La microscopia time-lapse è uno strumento prezioso per studiare la meiosi nel lievito in erba. Questo protocollo descrive un metodo che combina la sincronizzazione del ciclo cellulare, la microscopia time-lapse e l'esaurimento condizionale di una proteina bersaglio per dimostrare come studiare la funzione di una proteina specifica durante la segregazione cromosomica meiotica.
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Articolo metodologico
Uso della microscopia time-lapse e della deplezione nucleare stadio-specifica delle proteine per studiare la meiosi in S. cerevisiae
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La microscopia a fluorescenza time-lapse ha rivoluzionato la comprensione degli eventi del ciclo cellulare meiotico fornendo dati temporali e spaziali che spesso non vengono visualizzati dalle cellule fisse di imaging. Il lievito in erba ha dimostrato di essere un importante organismo modello per studiare la segregazione cromosomica meiotica perché molti geni meiotici sono altamente conservati. La microscopia time-lapse della meiosi nel lievito in erba consente il monitoraggio di diversi mutanti meiotici per mostrare come la mutazione interrompe i processi meiotici. Tuttavia, molte proteine funzionano in più punti della meiosi. L'uso di mutanti nulli meiotici o con perdita di funzione può quindi interrompere un processo precoce, bloccando o disturbando il processo successivo e rendendo difficile determinare i fenotipi associati a ciascun singolo ruolo. Per aggirare questa sfida, questo protocollo descrive come le proteine possono essere impoverite condizionatamente dal nucleo in fasi specifiche della meiosi mentre monitorano gli eventi meiotici usando la microscopia time-lapse. In particolare, questo protocollo descrive come le cellule sono sincronizzate nella profase I, come la tecnica dell'ancoraggio viene utilizzata per esaurire le proteine dal nucleo in specifici stadi meiotici e come l'imaging time-lapse viene utilizzato per monitorare la segregazione cromosomica meiotica. Come esempio dell'utilità della tecnica, la proteina cinetocoora Ctf19 è stata impoverita dal nucleo in diversi punti temporali durante la meiosi e il numero di masse di cromatina è stato analizzato alla fine della meiosi II. Nel complesso, questo protocollo può essere adattato per esaurire diverse proteine nucleari dal nucleo mentre si monitorano le divisioni meiotiche.
Introduzione
La microscopia a fluorescenza time-lapse è un valido strumento per studiare la dinamica della segregazione cromosomica meiotica nel lievito in erba 1,2. Le cellule di lievito in erba possono essere indotte a subire meiosi attraverso la fame di nutrienti chiave3. Durante la meiosi, le cellule subiscono un ciclo di segregazione cromosomica seguito da due divisioni per creare quattro prodotti meiotici che vengono confezionati in spore (Figura 1). Le singole cellule possono essere visualizzate durante ogni fase della meiosi, che genera dati spaziali e temporali....
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Protocollo
1. Preparazione dei materiali necessari
- Preparare i reagenti per la crescita e la sporulazione delle cellule di lievito.
NOTA: Se i ceppi di lievito in erba sono ade2- e trp1-, integrare tutti i terreni nei punti 1.1.1-1.1.3 con una concentrazione finale dello 0,01% di adenina e dello 0,01% di triptofano dall'1% di stock. Se i mezzi di sterilizzazione in autoclave, aggiungere questi aminoacidi solo dopo che i reagenti sono stati autoclavati e lasciati raffreddare a temperatura ambiente.- Per la crescita vegetativa, preparare 2x mezzo completo + destrosio sintetico (2XSC) sciogliendo 6,7 g di base azotata di lievito....
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Risultati
Per monitorare la segregazione della cromatina, la proteina istonica Htb2 è stata etichettata con mCherry. Nella profase I, la cromatina appare come una singola massa di Htb2. Dopo che i cromosomi omologhi si segregano nella prima divisione meiotica, la cromatina appare come due masse distinte (Figura 3A). Dopo che i cromatidi fratelli si separano, la cromatina appare come quattro masse. Se alcuni cromosomi non riescono ad attaccarsi ai microtubuli del fuso, si possono vedere masse aggiuntiv.......
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Discussione
Questo protocollo combina il sistema NDT80-in per sincronizzare le cellule, la tecnica di ancoraggio per esaurire le proteine dal nucleo e la microscopia time-lapse a fluorescenza per visualizzare le cellule di lievito in erba durante la meiosi. Il sistema NDT80-in è un metodo per la sincronizzazione del ciclo cellulare meiotico che utilizza un arresto e rilascio di profase I 4,8. Sebbene le singole cellule varino leggermente nella quantità di t.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Light Microscopy Imaging Center dell'Università dell'Indiana. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione del National Institutes of Health (GM105755).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| β-estradiolo | Millipore Sigma | E8875 | Produci 1 mM di azioni in 95% EtOH |
| 0,22 uM Filtro filettato per bottiglie | Millipore Sigma | S2GPT02RE | |
| 100% EtOH | Fisher Scientific | 22-032-601 | |
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP399500 | Diluire 1:10 da utilizzare come solvente per |
| ConA 24 mm x 50 mm vetrino coprioggetti n. 1,5 | VWR Vetrini | per | |
| nordamericani 25 mm x 75 mm | VWR Nord America | 48300-026 | |
| Sale di adenina emisolfato | Millipore Sigma | A9126 | Per integrare SC, SCA e 1% Kac |
| Bacto Agar | BD | 214030 | |
| Concanavialina A | Mllipore Sigma | C2010 | Fare come 1mg/mL in 1X PBS |
| CoolSNAP HQ2 CCD camera | Fotometria | utilizzata nella sezione 4.3 | |
| D-glucosio | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Difco Lievito Base azotata senza aminoacidi | BD | 291920 | |
| Dimetil solfossido (DMSO) | Millipore Sigma | D5879 | |
| Eclipse Ti2 microscopio a obiettivo invertito | Nikon | Utilizzato nella sezione 4.4 | |
| Fiji | NIH | Scarica da https://fiji.sc/ | |
| GE Personal DeltaVision Microscope | Applied Precision | Used in Section 4.3 | |
| L-Tryptophen | Millipore Sigma | T0254 | Per integrare SC, SCA e 1% Kac |
| Modeling Clay | Crayola | 2302880000 | Per fissare il vetrino coprioggetti nel supporto per vetrini |
| NIS-Elements AR 5.30.04 Software di imaging | Nikon | Utilizzato nella sezione 4.4 | |
| ORCA-Fustion BT Camera | Hamamatsu | C15440-20UP | Utilizzato nella sezione 4.4 |
| Supporto per puntali per pipette in plastica | Dot Scientific | LTS1000-HR | Tagliare una sezione di 4 quadrati x 4 quadrati della parte del rack di questo prodotto. |
| Acetato di Pottassio | Fisher Scientific | BP264 | |
| Rapamicina | Fisher Scientific | BP29631 | Produce scorte da 1 mg/mL in DMSO |
| Sigillante siliconico | Aqueon | 100165001 | Conosciuto anche come colla per acquari. |
| SoftWorx7.0.0 Software di imaging | applicato di precisione | utilizzato nella sezione 4.3 | |
| Miscela completa sintetica (Kaiser) | Per olio da immersione di tipo N a medio | DSCK2500 | |
| Nikon | MXA22166 |
Riferimenti
- Tsuchiya, D., Gonzalez, C., Lacefield, S. The spindle checkpoint protein Mad2 regulates APC/C activity during prometaphase and metaphase of meiosis I in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 22 (16), 2848-2861 (2011).
- Cairo, G., MacKenzie, A. M., Lacefield, S.
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Ristampe e permessi
