S. cerevisiae에서 감수 분열을 연구하기 위해 타임 랩스 현미경 및 단백질의 단계 별 핵 고갈 사용
Summary
타임 랩스 현미경은 신진 효모에서 감수 분열을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 이 프로토콜은 세포 주기 동기화, 타임랩스 현미경 검사 및 표적 단백질의 조건부 고갈을 결합하여 감수 분열 염색체 분리 동안 특정 단백질의 기능을 연구하는 방법을 설명하는 방법을 설명합니다.
Abstract
타임랩스 형광 현미경은 고정된 세포를 이미징하는 방법으로는 종종 볼 수 없는 시간적 및 공간적 데이터를 제공함으로써 감수 분열 세포 주기 이벤트에 대한 이해에 혁명을 일으켰습니다. 신진 효모는 많은 감수 분열 유전자가 고도로 보존되어 있기 때문에 감수 분열 염색체 분리를 연구하는 중요한 모델 유기체임이 입증되었습니다. 신진 효모에서 감수 분열의 타임 랩스 현미경 검사를 통해 다양한 감수 분열 돌연변이를 모니터링하여 돌연변이가 감수 분열 과정을 어떻게 방해하는지 보여줄 수 있습니다. 그러나 많은 단백질이 감수 분열의 여러 지점에서 기능합니다. 따라서 기능 상실 또는 감수 분열 null 돌연변이의 사용은 초기 과정을 방해하여 이후 과정을 차단하거나 방해하고 각 개별 역할과 관련된 표현형을 결정하기 어렵게 만들 수 있습니다. 이 문제를 피하기 위해 이 프로토콜은 감수 분열의 특정 단계에서 단백질이 핵에서 조건부로 고갈되는 동시에 타임랩스 현미경을 사용하여 감수 분열 사건을 모니터링하는 방법을 설명합니다. 특히, 이 프로토콜은 세포가 I 단계에서 동기화되는 방법, 앵커 어웨이 기술을 사용하여 특정 감수 분열 단계에서 핵에서 단백질을 고갈시키는 방법, 감수 분열 염색체 분리를 모니터링하기 위해 타임 랩스 이미징을 사용하는 방법을 설명합니다. 이 기술의 유용성의 예로서, 키네토코어 단백질 Ctf19는 감수 분열 동안 다른 시점에서 핵으로부터 고갈되었고, 감수 분열 II의 말기에 염색질 질량의 수를 분석하였다. 전반적으로, 이 프로토콜은 감수 분열을 모니터링하면서 핵에서 다른 핵 단백질을 고갈시키도록 조정할 수 있습니다.
Introduction
타임랩스 형광 현미경은 신진 효모 1,2에서 감수 분열 염색체 분리의 역학을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 신진 효모 세포는 주요 영양소의 기아를 통해 감수 분열을 겪도록 유도 될 수 있습니다3. 감수 분열 동안 세포는 한 번의 염색체 분리 후 두 번의 분열을 거쳐 포자로 포장되는 4 개의 감수 분열 생성물을 만듭니다 (그림 1). 감수 분열의 각 단계에서 개별 세포를 시각화 할 수 있으며, 이는 고정 세포 이미징으로 쉽게 놓칠 수있는 공간 및 시간 데이터를 생성합니다. 이 프로토콜은 타임 랩스 형광 현미경을 이전에 확립된 두 가지 방법인 유도성 NDT80 시스템(NDT80-in) 및 앵커 어웨이 기법과 결합하여 별개의 감수 분열 단계에서 특정 단백질의 기능을 연구하는 방법을 보여줍니다.
NDT80-in 시스템은 중간 감수 분열 전사 인자 NDT80 4,5의 유도 가능한 발현에 의존하는 감수 분열 세포주기 동기화를위한 강력한 도구입니다. NDT80 발현은 prophase I 출구 6,7에 필요합니다. NDT80-in 시스템에서 NDT80은 에스트로겐 수용체(Gal1-ER)4에 융합된 Gal4 전사 인자를 발현하는 세포에서 GAL1-10 프로모터의 제어 하에 있습니다.4,5. Gal4-ER은 β- 에스트라 디올에 결합 할 때만 핵으로 들어가기 때문에 NDT80-in 세포는 β- 에스트라 디올이없는 상태에서 전상 I에서 정지하여 전상 I에서 세포의 동기화를 허용합니다 (그림 1). β- 에스트라 디올 첨가는 Gal4-ER 전사 인자의 핵으로의 전좌를 촉진하여 GAL1-10에 결합하여 NDT80의 발현을 유도하여 감수 분열로의 동시 진입을 유도합니다. 타임 랩스 현미경 검사는 동기화없이 수행 할 수 있지만 동기화를 사용하면 세포가 감수 분열의 특정 단계에있는 동안 억제제 또는 약물을 추가 할 수 있다는 장점이 있습니다.
앵커 어웨이 기술은 라파마이신8의 첨가로 단백질이 핵으로부터 고갈될 수 있는 유도성 시스템이다. 이 기술은 효모 세포가 핵 외피가 분해되지 않는 폐쇄 유사 분열 및 감수 분열을 겪기 때문에 신진 효모의 세포 분열 동안 핵 단백질을 연구하는 데 이상적입니다. 또한,이 기술은 감수 분열 전반에 걸쳐 여러 기능을 가진 단백질에 매우 유용합니다. 결실, 돌연변이 대립 유전자 또는 감수 분열 널 대립 유전자와 달리 특정 단계에서 핵에서 표적 단백질을 제거해도 초기 단계에서 표적 단백질 활성이 손상되지 않아 결과를보다 정확하게 해석 할 수 있습니다. 앵커 어웨이 시스템은 리보솜 성숙8시 발생하는 핵과 세포질 사이의 리보솜 서브 유닛의 왕복을 이용합니다. 핵으로부터 표적 단백질을 고갈시키기 위해, 표적 단백질은 리보솜 서브유닛 Rpl13A가 FKBP12로 태그된 균주에서 FKBP12-라파마이신-결합 도메인 (FRB)으로 태그된다. 라파마이신이 없으면 FRB와 FKBP12는 상호 작용하지 않으며 FRB 태그가 부착 된 단백질은 핵에 남아 있습니다. 라파마이신 첨가시, 라파마이신은 FKBP12 및 FRB와 안정한 복합체를 형성하고, 복합체는 Rpl13A와의 상호작용으로 인해 핵 밖으로 셔틀된다(도 1). 라파마이신 첨가시 세포 사멸을 방지하기 위해, 세포는 TOR1 유전자의 tor1-1 돌연변이를 보유한다. 또한, 이들 세포는 S. 세레비시아에 FKBP12 단백질의 널 대립유전자인 fpr1Δ를 함유하여, 내인성 Fpr1이 FRB 및 라파마이신 결합에 대해 Rpl13A-FKBP12와 경쟁하는 것을 방지한다. 앵커 어웨이 배경 돌연변이 tor1-1 및 fpr1Δ는 감수 분열 타이밍 또는 염색체 분리2에 영향을 미치지 않습니다.
이 기술의 유용성을 입증하기 위해, 키네토코어 단백질 Ctf19는 감수 분열 전반에 걸쳐 상이한 시점에서 고갈되었다. Ctf19는 유사 분열에 필수적이지만 감수 분열 9,10,11,12,13에서 적절한 염색체 분리에 필요한 키네토 코어의 구성 요소입니다. 감수 분열에서 키네 토코 레는 프로 페이즈 I에서 흘려지고 Ctf19는 키네 토코 레 재 조립에 중요합니다 9,14. 이 프로토콜의 경우, NDT80-in 시스템과 세포를 동기화하고, 앵커 어웨이 기술을 사용하여 전구 단계 I에서 방출되기 전후와 감수 분열 I 염색체 분리 후에 핵에서 표적 단백질 Ctf19를 고갈시켰다 (그림 1). 이 프로토콜은 감수 분열 및 유사 분열의 모든 단계에서 관심있는 다른 단백질을 고갈시키도록 조정할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 세포를 동기화하는 NDT80-in 시스템, 핵에서 단백질을 고갈시키는 앵커 어웨이 기술, 감수 분열 동안 신진 효모 세포를 이미지화하는 형광 타임 랩스 현미경을 결합합니다. NDT80-in 시스템은 전상 I 정지 및 방출 4,8을 이용하는 감수 분열 세포주기 동기화를위한 방법입니다. 개별 세포는 각각의 후속 감수 분열 단계에서 소요되?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
인디애나 대학교의 광학 현미경 이미징 센터에 감사드립니다. 이 작업은 국립 보건원 (GM105755)의 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| β-estradiol | Millipore Sigma | E8875 | Make 1mM stocks in 95% EtOH |
| 0.22 uM Threaded Bottle-top Filter | Millipore Sigma | S2GPT02RE | |
| 100% EtOH | Fisher Scientific | 22-032-601 | |
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP399500 | Dilute 1:10 to use as solvent for ConA |
| 24 mm x 50 mm coverslip No. 1.5 | VWR North American | 48393241 | |
| 25 mm x 75 mm microscope slides | VWR North American | 48300-026 | |
| Adenine hemisulfate salt | Millipore Sigma | A9126 | To supplement SC, SCA, and 1% Kac |
| Bacto Agar | BD | 214030 | |
| Concanavialin A | Mllipore Sigma | C2010 | Make as 1mg/mL in 1X PBS |
| CoolSNAP HQ2 CCD camera | Photometrics | Used in Section 4.3 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids | BD | 291920 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Millipore Sigma | D5879 | |
| Eclipse Ti2 inverted-objective micrscope | Nikon | Used in Section 4.4 | |
| Fiji | NIH | Download from https://fiji.sc/ | |
| GE Personal DeltaVision Microscope | Applied Precision | Used in Section 4.3 | |
| L-Tryptophan | Millipore Sigma | T0254 | To supplement SC, SCA, and 1% Kac |
| Modeling Clay | Crayola | 2302880000 | To secure coverslip in slide holder |
| NIS-Elements AR 5.30.04 Imaging Software | Nikon | Used in Section 4.4 | |
| ORCA-Fustion BT Camera | Hamamatsu | C15440-20UP | Used in Section 4.4 |
| Plastic pipette tip holder | Dot Scientific | LTS1000-HR | Cut a 4 square x 4 square section of the rack portion of this product. |
| Pottassium Acetate | Fisher Scientific | BP264 | |
| Rapamycin | Fisher Scientific | BP29631 | Make 1mg/mL stocks in DMSO |
| Silicone Sealant | Aqueon | 100165001 | Also known as aquarium glue. |
| SoftWorx7.0.0 Imaging Software | Applied Precision | Used in Section 4.3 | |
| Synthetic Complete Mixture (Kaiser) | Formedium | DSCK2500 | |
| Type N immersion oil | Nikon | MXA22166 |
Riferimenti
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