मानव रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं (एच-आरपीई) की चयापचय स्थिति उनके स्वास्थ्य और कार्य को दर्शाती है। यहां प्रस्तुत उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वसनमिति का उपयोग करके एच-आरपीई के वास्तविक समय चयापचय प्रवाह की जांच के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल है।
रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं (आरपीई) की चयापचय शिथिलता रेटिना रोगों जैसे उम्र से संबंधित मैकुलर अपघटन (एएमडी) और प्रोलिफेरेटिव विट्रोरेटिनोपैथी (पीवीआर) का एक प्रमुख रोगजनक चालक है। चूंकि आरपीई अत्यधिक चयापचय-सक्रिय कोशिकाएं हैं, इसलिए उनकी चयापचय स्थिति में परिवर्तन उनके स्वास्थ्य और कार्य में परिवर्तन को दर्शाता है। उच्च-रिज़ॉल्यूशन रेस्पिरोमेट्री क्रमशः बाह्य अम्लीकरण दर (ईसीएआर) और ऑक्सीजन खपत दर (ओसीआर) के परिमाणीकरण के माध्यम से दो प्रमुख बायोएनर्जेटिक मार्गों, ग्लाइकोलाइसिस और माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन (ओएक्सपीएचओएस) के वास्तविक समय गतिज विश्लेषण की अनुमति देती है। निम्नलिखित प्राथमिक मानव रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं (एच-आरपीई) पर उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वसनमिति के संचालन के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल है। यह प्रोटोकॉल उनके बेसल और अधिकतम ओएक्सपीओएस और ग्लाइकोलाइटिक क्षमताओं को परिभाषित करने के लिए आरपीई के बायोएनर्जेटिक प्रोफाइल के उत्पादन में शामिल चरणों का विस्तृत विवरण प्रदान करता है। माइटोकॉन्ड्रियल और ग्लाइकोलाइटिक मशीनरी को लक्षित करने वाले विभिन्न दवा इंजेक्शन के लिए एच-आरपीई को उजागर करने से परिभाषित बायोएनर्जेटिक प्रोफाइल होते हैं, जिससे प्रमुख चयापचय मापदंडों की गणना की जा सकती है। यह प्रोटोकॉल आरपीई में अधिकतम श्वसन क्षमता को प्रेरित करने के लिए कार्बोनिल साइनाइड पी-ट्राइफ्लोरोमेथोक्सीफेनिलहाइड्राज़ोन (एफसीसीपी) की तुलना में एक अनकपलिंग एजेंट के रूप में बीएएम 15 की बढ़ी हुई प्रतिक्रिया पर प्रकाश डालता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग विभिन्न रोग स्थितियों के तहत आरपीई की बायोएनर्जेटिक स्थिति का अध्ययन करने और आरपीई की बेसल चयापचय स्थिति को बहाल करने में नई दवाओं की प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है।
रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाएं (आरपीई) कोरियोकेशिकाओं के फोटोरिसेप्टर और फेनेस्टेड एंडोथेलियम के बीच रणनीतिक रूप से स्थित पिगमेंटेड एपिथेलियल कोशिकाओं के मोनोलेयर के रूप में मौजूद हैं। आरपीई कई कार्यों के साथ अत्यधिक चयापचय रूप से सक्रिय हैं, जिनमें (1) शेड फोटोरिसेप्टर डिस्क का फागोसाइटोसिस, (2) दृश्य चक्र को बनाए रखने के लिए दृश्य वर्णक का पुनर्चक्रण, (3) पोषक तत्वों, मेटाबोलाइट्स, आयनों और पानी का परिवहन, (4) प्रकाश का अवशोषण, (5) फोटोऑक्सीडेशन के खिलाफ सुरक्षा, (6) रेटिना अखंडता का समर्थन करने के लिए आवश्यक कारकों का स्राव, और (7) बाहरी रक्त-रेटिना बाधाका गठन 1 . आरपीई का अध: पतन चयापचय शिथिलता और माइटोकॉन्ड्रियल दोषों से जुड़ा हुआ है, जिससे उम्र से संबंधित मैकुलर अपघटन (एएमडी) और प्रोलिफेरेटिव विट्रोरेटिनोपैथी (पीवीआर) 2 जैसे आंखों के रोग हो सकते हैं।
दो प्रमुख बायोएनर्जेटिक मार्गों में ग्लाइकोलाइसिस शामिल है, जो साइटोप्लाज्म में होता है, और ऑक्सीडेटिव फॉस्फोराइलेशन (ओएक्सपीएचओएस), जो माइटोकॉन्ड्रिया में होता है। ग्लाइकोलाइसिस के दौरान, ग्लूकोज का एक अणु पाइरूवेट के दो अणुओं और एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) के दो अणुओं के शुद्ध उत्पादन में परिवर्तित हो जाता है। ग्लाइकोलाइसिस के विपरीत, OXPHOS एटीपी के उच्च स्तर (~ 32-38 अणु प्रति ग्लूकोज अणु) का उत्पादन करता है। विशेष रूप से, OXPHOS ऑक्सीजन का उपभोग करता है और कार्यात्मक माइटोकॉन्ड्रिया की आवश्यकता होती है, जबकि ग्लाइकोलाइसिस साइटोप्लाज्म में होता है और ऑक्सीजन की आवश्यकता नहीं होती है।
माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन की जांच करने के लिए प्रतिदीप्ति- या फॉस्फोरेसेंस-आधारित तकनीकों की शुरूआत से पहले, क्लार्क-प्रकार ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड 3 से लैस कक्षों में परमेबिलाइज्ड सेल सस्पेंशन में ऑक्सीजन के स्तर को मापागया था। जबकि क्लार्क इलेक्ट्रोड फ्लोरेसेंस-आधारित श्वासमिति की तुलना में बहुत सस्ता है और गैर-अनुयायी कोशिकाओं में काम करता है, यह अपेक्षाकृत कम-थ्रूपुट है, जिसमें प्रत्येक श्वसन रन लगभग 15-20 मिनट तक चलता है और प्रत्येक नमूने3 के लिए कोशिकाओं की अधिक मात्रा की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, फ्लोरेसेंस-आधारित श्वासमिति तकनीक ने काफी हद तक क्लार्क इलेक्ट्रोड को बदल दिया है और चयापचय और माइटोकॉन्ड्रियल अनुसंधान के क्षेत्र में एक लोकप्रिय तकनीक बन गई है।
यह प्रोटोकॉल एक उच्च-थ्रूपुट, उच्च-रिज़ॉल्यूशन, फ्लोरेसेंस-आधारित श्वासमिति तकनीक का वर्णन करता है जो जीवित कोशिकाओं के ओएक्सपीओएस और ग्लाइकोलाइटिक बायोएनर्जेटिक प्रोफाइल को गतिज रूप से मापता है। चूंकि OXPHOS की प्रक्रिया ऑक्सीजन की खपत करती है, इसलिए OXPHOS के लिए बायोएनर्जेटिकप्रोफ़ाइल समय के साथ ऑक्सीजन खपत दर (OCR) में परिवर्तन ों का मानचित्रण करके उत्पन्न होती है। इस तकनीक में, सेंसर कार्ट्रिज आस्तीन में दो फ्लोरोफोर एम्बेडेड होते हैं जो फाइबर ऑप्टिक बंडलों से जुड़े होते हैं जो प्रकाश उत्सर्जित करते हैं, फ्लोरोफोरे को उत्तेजित करते हैं। फ्लोरोफोरे उत्सर्जन में परिवर्तन को अत्यधिक संवेदनशील प्रतिदीप्ति सेंसर द्वारा मापा जाता है और फाइबर ऑप्टिक बंडल के माध्यम से ओसीआर रीडआउट 5 में परिवर्तित किया जाताहै। फ्लोरोफोरे ऑक्सीजन द्वारा बुझा दिया जाता है, इस प्रकार परख मीडिया में बाह्य ऑक्सीजन के स्तर के निर्धारण को सक्षम करता है, जिसे ऑक्सीजन फ्लक्स या ओसीआर के रूप में जाना जाता है। अन्य फ्लोरोफोरे एक पीएच सेंसर जांच है जो प्रोटॉन एफ्लक्स में परिवर्तन के प्रति संवेदनशील है, जिसे बाह्य अम्लीकरण दर (ईसीएआर) के माप में परिवर्तित किया जाता है। माप के दौरान, एम्बेडेड फ्लोरोफोरे के साथ फाइबर ऑप्टिक बंडलों को सेल मोनोलेयर से 200 μm तक कम किया जाता है, जिससे एक क्षणिक माइक्रो-चैंबर बनता है जो तेजी से, वास्तविक समय रीडिंग को सक्षम बनाता है। एक बार ऑक्सीजन या प्रोटॉन के स्तर में 10% परिवर्तन का पता चलने के बाद, सेंसर को ऊपर की ओर उठाया जाता है, जिससे मीडिया की एक बड़ी मात्रा को क्षणिक माइक्रो-चैंबर मीडिया के साथ मिश्रण करने की अनुमति मिलती है, जिससे ओसीआर और ईसीएआर मूल्यों को बेसलाइन पर वापस बहाल किया जाता है। प्रत्येक सेंसर कारतूस परख के दौरान प्रति अच्छी तरह से चार यौगिकों के अनुक्रमिक प्रशासन की अनुमति देने के लिए चार बंदरगाहों से लैस है। प्रत्येक बंदरगाह में यौगिकों के इंजेक्शन से पहले और बाद में माप एकत्र किए जा सकते हैं, जिससे कोशिकाओं की चयापचय स्थिति के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी का पता चलता है।
इन दो अलग-अलग चयापचय मार्गों से पूछताछ करने से विभिन्न रोगजनक उत्तेजनाओं के संपर्क में आने के बाद आरपीई की चयापचय स्थिति के बारे में महत्वपूर्ण खोजें हो सकती हैं, और इस प्रकार आरपीई 6,7,8 की चयापचय अखंडता को बहाल करने में दवाओं की प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। उच्च-थ्रूपुट श्वसनमिति के आगमन और विशिष्ट माइटोकॉन्ड्रियल अवरोधकों की उपलब्धता ने आरपीई के बायोएनर्जेटिक प्रोफाइल को परिभाषित करने और रोगअवस्थाओं के दौरान चयापचय और माइटोकॉन्ड्रिया में दोषों की पहचान करने में अधिक शोध को प्रेरित किया है 6,7,8,9,10,11,12,13 . उच्च-रिज़ॉल्यूशन रेस्पिरोमेट्री ने एएमडी और पीवीआर जैसे रेटिना पैथोलॉजी में आरपीई के चयापचय रीप्रोग्रामिंग की महत्वपूर्ण भूमिका पर प्रकाश डाला है। एएमडी और पीवीआर के रोगजनन में शामिल दो प्रमुख साइटोकिन्स विकास कारक-बीटा 2 (टीजीएफ2) और ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-अल्फा (टीएनएफ) को बदल रहे हैं। टीजीएफ2 द्वारा उपकला-मेसेनकाइमल संक्रमण (ईएमटी) का प्रेरण माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन, ओएक्सपीओएस दमन और आरपीई6 में ग्लाइकोलाइटिक क्षमता में प्रतिपूरक वृद्धि के साथ होता है। हाल ही में, प्रो-इंफ्लेमेटरी साइटोकिन, टीएनएफ, को बेसल ओएक्सपीएचओएस के एक महत्वपूर्ण अपरेगुलेशन को प्रेरित करने और एच-आरपीई 7 में ग्लाइकोलाइसिस को कम करने के लिए दिखाया गयाहै। डाइमिथाइल फ्यूमरेट के प्रशासन ने एच-आरपीई में टीएनएफ-प्रेरित सूजन को काफी हद तक दबा दिया और माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान और बेसल बायोएनर्जेटिक प्रोफाइल7 को बहाल किया। इन दो विकास कारकों से प्रेरित अलग-अलग चयापचय प्रोफाइल रेटिना रोगों में चयापचय रीप्रोग्रामिंग की भागीदारी के बारे में पेचीदा यांत्रिक प्रश्नों को उत्तेजित करते हैं। निम्नलिखित प्रोटोकॉल उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वसनमिति का उपयोग करके एच-आरपीई में ओएक्सपीएचओएस और ग्लाइकोलाइटिक बायोएनर्जेटिक प्रोफाइल का आकलन करने के चरणों का वर्णन करता है।
एच-आरपीई के उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वसनोमेट्री के लिए इस अनुकूलित प्रोटोकॉल में आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले एफसीसीपी के बजाय अनकपलर के रूप में बीएएम 15 का उपयोग शामिल है। जबकि आरपीई के उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वसनोमेट्री पर पिछले अध्ययनों ने एफसीसीपी 9,24 का उपयोग किया था, बीएएम 15 एफसीसीपी की तुलना में एच-आरपीई में अधिकतम श्वसन स्तर के अधिक मजबूत प्रेरण को प्रेरित करता प्रतीत होता है। जबकि एफसीसीपी और बीएएम 15 दोनों कोशिकाओं में उपयोग करने के लिए सुरक्षित हैं, बीएएम 15 को एफसीसीपी या कार्बोनिलसाइनाइड -3-क्लोरोफेनिलहाइड्राज़ोन (सीसीसीपी) 25 की तुलना में सामान्य कोशिकाओं में कम दुष्प्रभाव होने की सूचना है। केनवुड एट अल ने दिखाया कि बीएएम 15 प्लाज्मा झिल्ली क्षमता को प्रभावित किए बिना माइटोकॉन्ड्रिया को विध्रुवित करता है, इस प्रकार कम साइटोटॉक्सिसिटी26 पर एक निरंतर अधिकतम माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन दर को प्रेरित करता है। दूसरी ओर, एफसीसीपी माइटोकॉन्ड्रिया और प्लाज्मा झिल्ली दोनों को विध्रुवित करता है और उच्च साइटोटॉक्सिसिटी26 प्रदर्शित करता है।
प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम हैं, जिसमें यह सुनिश्चित करना शामिल है कि माइक्रोप्लेट के सभी प्रयोगात्मक कुओं में कोशिकाओं को आरपीई के एक कंफ्लुएंट, यहां तक कि और समरूप मोनोलेयर में ठीक से चढ़ाया जाता है। परिपक्व आरपीई ऊर्जा उत्पादन के लिए ओएक्सपीओएस पर अत्यधिक निर्भर हैं, और इस प्रकार कोशिकाओं को कम से कम 1 महीने के लिए परिपक्व होने की अनुमति दी जानी चाहिए ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि आरपीई परख के दौरान उचित बेसल और अधिकतम ओसीआर रीडिंग उत्पन्न करता है। उपकरण में रखने से पहले एक ह्यूमिडिफाइड ओवन (सीओ2 के बिना) में 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल कल्चर प्लेट को डी-गैसिंग करना सटीक ईसीएआर रीडिंग के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि सीओ2 परख मीडिया के पीएच को प्रभावित कर सकता है। परख से एक दिन पहले सेंसर कारतूस को हाइड्रेट करना याद रखना महत्वपूर्ण है ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि यह परख के दिन विश्वसनीय ओसीआर और ईसीएआर रीडिंग प्रदान करता है। इंजेक्शन की जाने वाली दवाओं को ठीक से पुनर्गठित करने और फ्रीज/पिघलने चक्रों को कम करने के लिए दीर्घकालिक भंडारण के लिए पुनर्गठित दवा स्टॉक को छोटी मात्रा में एलिकोट करने का ध्यान रखा जाना चाहिए। 10x दवा समाधान तैयार करना महत्वपूर्ण है जो संबंधित परख मीडिया (जैसे, माइटो स्ट्रेस टेस्ट के लिए मिटो स्ट्रेस टेस्ट परख मीडिया में पतला) में पतला है ताकि परख मीडिया से भरे प्रत्येक अच्छी तरह से दवा के इंजेक्शन से कमजोर पड़ने में कारक हो सके। प्रत्येक बाद की दवा इंजेक्शन के साथ प्रत्येक कुएं में अधिक मीडिया होता है, और इस प्रकार प्रत्येक इंजेक्शन के साथ लोड की जा रही दवा की मात्रा बढ़ जाती है, और प्रोटोकॉल में निर्दिष्ट मात्रा का पालन करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। सेंसर कारतूस की जांच करके प्रयोग के पूरा होने पर गुणवत्ता की जांच करना महत्वपूर्ण है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि कोई अवशिष्ट दवा स्पष्ट नहीं है और माइक्रोस्कोप के तहत सेल कल्चर प्लेट का अवलोकन करना यह सुनिश्चित करने के लिए कि कंफ्लुएंट और सजातीय सेल मोनोलेयर बना रहे।
इस प्रोटोकॉल में संशोधनों में बंदरगाहों में विभिन्न दवाओं को इंजेक्ट करना और यह निर्धारित करना शामिल है कि ये दवाएं ओसीआर और ईसीएआर रीडिंग को कैसे प्रभावित करती हैं। एक लोकप्रिय संशोधन सामान्य माइटो या ग्लाइकोलाइटिक स्ट्रेस टेस्ट दवाओं को इंजेक्ट करने से पहले पोर्ट ए के रूप में पसंद की एक प्रयोगात्मक दवा इंजेक्ट करना है। इस प्रकार का प्रोटोकॉल अंतर्दृष्टि प्रदान करता है कि पसंद की दवा का एक तीव्र इंजेक्शन बाद के ओएक्सपीएचओएस और ग्लाइकोलाइटिक मापदंडों को कैसे प्रभावित करता है। अन्य संशोधनों में विभिन्न सेल प्रकारों की जांच करना शामिल है; इसके लिए इष्टतम सीडिंग सेल घनत्व के प्रारंभिक समस्या निवारण और परख मीडिया के अनुकूलन की आवश्यकता होती है, यह सुनिश्चित करके कि बेसल रीडिंग ओसीआर के लिए 50-100 pmol / min और ECAR के लिए 10-20 mph / min तक होती है। इंजेक्शन वाली दवाओं की इष्टतम सांद्रता को दवाओं के क्रमिक कमजोर पड़ने के लिए ओसीआर और ईसीएआर प्रतिक्रियाओं को देखकर जांच किए गए प्रत्येक नए सेल प्रकार के लिए निर्धारित करने की आवश्यकता है।
प्रोटोकॉल की एक महत्वपूर्ण सीमा यह है कि सेल व्यवहार्यता समय के साथ कम हो जाती है, क्योंकि कोशिकाएं अपने सामान्य विकास मीडिया में सीओ2 इनक्यूबेटर में नहीं होती हैं, और इस प्रकार अधिकतम सेल व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए परख को 3-4 घंटे के भीतर पूरा किया जाना चाहिए। इसके अलावा, प्रत्येक कुएं में इंजेक्ट किए गए माइटोकॉन्ड्रियल विषाक्त पदार्थों के संपर्क में आने से समय के साथ सेल व्यवहार्यता कम हो सकती है। एक बार परख पूरी हो जाने के बाद, कोशिकाओं को ओसीआर और ईसीएआर रीडिंग को सामान्य करने के लिए प्रोटीन सामग्री के मूल्यांकन के लिए लाइस किया जाना चाहिए, और इस प्रकार बाद के आणविक जीव विज्ञान परख के लिए एक ही कोशिकाओं को काटा नहीं जा सकता है।
बायोएनर्जेटिक प्रोफाइलिंग के लिए सीहॉर्स के विकल्पों में ओरोबोरोस ऑक्सीग्राफ 2 के (ओ 2 के) 27, बारोफ्यूज़28,29 और रेसिफर (ल्यूसिड साइंटिफिक) 7 शामिल हैं। ओरोबोरोस ओ 2 के एक बंद दो-कक्ष श्वासरोमीटर है जो एस 1 क्लार्क-प्रकार पोलारोग्राफिक ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड का उपयोग करता है। जबकि ओरोबोरोस ओ 2 के वास्तविक समय चयापचय प्रवाह के अत्यधिक संवेदनशील माप पैदा करता है, डिवाइस श्रम-गहन है क्योंकि ऑपरेटर को प्रत्येक दवा30 को मैन्युअल रूप से इंजेक्ट करने की आवश्यकता होती है। BaroFuse एक नया मल्टीचैनल माइक्रोफ्लुइडिक छिड़काव प्रणाली है जो कई समानांतर छिड़काव प्रयोगों को सक्षम करने के लिए गैस दबाव का उपयोग करता है और ओसीआर को मापने के लिए ऑक्सीजन डिटेक्शन सिस्टम से जुड़ा हुआ है। इस प्रवाह संस्कृति प्रणाली का लाभ यह है कि ऊतक समारोह और व्यवहार्यता बनाए रखी जाती है, जैसा कि सीहॉर्स के विपरीत है जहां सेल व्यवहार्यता लंबे समय तक कम हो जाती है। रेसिफर ओसीआर को मापने के लिए अत्यधिक संवेदनशील ऑप्टिकल ऑक्सीजन सेंसर का उपयोग करता है, जबकि कोशिकाएं इनक्यूबेटर में 96-वेल प्लेट में होती हैं, इसलिए कई हफ्तों से महीनों तक निरंतर ओसीआर माप को सक्षम करती हैं। विशेष रूप से, ये उपकरण ईसीएआर को नहीं मापते हैं, और इस प्रकार सीहॉर्स को ओएक्सपीएचओएस और ग्लाइकोलाइसिस दोनों के एक साथ अन्वेषण का लाभ है।
ओएक्सपीओएस और ग्लाइकोलाइसिस के वास्तविक समय बायोएनर्जेटिक प्रोफाइल से पूछताछ करना आरपीई स्वास्थ्य और कार्य को चिह्नित करने में एक महत्वपूर्ण कारक के रूप में उभर रहा है। उच्च-रिज़ॉल्यूशन रेस्पिरोमेट्री सामान्य और रोगग्रस्त आरपीई की चयापचय स्थिति की तुलना करने का एक कुशल साधन सक्षम बनाता है, इस प्रकार एएमडी और पीवीआर जैसे रेटिना रोगों के लिए दवा प्रभावकारिता की जांच के नए रास्ते खोलता है। आरपीई पर उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वासमिति के लिए भविष्य के निर्देशों में ट्रांसवेल फिल्टर पर उगाए गए अत्यधिक ध्रुवीकृत आरपीई मोनोलेयर के लिए बायोएनर्जेटिक प्रोफाइल की जांच करने के लिए एक प्रोटोकॉल का अनुकूलन शामिल है। कैल्टन एट अल (2016) ने ट्रांसवेल फिल्टर31 पर उगाए गए ध्रुवीकृत आरपीई मोनोलेयर के त्रिकोणीय खंड को काटकर इसे सफलतापूर्वक हासिल किया। कार्यप्रणाली के आगे विस्तार में प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न आरपीई (आईपीएससी-आरपीई) के बायोएनर्जेटिक प्रोफाइल की जांच करना शामिलहै, जो विभिन्न रेटिना अपक्षयी स्थितियों वाले रोगियों से अलग है। एएमडी और पीवीआर में शामिल रोगजनक साइटोकिन्स आरपीई चयापचय की गतिशील प्रकृति को कैसे प्रभावित करते हैं, इसकी खोज चयापचय कमजोरियों को प्रकट कर सकती है जो नए दवा योग्य लक्ष्यों की पहचान को सूचित कर सकती है।
The authors have nothing to disclose.
इस अध्ययन को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था: द फाइट फॉर साइट लियोनार्ड और रॉबर्ट वेनट्रॉब पोस्टडॉक्टरल फैलोशिप (डी.वाई.एस.); मैकुलर अपघटन अनुसंधान में ब्राइटफोकस फाउंडेशन पोस्टडॉक्टरल फैलोशिप प्रोग्राम (एम 2021010 एफ, डीवाईएस); रक्षा विभाग, स्पाइनल विजन रिसर्च प्रोग्राम पुरस्कार संख्या वीआर 180132 (एमएस-जी और एलएके) के तहत; राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के राष्ट्रीय नेत्र संस्थान पुरस्कार संख्या R01EY027739 (L.A.K.) के तहत। इस शोध के समर्थन के लिए ब्राइटफोकस फाउंडेशन के एक कार्यक्रम मैकुलर अपघटन अनुसंधान एम 2021010 एफ के दाताओं को पावती दी जाती है। Biorender.com के साथ योजनाबद्ध बनाए गए थे
2-Deoxy-D-glucose | Sigma | D8375-5G | Reconstituted in the Glycolytic Assay Media from its powder form and used in the Glycolytic Stress Test (Port C injection) |
96 Well Non-Treated Plate, 5/Pack, Sterile | VWR | 229597 | BCA Assay 96-well plate |
Antimycin A from Streptomyces sp. | Sigma | A8674-25MG | Inhibitor of Complex III of the electron transport chain (part of the Port C drug injection together with rotenone) |
BAM15 | Sigma | SML1760-5MG | Uncoupling agent used for the Mito Stress Test (Port B injection) |
BCA Assay | ThermoFisher | 23225 | To determine total protein content in each well |
Calibrant Solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | Solution used to calibrate the probes of the sensor cartridge |
Cell Lysis buffer 10x | Cell Signaling Technologies | 9803S | Dilute 10x Cell Lysis Buffer to a 1x solution using deionized water and add 1 mM PMSF before use |
D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8644-100ML | Supplement to be added to the Mito Stress Test assay media and also used in the Glycolytic Stress Test (Port A injection) |
DMSO, Cell culture grade | Sigma-aldrich | D4540-100ML | For reconstituting all mitochondrial drugs except for 2DG |
FCCP | Sigma | C2920-10MG | Uncoupling agent used for the Mito Stress Test (Port B injection) |
GlutaMAX | Gibco | 35050061 | Supplement to be added to the assay media for both the Mito and Glycolytic Stress Tests |
HEPES solution | Sigma | H0887-100ML | Supplement to be added to the assay media for both the Mito and Glycolytic Stress Tests |
H-RPE – Human Retinal Pigment Epithelial Cells | Lonza | 194987 | Primary human fetal RPE cells |
Oligomycin – CAS 1404-19-9 – Calbiochem | Sigma | 495455-10MG | ATP synthase inhibitor used for the Mito Stress Test (Port A injection) and Glycolytic Stress Test (Port B injection) |
Parafilm | Bemis | PM996 | To seal the plate once the cells are lysed to prevent evaporation in the freezer |
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Protease Inhibitor | Gold Biotechnology Inc | 50-153-2823 | Used at 1 mM for the 1x Cell Lysis Buffer solution |
ReagentPack Subculture Reagents, 100 mL | Lonza | CC-5034 | Passaging reagents for primary human fetal RPE cells. Each kit contains 100 mL Trypsin/EDTA, Trypsin Neutralizing Solution, HEPES Buffered Saline |
Rotenone | Sigma | R8875-1G | Inhibitor of Complex I of the electron transport chain (part of the Port C drug injection together with antimycin A) |
RtEGM Retinal Pigment Epithelial Cell Growth Medium BulletKit – RtEBMTM Basal Medium (00195406) and RtEGMTM SingleQuots Supplements (00195407) | Lonza | 195409 | Media for primary human fetal RPE cells |
Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | High-Resolution Respirometry Instrument | |
Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | This contains the 96-well Seahorse Cell Culture Microplate, the sensor cartridge and the calibrant solution |
Sodium pyruvate solution | Sigma | S8636-100ML | Supplement to be added to the Mito Stress Test assay media |
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 50 mL process volume, 0.22 µm pore size | Millipore-Sigma | SCGP00525 | Tube top filter unit for sterile filtration of the assay media |
Synergy H1 Plate Reader | BioTek | Plate Reader for measuring absorbance at 562 nm for the BCA assay | |
XF base medium without phenol red | Agilent | 103335-100 | Base media for running the Seahorse assay |