituted in the Glycolytic Assay Media from its powder form and used in the Glycolytic Stress Test (Port C injection) |
96 Well Non-Treated Plate, 5/Pack, Sterile | VWR | 229597 | BCA Assay 96-well plate |
Antimycin A from Streptomyces sp. | Sigma | A8674-25MG | Inhibitor of Complex III of the electron transport chain (part of the Port C drug injection together with rotenone) |
BAM15 | Sigma | SML1760-5MG | Uncoupling agent used for the Mito Stress Test (Port B injection) |
BCA Assay | ThermoFisher | 23225 | To determine total protein content in each well |
Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | Solution used to calibrate the probes of the sensor cartridge |
Cell Lysis buffer 10x | Cell Signaling Technologies | 9803S | Dilute 10x Cell Lysis Buffer to a 1x solution using deionized water and add 1 mM PMSF before use |
D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8644-100ML | Supplement to be added to the Mito Stress Test assay media and also used in the Glycolytic Stress Test (Port A injection) |
DMSO, Cell culture grade | Sigma-aldrich | D4540-100ML | For reconstituting all mitochondrial drugs except for 2DG |
FCCP | Sigma | C2920-10MG | Uncoupling agent used for the Mito Stress Test (Port B injection) |
GlutaMAX | Gibco | 35050061 | Supplement to be added to the assay media for both the Mito and Glycolytic Stress Tests |
HEPES solution | Sigma | H0887-100ML | Supplement to be added to the assay media for both the Mito and Glycolytic Stress Tests |
H-RPE – Human Retinal Pigment Epithelial Cells | Lonza | 194987 | Primary human fetal RPE cells |
Oligomycin – CAS 1404-19-9 – Calbiochem | Sigma | 495455-10MG | ATP synthase inhibitor used for the Mito Stress Test (Port A injection) and Glycolytic Stress Test (Port B injection) |
Parafilm | Bemis | PM996 | To seal the plate once the cells are lysed to prevent evaporation in the freezer |
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Protease Inhibitor | Gold Biotechnology Inc | 50-153-2823 | Used at 1 mM for the 1x Cell Lysis Buffer solution |
ReagentPack Subculture Reagents, 100 mL | Lonza | CC-5034 | Passaging reagents for primary human fetal RPE cells. Each kit contains 100 mL Trypsin/EDTA, Trypsin Neutralizing Solution, HEPES Buffered Saline |
Rotenone | Sigma | R8875-1G | Inhibitor of Complex I of the electron transport chain (part of the Port C drug injection together with antimycin A) |
RtEGM Retinal Pigment Epithelial Cell Growth Medium BulletKit – RtEBMTM Basal Medium (00195406) and RtEGMTM SingleQuots Supplements (00195407) | Lonza | 195409 | Media for primary human fetal RPE cells |
Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | High-Resolution Respirometry Instrument | |
Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | This contains the 96-well Seahorse Cell Culture Microplate, the sensor cartridge and the calibrant solution |
Sodium pyruvate solution | Sigma | S8636-100ML | Supplement to be added to the Mito Stress Test assay media |
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 50 mL process volume, 0.22 µm pore size | Millipore-Sigma | SCGP00525 | Tube top filter unit for sterile filtration of the assay media |
Synergy H1 Plate Reader | BioTek | Plate Reader for measuring absorbance at 562 nm for the BCA assay | |
XF base medium without phenol red | Agilent | 103335-100 | Base media for running the Seahorse assay |