Virüs Yayılımı ve Hücre Bazlı Kolorimetrik Miktar Tayini
Summary
Mevcut protokol, Zika virüsünün (ZIKV) Vero Afrika yeşil maymun böbrek hücrelerinde yayılımını ve 24 oyuklu ve 96 oyuklu (yüksek verimli) formatlarda hücre bazlı kolorimetrik immüno-tespit yöntemleri kullanılarak ZIKV’nin miktar tayinini açıklamaktadır.
Abstract
Zika virüsü (ZIKV), Flavivirus cinsine ait sivrisinek kaynaklı bir virüstür. ZIKV enfeksiyonu, yetişkinlerde konjenital beyin anormallikleri ve potansiyel olarak Guillain-Barré sendromu ile ilişkilendirilmiştir. Hastalık mekanizmalarını anlamak için ZIKV ile ilgili araştırmalar, aşı ve tedavi geliştirmeyi kolaylaştırmak için önemlidir. Virüsleri ölçme yöntemi, viroloji alanında çok önemli ve temeldir. Odak oluşturma testi (FFA), viral antijeni antikorlarla tespit eden ve peroksidaz immün boyama tekniğini kullanarak hücrelerin enfeksiyon odaklarını tanımlayan bir virüs miktar tayini testidir. Mevcut çalışma, hem 24 kuyulu hem de 96 kuyulu (yüksek verimli) formatları kullanarak virüs yayılım ve miktar tayini protokolünü açıklamaktadır. Diğer benzer çalışmalarla karşılaştırıldığında, bu protokol, bu testin diğer virüsler için kullanımını genişletmek için bir kılavuz görevi görebilecek odak boyutu optimizasyonunu daha ayrıntılı olarak tanımlamıştır. İlk olarak, 3 gün boyunca Vero hücrelerinde ZIKV yayılımı gerçekleştirilir. ZIKV içeren kültür süpernatanı, FFA kullanılarak hasat edilir ve miktar tayini yapılır. Kısaca virüs kültürü Vero hücrelerine aşılanır ve 2-3 gün inkübe edilir. Odak oluşumu daha sonra hücre fiksasyonu, geçirgenleştirme, blokaj, antikor bağlanması ve peroksidaz substratı ile inkübasyon dahil olmak üzere optimize edilmiş boyama işlemlerinden sonra belirlenir. Boyanmış virüs odakları, bir stereo mikroskop (24 oyuklu formatta manuel sayım) veya yazılım analizörü (96 oyuklu formatta otomatik sayım) kullanılarak görselleştirilir. FFA, tekrarlanabilir, nispeten hızlı sonuçlar (3-4 gün) sağlar ve plak oluşturmayan virüsler de dahil olmak üzere farklı virüsler için kullanılmaya uygundur. Daha sonra, bu protokol ZIKV enfeksiyonunun incelenmesi için yararlıdır ve klinik olarak önemli diğer virüsleri tespit etmek için kullanılabilir.
Introduction
Zika virüsü (ZIKV) enfeksiyonu, sivrisinek kaynaklı viral bir hastalıktır. ZIKV’nin ilk izolasyonu 1947’de Uganda’daydı 1,2; 1947’den 2007’ye kadar ihmal edildi, çünkü klinik semptomlar en sık asemptomatik ve kendi kendini sınırlayan ateşli hastalık ile karakterizedir. 2007 yılında, Zika salgını Yap adalarındabaşladı 3,4, ardından Pasifik bölgelerinde (Fransız Polinezyası, Paskalya Adası, Cook Adaları ve Yeni Kaledonya) 2013’ten 2014’e kadar daha büyük salgınlar 5,6,7,8, burada ciddi nörolojik komplikasyon Guillain-Barré sendromu (GBS) yetişkinlerde ilk kez bildirildi9. 2015 ve 2016 yıllarında, ilk yaygın ZIKV salgını, 2013 gibi erken bir tarihte Brezilya’da ZIKV’nin Asya genotipinin ortaya çıkmasından sonra Amerika’yı kasıp kavurdu10. Bu salgın sırasında, yeni doğan bebeklerde 440.000 ila 1.3 milyon mikrosefali ve diğer nörolojik bozukluklar bildirilmiştir11. Şu anda ZIKV enfeksiyonu için spesifik bir tedavi veya tedavi yoktur; bu nedenle, özellikle hamilelik sırasında enfeksiyonları önleyebilen ZIKV aşılarına acil bir tıbbi ihtiyaç vardır.
Virüs ölçümü, bir numunede bulunan virüslerin sayısını belirleme işlemidir. Araştırmada önemli bir rol oynar ve akademik laboratuvarlar tıp ve yaşam bilimleri gibi birçok alanı içerir. Bu süreç, viral aşıların, rekombinant proteinlerin, viral antijenlerin veya antiviral ajanların üretimi gibi ticari sektörlerde de önemlidir. Virüs ölçümü için birçok yöntem veya tahlil kullanılabilir12. Yöntemlerin veya tahlillerin seçimi normalde virüs özelliklerine, istenen doğruluk düzeyine ve deney veya araştırmanın doğasına bağlıdır. Genel olarak, virüsleri ölçme yöntemleri iki kategoriye ayrılabilir: viral nükleik asidin (DNA veya RNA) varlığını tespit eden moleküler testler ve in vitro12’de virüs enfektivitesini ölçen testler. Kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR, DNA için) veya kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR, RNA için)13 ve dijital damlacık PCR14 , belirli bir numunedeki viral nükleik asidi ölçmek için kullanılan yaygın moleküler tekniklerin örnekleridir15. Bununla birlikte, bu son derece hassas moleküler teknikler, canlı ve cansız virüsler arasında ayrım yapamaz15. Bu nedenle, hücreler üzerindeki virüs enfektivitesi gibi biyolojik özellikler hakkında bilgi gerektiren araştırmalar, yukarıda belirtilen moleküler teknikler kullanılarak tamamlanamaz; Canlı virüslerin varlığını ölçebilen ve belirleyebilen tahlillere ihtiyaç vardır. Virüs enfektivitesini ölçen testler arasında plak oluşturma testi (PFA), %50 doku kültürü enfeksiyöz dozu (TCID50), floresan odak testi ve transmisyon elektron mikroskobu (TEM)12 bulunur.
1952’de Renato Dulbecco tarafından geliştirilen PFA, ZIKV16 da dahil olmak üzere virüs titrasyonu için en yaygın kullanılan yöntemlerden biridir. Enfeksiyöz litik viryonlar için viral konsantrasyonları doğrudan belirlemek için kullanılır. Yöntem, bir litik virüsün, viral enfeksiyondan sonra aşılanmış bir hücre tek tabakasında sitopatik etkiler (CPE’ler; hücre ölümü veya plaklar, enfekte olmamış hücrelerle çevrili bir enfeksiyon alanı) üretme yeteneğine dayanmaktadır. Bununla birlikte, tahlilin faydasını etkileyen birkaç dezavantajı vardır. Test zaman alıcıdır (virüslere bağlı olarak yaklaşık 7-10 gün sürer), CPE’ye bağımlıdır ve hatalara eğilimlidir. Bu çalışmada, 24 oyuklu plaka ve 96 oyuklu plaka formatlarında ZIKV’yi tespit etmek ve ölçmek için bir immünokolorimetrik teknik olan odak oluşturma testi (FFA) bildirilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Virüs titresini belirlemek için birkaç test vardır; PFA, tek tek plakların veya odakların ayırt edilmesine izin vermek için virüs aşısının seyreltildiği FFA ile benzer bir virüs kantitasyon protokolüne sahiptir. Boyamadan sonra, her plak veya odak, aşılamada19 tek bir enfeksiyöz partikülü gösterir. PFA, hücre lizizi veya ölümünün neden olduğu plak oluşumunu görselleştirmek için kristal viyole ile boyanır. Bu nedenle, PFA, virüsün CPE’lere neden olması için daha…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma, Malezya Yüksek Öğretim Bakanlığı’ndan Uzun Vadeli Araştırma Hibe Programı (LRGS MRUN Faz 1: LRGS MRUN/F1/01/2018) kapsamında destek almış ve Yüksek Kurum Mükemmeliyet Merkezi (HICoE) programı (MO002-2019) için fon sağlamıştır. Bu çalışmada odak oluşturma testi için boyamanın iş akışını gösteren Şekil 3, BioRender.com (2022) tarafından “DAB İmmünohistokimya” dan uyarlanmıştır. https://app.biorender.com/biorender-templates/t-5f3edb2eb20ace00af8faed9-dab-immunohistochemistry’dan alındı.
Materials
| 0.22 µm Polyethersulfone syringe filter | Sartorius | S6534-FMOSK | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Nest | 615601 | |
| 10 mL sterile serological pipette | Labserv | 14955156 | |
| 1x Dulbecco’s phosphate-buffered saline (dPBS) | Gibco | 14190-136 | |
| 2.0 mL Screw cap tube | Axygen | SCT-200-SS-C-S | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 25 mL Sterile serological pipettes | Labserv | 14955157 | |
| 3,3'Diaminobenzidine (DAB) peroxidase substrate | Thermo Scientific | 34065 | |
| 37 °C incubator with 5% CO2 | Sanyo | MCO-18AIC | |
| 5 mL sterile serological pipette | Labserv | 14955155 | |
| 50 mL centrifuge tube | Falcon | LAB352070 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Corning | 430725U | |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | |
| Anti-flavivirus monoclonal antibody, 4G2 (clone D1-4G2-4-15) | MilliporeSigma | MAB10216 | |
| Autoclaved 20x Phosphate buffered saline (PBS) | N/A | N/A | 22.8 g of 8 mM Na2HPO4, 4.0 g of 1.5 mM KH2PO4, 160 g of 0.14 M NaCl, 4.0 g of 2.7 mM KCl, 1 L of MilliQ H2O |
| Biological safety cabinet, Class II | Holten | HB2448 | |
| CTL S6 Universal ELISpot/FluoroSpot Analyzer | ImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL) | CTL-S6UNV12 | Commercial software analyzer |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12800-017 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen | SFBS | |
| Goat anti-mouse IgG secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP) | MilliporeSigma | 12-349 | |
| Hemacytometer | Laboroptik LTD | Neubauer improved | |
| IGEPAL CA-630 detergent | Sigma-Aldrich | I8896 | Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanolIGEPAL |
| Inverted microscope | ZEISS | TELAVAL 31 | |
| Laboratory rocker | FINEPCR | CR300 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Low viscosity carboxymethyl cellulose (CMC) | Sigma-Aldrich | C5678 | |
| Multichannel micropipette (10 – 100 µL) | Eppendorf | 3125000036 | |
| Multichannel micropipette (30 – 300 µL) | Eppendorf | 3125000052 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Single channel pipettes (10 – 100 µL) | Eppendorf | 3123000047 | |
| Single channel pipettes (100 – 1000 µL) | Eppendorf | 3123000063 | |
| Single channel pipettes (20 – 200 µL) | Eppendorf | 3123000055 | |
| Skim milk | Sunlac Low Fat | N/A | Prepare 3% Skim milk in 1x PBS for blocking stage in staining |
| Sodium Hypochlorite | Clorox | N/A | To disinfect any discarded infectious liquid waste from flasks/plates |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Syringe disposable, Luer Lock, 10 mL with 21 G Needle | Terumo | SS10L21G | |
| Vero African green monkey kidney cells | – | ECACC 88020401 | Received from collaborator. However, Vero cells obtained from other suppliers should be able to be used with some optimization. |
Riferimenti
- Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), 509-520 (1952).
- Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), (1952).
- Duffy, M. R., et al. Zika virus outbreak on Yap Island, Federated States of Micronesia. The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2536-2543 (2009).
- Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area. Clinical Microbiology and Infection. 20 (10), O595-O596 (2014).
- Cao-Lormeau, V. -. M., et al. Zika virus, French polynesia, South pacific, 2013. Emerging Infectious Diseases. 20 (6), 1085-1086 (2014).
- Dupont-Rouzeyrol, M., et al. Co-infection with Zika and dengue viruses in 2 patients, New Caledonia, 2014. Emerging Infectious Diseases. 21 (2), 381-382 (2015).
- Roth, A., et al. Concurrent outbreaks of dengue, chikungunya and Zika virus infections-an unprecedented epidemic wave of mosquito-borne viruses in the Pacific 2012-2014. Euro Surveillance. 19 (41), 20929 (2014).
- Tognarelli, J., et al. A report on the outbreak of Zika virus on Easter Island, South Pacific, 2014. Archives of Virology. 161 (3), 665-668 (2016).
- Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome-case report, French Polynesia, December 2013. Euro Surveillance. 19 (9), 20720 (2014).
- Faria, N. R., et al. Zika virus in the Americas: early epidemiological and genetic findings. Science. 352 (6283), 345-349 (2016).
- Rapid risk assessment: Zika virus epidemic in the Americas: potential association with microcephaly and Guillain-Barré syndrome – 4th update. European Centre for Disease Prevention and Control Available from: https://www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/rapid-risk-assessment-zika-virus-epidemic-americas-potential-association (2015)
- Payne, S. Methods to study viruses. Viruses. , 37-52 (2017).
- Bustin, S. A., Mueller, R. Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis. Clinical Science. 109 (4), 365-379 (2005).
- Sedlak, R. H., Jerome, K. R. Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 75 (1), 1-4 (2013).
- Bae, H. -. G., Nitsche, A., Teichmann, A., Biel, S. S., Niedrig, M. Detection of yellow fever virus: a comparison of quantitative real-time PCR and plaque assay. Journal of Virological Methods. 110 (2), 185-191 (2003).
- Dulbecco, R. Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 38 (8), 747-752 (1952).
- Nahapetian, A. T., Thomas, J. N., Thilly, W. G. Optimization of environment for high density Vero cell culture: effect of dissolved oxygen and nutrient supply on cell growth and changes in metabolites. Journal of Cell Science. 81, 65-103 (1986).
- Agbulos, D. S., Barelli, L., Giordano, B. V., Hunter, F. F. Zika virus: quantification, propagation, detection, and storage. Current Protocols in Microbiology. 43, (2016).
- Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Current Protocols in Microbiology. 31, (2013).
- Bolívar-Marin, S., Bosch, I., Narváez, C. F. Combination of the focus-forming assay and digital automated imaging analysis for the detection of dengue and Zika viral loads in cultures and acute disease. Journal of Tropical Medicine. 2022, 2177183 (2022).
- Dangsagul, W., et al. Zika virus isolation, propagation, and quantification using multiple methods. PLoS One. 16 (7), e0255314 (2021).
- Brien, J. D., et al. Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3. Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).
- Lazear, H. M., et al. A mouse model of Zika virus pathogenesis. Cell Host & Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).
- Miner, J. J., et al. Zika virus infection during pregnancy in mice causes placental damage and fetal demise. Cell. 165 (5), 1081-1091 (2016).
- Kang, W., Shin, E. -. C. Colorimetric focus-forming assay with automated focus counting by image analysis for quantification of infectious hepatitis C virions. PLoS One. 7 (8), e43960 (2012).
- Brien, J. D., et al. Isolation and quantification of Zika virus from multiple organs in a mouse. Journal of VIsualized Experiments. (150), e59632 (2019).
- Payne, A. F., Binduga-Gajewska, I., Kauffman, E. B., Kramer, L. D. Quantitation of flaviviruses by fluorescent focus assay. Journal of Virological Methods. 134 (1-2), 183-189 (2006).
- Moser, L. A., et al. Growth and adaptation of Zika virus in mammalian and mosquito cells. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (11), e0006880 (2018).
- Ishimine, T., Tadano, M., Fukunaga, T., Okuno, Y. An improved micromethod for infectivity assays and neutralization tests of dengue viruses. Biken Journal. 30 (2), 39-44 (1987).
- Leiva, S., et al. Application of quantitative immunofluorescence assays to analyze the expression of cell contact proteins during Zika virus infections. Virus Research. 304, 198544 (2021).
- Lee, E. M., Titus, S. A., Xu, M., Tang, H., Zheng, W. High-throughput Zika viral titer assay for rapid screening of antiviral drugs. ASSAY and Drug Development Technologies. 17 (3), 128-139 (2019).
