Virusforplantning og cellebasert kolorimetrisk kvantifisering
Summary
Den foreliggende protokollen beskriver forplantningen av Zika-virus (ZIKV) i Vero afrikanske grønne ape nyreceller og kvantifisering av ZIKV ved hjelp av cellebaserte kolorimetriske immunodeteksjonsmetoder i 24-brønn og 96-brønn (høy gjennomstrømning) formater.
Abstract
Zikavirus (ZIKV) er et myggbårent virus som tilhører slekten Flavivirus. ZIKV-infeksjon har vært assosiert med medfødte hjerneavvik og potensielt Guillain-Barré syndrom hos voksne. Forskning på ZIKV for å forstå sykdomsmekanismene er viktig for å legge til rette for vaksine- og behandlingsutvikling. Metoden for å kvantifisere virus er avgjørende og grunnleggende innen virologi. Fokusdannende analyse (FFA) er en viruskvantifiseringsanalyse som oppdager virusantigenet med antistoffer og identifiserer infeksjonsfokuset til celler ved hjelp av peroksidase-immunfargingsteknikken. Den nåværende studien beskriver virusutbredelsen og kvantifiseringsprotokollen ved bruk av både 24-brønn og 96-brønn (høy gjennomstrømning) formater. Sammenlignet med andre lignende studier har denne protokollen videre beskrevet optimalisering av foci-størrelse, som kan tjene som en veiledning for å utvide bruken av denne analysen for andre virus. For det første utføres ZIKV-forplantning i Vero-celler i 3 dager. Dyrkningssupernatanten som inneholder ZIKV høstes og kvantifiseres ved hjelp av FFA. Kort fortalt blir viruskulturen inokulert på Vero-celler og inkubert i 2-3 dager. Foci-dannelse bestemmes deretter etter optimaliserte fargeprosesser, inkludert cellefiksering, permeabilisering, blokkering, antistoffbinding og inkubasjon med peroksidasesubstrat. De fargede virusfociene visualiseres ved hjelp av et stereomikroskop (manuell telling i 24-brønnformat) eller programvareanalysator (automatisert telling i 96-brønnformat). FFA gir reproduserbare, relativt raske resultater (3-4 dager) og er egnet til bruk for forskjellige virus, inkludert ikke-plakkdannende virus. Deretter er denne protokollen nyttig for studiet av ZIKV-infeksjon og kan brukes til å oppdage andre klinisk viktige virus.
Introduction
Zikavirus (ZIKV) infeksjon er en fremvoksende myggbåren virussykdom. Den første isolasjonen av ZIKV var i Uganda i 1947 1,2; Den forble neglisjert fra 1947 til 2007, da de kliniske symptomene oftest er asymptomatiske og preget av selvbegrensende febersykdom. I 2007 begynte Zika-epidemien på Yap-øyene 3,4, etterfulgt av større epidemier i Stillehavsregionene (Fransk Polynesia, Påskeøya, Cookøyene og Ny-Caledonia) fra 2013 til 2014 5,6,7,8, hvor den alvorlige nevrologiske komplikasjonen Guillain-Barré syndrom (GBS) ble rapportert hos voksne for første gang9. I løpet av 2015 og 2016 feide den første utbredte ZIKV-epidemien over Amerika etter fremveksten av den asiatiske genotypen av ZIKV i Brasil allerede i 201310. Under dette utbruddet ble det rapportert 440 000 til 1,3 millioner tilfeller av mikrocefali og andre nevrologiske lidelser hos nyfødte barn11. Det er for tiden ingen spesifikk kur eller behandling for ZIKV-infeksjon; Derfor er det et presserende medisinsk behov for ZIKV-vaksiner som kan forhindre infeksjoner, spesielt under graviditet.
Viruskvantifisering er en prosess for å bestemme antall virus som er tilstede i en prøve. Det spiller en viktig rolle i forskning, og akademiske laboratorier involverer mange felt, for eksempel medisin og biovitenskap. Denne prosessen er også viktig i kommersielle sektorer, for eksempel produksjon av virale vaksiner, rekombinante proteiner, virale antigener eller antivirale midler. Mange metoder eller analyser kan brukes til viruskvantifisering12. Valg av metoder eller analyser avhenger normalt av virusets egenskaper, ønsket nøyaktighetsnivå og arten av eksperimentet eller forskningen. Generelt kan metoder for kvantifisering av virus deles inn i to kategorier: molekylære analyser som oppdager tilstedeværelsen av viral nukleinsyre (DNA eller RNA) og analyser som måler virussmittsomhet in vitro12. Kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR, for DNA) eller kvantitativ revers transkripsjon polymerasekjedereaksjon (qRT-PCR, for RNA)13 og digital dråpe PCR14 er eksempler på vanlige molekylære teknikker som brukes til å kvantifisere virusnukleinsyren i en gitt prøve15. Imidlertid kan disse svært følsomme molekylære teknikkene ikke skille mellom levedyktige og ikke-levedyktige virus15. Derfor kan forskning som krever informasjon om biologiske egenskaper, som virussmittsomhet på celler, ikke fullføres ved hjelp av ovennevnte molekylære teknikker; Analyser som kan måle og bestemme tilstedeværelsen av levedyktige virus er nødvendig. Analyser som måler virussmittsomhet inkluderer plakkdannende analyse (PFA), 50% vevskultur infeksiøs dose (TCID50), fluorescerende fokusanalyse og transmisjonselektronmikroskopi (TEM) 12.
PFA, utviklet av Renato Dulbecco i 1952, er en av de mest brukte metodene for virustitrering, inkludert for ZIKV16. Det brukes til direkte å bestemme virale konsentrasjoner for smittsomme lytiske virioner. Metoden er basert på et lytisk viruss evne til å produsere cytopatiske effekter (CPE, soner av celledød eller plakk, et infeksjonsområde omgitt av uinfiserte celler) i et inokulert cellemonolag etter virusinfeksjon. Det er imidlertid flere ulemper med analysen som påvirker verktøyet. Analysen er tidkrevende (tar omtrent 7-10 dager, avhengig av virus), CPE-avhengig og utsatt for feil. I denne studien rapporterer vi en immunokolorimetrisk teknikk, fokusdannende analyse (FFA), for å oppdage og kvantifisere ZIKV i 24-brønns plate- og 96-brønnplateformater.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det er flere analyser for å bestemme virustiter; PFA har en lignende viruskvantifiseringsprotokoll som FFA, der virusinokulumet fortynnes for å tillate individuelle plakk eller foci å skilles. Etter farging indikerer hver plakk eller foci en enkelt smittsom partikkel i inokulum19. PFA er farget med krystallfiolett for å visualisere plakkdannelse forårsaket av cellelyse eller død. Derfor er PFA mer tidkrevende, da det krever lengre tid for viruset å forårsake CPE, og det er bare begrenset t…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen mottok støtte fra departementet for høyere utdanning Malaysia under Long-Term Research Grant Scheme (LRGS MRUN fase 1: LRGS MRUN / F1/01/2018) og finansiering for Higher Institution Centre of Excellence (HICoE) -programmet (MO002-2019). Figur 3 i denne studien som viser arbeidsflyten for farging for focidannende analyse er tilpasset fra “DAB Immunohistochemistry” av BioRender.com (2022). Hentet fra https://app.biorender.com/biorender-templates/t-5f3edb2eb20ace00af8faed9-dab-immunohistochemistry.
Materials
| 0.22 µm Polyethersulfone syringe filter | Sartorius | S6534-FMOSK | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Nest | 615601 | |
| 10 mL sterile serological pipette | Labserv | 14955156 | |
| 1x Dulbecco’s phosphate-buffered saline (dPBS) | Gibco | 14190-136 | |
| 2.0 mL Screw cap tube | Axygen | SCT-200-SS-C-S | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 25 mL Sterile serological pipettes | Labserv | 14955157 | |
| 3,3'Diaminobenzidine (DAB) peroxidase substrate | Thermo Scientific | 34065 | |
| 37 °C incubator with 5% CO2 | Sanyo | MCO-18AIC | |
| 5 mL sterile serological pipette | Labserv | 14955155 | |
| 50 mL centrifuge tube | Falcon | LAB352070 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Corning | 430725U | |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | |
| Anti-flavivirus monoclonal antibody, 4G2 (clone D1-4G2-4-15) | MilliporeSigma | MAB10216 | |
| Autoclaved 20x Phosphate buffered saline (PBS) | N/A | N/A | 22.8 g of 8 mM Na2HPO4, 4.0 g of 1.5 mM KH2PO4, 160 g of 0.14 M NaCl, 4.0 g of 2.7 mM KCl, 1 L of MilliQ H2O |
| Biological safety cabinet, Class II | Holten | HB2448 | |
| CTL S6 Universal ELISpot/FluoroSpot Analyzer | ImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL) | CTL-S6UNV12 | Commercial software analyzer |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12800-017 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen | SFBS | |
| Goat anti-mouse IgG secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP) | MilliporeSigma | 12-349 | |
| Hemacytometer | Laboroptik LTD | Neubauer improved | |
| IGEPAL CA-630 detergent | Sigma-Aldrich | I8896 | Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanolIGEPAL |
| Inverted microscope | ZEISS | TELAVAL 31 | |
| Laboratory rocker | FINEPCR | CR300 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Low viscosity carboxymethyl cellulose (CMC) | Sigma-Aldrich | C5678 | |
| Multichannel micropipette (10 – 100 µL) | Eppendorf | 3125000036 | |
| Multichannel micropipette (30 – 300 µL) | Eppendorf | 3125000052 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Single channel pipettes (10 – 100 µL) | Eppendorf | 3123000047 | |
| Single channel pipettes (100 – 1000 µL) | Eppendorf | 3123000063 | |
| Single channel pipettes (20 – 200 µL) | Eppendorf | 3123000055 | |
| Skim milk | Sunlac Low Fat | N/A | Prepare 3% Skim milk in 1x PBS for blocking stage in staining |
| Sodium Hypochlorite | Clorox | N/A | To disinfect any discarded infectious liquid waste from flasks/plates |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Syringe disposable, Luer Lock, 10 mL with 21 G Needle | Terumo | SS10L21G | |
| Vero African green monkey kidney cells | – | ECACC 88020401 | Received from collaborator. However, Vero cells obtained from other suppliers should be able to be used with some optimization. |
Riferimenti
- Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), 509-520 (1952).
- Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), (1952).
- Duffy, M. R., et al. Zika virus outbreak on Yap Island, Federated States of Micronesia. The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2536-2543 (2009).
- Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area. Clinical Microbiology and Infection. 20 (10), O595-O596 (2014).
- Cao-Lormeau, V. -. M., et al. Zika virus, French polynesia, South pacific, 2013. Emerging Infectious Diseases. 20 (6), 1085-1086 (2014).
- Dupont-Rouzeyrol, M., et al. Co-infection with Zika and dengue viruses in 2 patients, New Caledonia, 2014. Emerging Infectious Diseases. 21 (2), 381-382 (2015).
- Roth, A., et al. Concurrent outbreaks of dengue, chikungunya and Zika virus infections-an unprecedented epidemic wave of mosquito-borne viruses in the Pacific 2012-2014. Euro Surveillance. 19 (41), 20929 (2014).
- Tognarelli, J., et al. A report on the outbreak of Zika virus on Easter Island, South Pacific, 2014. Archives of Virology. 161 (3), 665-668 (2016).
- Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome-case report, French Polynesia, December 2013. Euro Surveillance. 19 (9), 20720 (2014).
- Faria, N. R., et al. Zika virus in the Americas: early epidemiological and genetic findings. Science. 352 (6283), 345-349 (2016).
- Rapid risk assessment: Zika virus epidemic in the Americas: potential association with microcephaly and Guillain-Barré syndrome – 4th update. European Centre for Disease Prevention and Control Available from: https://www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/rapid-risk-assessment-zika-virus-epidemic-americas-potential-association (2015)
- Payne, S. Methods to study viruses. Viruses. , 37-52 (2017).
- Bustin, S. A., Mueller, R. Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis. Clinical Science. 109 (4), 365-379 (2005).
- Sedlak, R. H., Jerome, K. R. Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 75 (1), 1-4 (2013).
- Bae, H. -. G., Nitsche, A., Teichmann, A., Biel, S. S., Niedrig, M. Detection of yellow fever virus: a comparison of quantitative real-time PCR and plaque assay. Journal of Virological Methods. 110 (2), 185-191 (2003).
- Dulbecco, R. Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 38 (8), 747-752 (1952).
- Nahapetian, A. T., Thomas, J. N., Thilly, W. G. Optimization of environment for high density Vero cell culture: effect of dissolved oxygen and nutrient supply on cell growth and changes in metabolites. Journal of Cell Science. 81, 65-103 (1986).
- Agbulos, D. S., Barelli, L., Giordano, B. V., Hunter, F. F. Zika virus: quantification, propagation, detection, and storage. Current Protocols in Microbiology. 43, (2016).
- Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Current Protocols in Microbiology. 31, (2013).
- Bolívar-Marin, S., Bosch, I., Narváez, C. F. Combination of the focus-forming assay and digital automated imaging analysis for the detection of dengue and Zika viral loads in cultures and acute disease. Journal of Tropical Medicine. 2022, 2177183 (2022).
- Dangsagul, W., et al. Zika virus isolation, propagation, and quantification using multiple methods. PLoS One. 16 (7), e0255314 (2021).
- Brien, J. D., et al. Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3. Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).
- Lazear, H. M., et al. A mouse model of Zika virus pathogenesis. Cell Host & Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).
- Miner, J. J., et al. Zika virus infection during pregnancy in mice causes placental damage and fetal demise. Cell. 165 (5), 1081-1091 (2016).
- Kang, W., Shin, E. -. C. Colorimetric focus-forming assay with automated focus counting by image analysis for quantification of infectious hepatitis C virions. PLoS One. 7 (8), e43960 (2012).
- Brien, J. D., et al. Isolation and quantification of Zika virus from multiple organs in a mouse. Journal of VIsualized Experiments. (150), e59632 (2019).
- Payne, A. F., Binduga-Gajewska, I., Kauffman, E. B., Kramer, L. D. Quantitation of flaviviruses by fluorescent focus assay. Journal of Virological Methods. 134 (1-2), 183-189 (2006).
- Moser, L. A., et al. Growth and adaptation of Zika virus in mammalian and mosquito cells. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (11), e0006880 (2018).
- Ishimine, T., Tadano, M., Fukunaga, T., Okuno, Y. An improved micromethod for infectivity assays and neutralization tests of dengue viruses. Biken Journal. 30 (2), 39-44 (1987).
- Leiva, S., et al. Application of quantitative immunofluorescence assays to analyze the expression of cell contact proteins during Zika virus infections. Virus Research. 304, 198544 (2021).
- Lee, E. M., Titus, S. A., Xu, M., Tang, H., Zheng, W. High-throughput Zika viral titer assay for rapid screening of antiviral drugs. ASSAY and Drug Development Technologies. 17 (3), 128-139 (2019).
