Ekspression af transgener i naturligt blæreurothelium ved hjælp af adenovirusmedieret transduktion
Summary
Metoder er beskrevet til generering af store mængder rekombinante adenovirus, som derefter kan bruges til at transducere det indfødte gnaverurothelium, hvilket muliggør ekspression af transgener eller nedregulering af endogene genprodukter.
Abstract
Ud over at danne en højmodstandsbarriere antages urothelium, der forer nyrebækkenet, urinlederne, blæren og proksimal urinrøret at mærke og transmittere information om dets miljø til de underliggende væv, hvilket fremmer ugyldiggørelsesfunktion og adfærd. Forstyrrelse af urothelialbarrieren eller dens sensoriske / transducerfunktion kan føre til sygdom. At studere disse komplekse begivenheder hæmmes af manglen på enkle strategier til at ændre gen- og proteinekspression i urothelium. Metoder er beskrevet her, der gør det muligt for efterforskere at generere store mængder high-titer adenovirus, som derefter kan bruges til at transducere gnaverurothelium med høj effektivitet og på en relativt ligetil måde. Både cDNA’er og små interfererende RNA’er kan udtrykkes ved hjælp af adenoviral transduktion, og virkningen af transgenekspression på urothelial funktion kan vurderes 12 timer til flere dage senere. Disse metoder har bred anvendelighed til studier af normal og abnorm urothelial biologi ved hjælp af muse- eller rottedyremodeller.
Introduction
Urothelium er det specialiserede epitel, der linjer nyrebækkenet, urinlederne, blæren og proksimal urinrør1. Det består af tre lag: et lag af stærkt differentierede og polariserede ofte bi-nucleate paraplyceller, hvis apikale overflader er badet i urin; et mellemliggende cellelag med en population af bi-nukleattransitforstærkende celler, der kan give anledning til overfladiske paraplyceller som reaktion på deres akutte tab og et enkelt lag af basalceller, hvoraf en delmængde fungerer som stamceller, der kan regenerere hele urothelium som reaktion på kronisk skade. Paraplyceller er hovedsageligt ansvarlige for dannelsen af urothelialbarrieren med høj modstand, hvis komponenter inkluderer en apikal membran (rig på kolesterol og cerebrosider) med lav permeabilitet for vand og opløste stoffer og et apikalt forbindelseskompleks med høj modstand (bestående af tætte kryds, klæbende kryds, desmosomer og en tilhørende actomyosinring)1 . Både paraplycellens apikale overflade og dens forbindelsesring udvider sig under blærefyldning og vender hurtigt tilbage til deres fyldte tilstand efter tømning af 1,2,3,4,5. Ud over sin rolle i barrierefunktionen antages urothelium også at have sensoriske og transducerfunktioner, der gør det muligt at mærke ændringer i det ekstracellulære miljø (fx stretch) og overføre denne information via frigivelse af mediatorer (herunder ATP, adenosin og acetylcholin) til underliggende væv, herunder suburothelial afferente nerveprocesser 6,7,8 . Nylige beviser for denne rolle findes hos mus, der mangler urothelial ekspression af både Piezo1 og Piezo2, hvilket resulterer i ændret ugyldiggørelsesfunktion9. Derudover udvikler rotter, der overudtrykker det poredannende protein CLDN2 i paraplycellelaget, betændelse og smerte svarende til det, der ses hos patienter med interstitiel blærebetændelse10. Det antages, at forstyrrelse af urothelial sensorisk / transducer eller barrierefunktion kan bidrage til flere blæreforstyrrelser 6,11.
En bedre forståelse af urotheliums biologi i normale og sygdomstilstande afhænger af tilgængeligheden af værktøjer, der gør det muligt for efterforskere let at nedregulere endogen genekspression eller muliggøre ekspression af transgener i det indfødte væv. Mens en tilgang til nedregulering af genekspression er at generere betingede urotheliale knockout-mus, afhænger denne tilgang af tilgængeligheden af mus med floxede alleler, er arbejdskrævende og kan tage måneder til år at gennemføre12. Ikke overraskende har forskere udviklet teknikker til at transfektere eller transducere urothelium, hvilket kan føre til resultater på en kortere tidsskala. Offentliggjorte metoder til transfektion inkluderer anvendelse af kationiske lipider13, anti-sense phosphorothioated oligodeoxynucleotider 14 eller antisensenukleinsyrer bundet til HIV TAT-proteinet, der trænger ind i 11-mer peptid15. Denne protokols fokus er imidlertid på brugen af adenoviralmedieret transduktion, en velundersøgt metode, der er effektiv til genlevering til en bred vifte af celler, er blevet testet i adskillige kliniske forsøg og blev senest brugt til at levere cDNA’et, der koder for COVID-19-kapsidproteinet, til modtagere af en variant af COVID-19-vaccinen16, 17. For en mere grundig beskrivelse af adenoviruslivscyklussen, adenovirale vektorer og kliniske anvendelser af adenovirus henvises læseren til reference17.
En vigtig milepæl i brugen af adenovirus til transducere urothelium var en rapport fra Ramesh et al., der viste korte forbehandlinger med vaskemidler, herunder N-dodecyl-β-D-maltosid (DDM) dramatisk forbedret transduktion af urothelium af en adenovirus, der koder for β-galactosidase18. Ved hjælp af denne proof-of-principle-undersøgelse som vejledning er adenoviral-medieret transduktion af urothelium nu blevet brugt til at udtrykke en række proteiner, herunder Rab-familie GTPaser, guanin-nukleotidudvekslingsfaktorer, myosinmotoriske fragmenter, poredannende tætte forbindelsesassocierede claudiner og ADAM17 10,19,20,21,22 . Den samme tilgang blev tilpasset til at udtrykke små interfererende RNA’er (siRNA), hvis virkninger blev reddet af co-ekspressive siRNA-resistente varianter af transgenet22. Protokollen beskrevet her indeholder generelle metoder til at generere store mængder stærkt koncentreret adenovirus, et krav til disse teknikker, samt tilpasninger af metoderne fra Ramesh et al.18 til at udtrykke transgener i urothelium med høj effektivitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mens Ramesh et al. var fokuseret på at udvikle strategier til at anvende adenoviral transduktion til behandling af blærekræft 18, har nyere rapporter vist nytten af disse teknikker til at studere normal urothelial biologi / fysiologi og patofysiologi 10,18,19,20,21 . De vigtigste træk ved denne fremgangsmåde omfatter følgende: (i)…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af en pilotprojektpris gennem P30DK079307 (til M.G.D.), NIH-bevilling R01DK119183 (til G.A. og MDC), NIH-tilskud R01DK129473 (til G.A.), en American Urology Association Career Development-pris og et Winters Foundation-tilskud (til N.M.) af Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores fra Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307), og af S10OD028596 (til G.A.), som finansierede købet af det konfokale system, der blev brugt til at fange nogle af de billeder, der præsenteres i dette manuskript.
Materials
| 10 mL pipette | Corning Costar (Millipore Sigma) | CLS4488 | sterile, serological pipette, individually wrapped |
| 12 mL ultracentrifuge tube | ThermoFisher | 06-752 | PET thinwall ultracentrifuge tube |
| 15 mL conical centrifuge tube | Falcon (Corning) | 352097 | sterile |
| 18 G needle | BD | 305196 | 18 G x 1.5 in needle |
| 20 mL pipette | Corning Costar (Millipore Sigma) | CLS4489 | sterile, serological pipette, individually wrapped |
| 50 mL conical centrifuge tube | Falcon (Corning) | 352098 | sterile |
| 5 mL pipette | Corning Costar (Millipore Sigma) | CLS4487 | sterile, serological pipette, individually wrapped |
| Cavicide | Henry Schein | 6400012 | Anti-viral solution |
| Cell culture dish – 15 cm | Falcon (Corning) | 353025 | sterile, tissue-culture treated (150 mm x 25 mm dish) |
| Cell scraper | Sarstedt | 893.1832 | handle length 24 cm, blade length 1.7 cm |
| CsCl | Millipore Sigma | C-4306 | Molecular Biology grade ≥ 98% |
| DMEM culture medium (high glucose) | Gibco (ThermoFisher) | 11965092 | with 4.5 g/L glucose + L-glutamine + phenol red |
| EDTA | Millipore Sigma | EDS | Bioiultra grade ≥ 99% |
| Fetal bovine serum | Hyclone (Cytiva) | SH30070.03 | defined serum |
| Glass pipette | Fisher Scientific | 13-678-20A | 5.75 in glass pipette, autoclaved |
| Glycerol | Millipore Sigma | G-5516 | Molecular Biology grade ≥ 99% |
| HEK293 cells | ATCC | CRL-3216 | HEK293T cells are a variant of HEK293 cells that express the SV40 large T-antigen |
| Isoflurane | Covetrus | 29405 | |
| IV catheter – mouse | Smith Medical Jelco | 3063 | 24 G x 3/4 in Safety IV catheter radiopaque |
| IV catheter – rat | Smith Medical Jelco | 3060 | 22 G x 1 in Safety IV catheter radiopaque |
| KCl | Millipore Sigma | P-9541 | Molecular Biology grade ≥ 99% |
| KH2PO4 | Millipore Sigma | P5655 | Cell culture grade ≥ 99% |
| Na2HPO4•7 H2O | Millipore Sigma | 431478 | ≥ 99.99% |
| NaCl | Millipore Sigma | S3014 | Molecular Biology grade ≥ 99% |
| N-dodecyl-β-D-maltoside | Millipore Sigma | D4641 | ≥ 98% |
| Nose cone for multiple animals | custom designed | commercial options include one from Parkland Scientific (RES3200) | |
| PD-10 column | GE Healthcare | 17-085-01 | Prepacked columns filled ith Sephadex G-25M |
| Penicillin/streptomycin antibiotic (100x) | Gibco (ThermoFisher) | 15070063 | 100x concentrated solution |
| Spectrophotometer | Eppendorf | BioPhotometer | |
| Stand and clamp | Fisher Scientific | 14-679Q and 05-769-8FQ | available from numerous suppliers |
| Sterile filter unit | Fisher Scientific (Nalgene) | 09-740-65B | 0.2 µm rapid-flow filter unit (150 mL) |
| Sterile filter unit 0.2 µm (syringe) | Fisher Scientific | SLGV004SL | Millipore Sigma Milex 0.22 µm filter unit that attaches to syringe |
| Super speed centrifuge | Eppendorf | 5810R | with Eppendorf F34-6-38 fixed angle rotor (12,000 rpm) |
| Syringe (1 mL) | BD | 309628 | 1-mL syringe Luer-lok tip – sterile |
| Syringe (3 mL) | BD | 309656 | 3-mL syringe slip tip – sterile |
| Table-top centrifuge (low speed) | Eppendorf | 5702 | with swinging bucket rotor |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | polyethylene 3.4 mL transfer pipette |
| Tris-base | Millipore Sigma | 648310-M | Molecular Biology grade |
| TrypLE select protease solution | Gibco (ThermoFisher) | 12604013 | TrypLE express enzyme (1x), no phenol red |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-80 XP | with Beckman SW41 rotor (41,000 rpm) |
| Vaporizer | General Anesthetic Services, Inc. | Tec 3 | Isoflurane vaporizer |
| Vortex Mixer | VWR | 10153-838 | analog vortex mixer |
Riferimenti
- Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The Urothelium: Life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).
- Truschel, S. T., et al. Stretch-regulated exocytosis/endocytosis in bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 13 (3), 830-846 (2002).
- Lewis, S. A., de Moura, J. L. C. Incorporation of cytoplasmic vesicles into apical membrane of mammalian urinary bladder epthelium. Nature (London). 297 (5868), 685-688 (1982).
- Eaton, A. F., et al. Expansion and contraction of the umbrella cell apical junctional ring in response to bladder filling and voiding. Molecular Biology of the Cell. 30 (16), 2037-2052 (2019).
- Yu, W., Khandelwal, P., Apodaca, G. Distinct apical and basolateral membrane requirements for stretch-induced membrane traffic at the apical surface of bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 20 (1), 282-295 (2009).
- Birder, L., Andersson, K. E. Urothelial signaling. Physiological Reviews. 93 (2), 653-680 (2013).
- Birder, L. A. Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions. Autonomic Neuroscience. 182, 89-94 (2014).
- Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. The uroepithelial-associated sensory web. Kidney International. 72 (9), 1057-1064 (2007).
- Dalghi, M. G., et al. Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception. Journal of Clinical Investigation Insight. 6 (19), 152984 (2021).
- Montalbetti, N., et al. Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis. American Journal of Physiology: Renal Physiology. 309 (12), 1070-1081 (2015).
- Keay, S. K., Birder, L. A., Chai, T. C. Evidence for bladder urothelial pathophysiology in functional bladder disorders. BioMed Research International. 2014, 865463 (2014).
- Friedel, R. H., Wurst, W., Wefers, B., Kuhn, R. Generating conditional knockout mice. Methods in Molecular Biology. 693, 205-231 (2011).
- Kashyap, M., et al. Down-regulation of nerve growth factor expression in the bladder by antisense oligonucleotides as new treatment for overactive bladder. Journal of Urology. 190 (2), 757-764 (2013).
- Bolenz, C., et al. Cellular uptake and ex vivo urothelial penetration by oligodeoxynucleotides for optimizing treatment of transitional cell carcinoma. Analytical and Quantitative Cytology and Histology. 30 (5), 265-273 (2008).
- Tyagi, P., et al. Intravesical antisense therapy for cystitis using TAT-peptide nucleic acid conjugates. Molecular Pharmaceutics. 3 (4), 398-406 (2006).
- Sadoff, J., et al. Interim results of a phase 1-2a trial of Ad26.COV2.S Covid-19 vaccine. New England Journal of Medicine. 384 (19), 1824-1835 (2021).
- Lee, C. S., et al. Adenovirus-mediated gene delivery: Potential applications for gene and cell-Based therapies in the new era of personalized medicine. Genes & Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).
- Ramesh, N., et al. Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium. Molecular Therapy. 10 (4), 697-705 (2004).
- Khandelwal, P., et al. Rab11a-dependent exocytosis of discoidal/fusiform vesicles in bladder umbrella cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15773-15778 (2008).
- Khandelwal, P., Ruiz, W. G., Apodaca, G. Compensatory endocytosis in bladder umbrella cells occurs through an integrin-regulated and RhoA- and dynamin-dependent pathway. The European Molecular Biology Organization journal. 29 (12), 1961-1975 (2010).
- Khandelwal, P., et al. A Rab11a-Rab8a-Myo5B network promotes stretch-regulated exocytosis in bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 24 (7), 1007-1019 (2013).
- Prakasam, H. S., et al. A1 adenosine receptor-stimulated exocytosis in bladder umbrella cells requires phosphorylation of ADAM17 Ser811 and EGF receptor transactivation. Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3798-3812 (2014).
- Gallo, L. I., et al. RAB27B requirement for stretch-induced exocytosis in bladder umbrella cells. American Journal of Physiology Cell Physiology. 314 (3), 349-365 (2018).
- Amasheh, S., et al. Claudin-2 expression induces cation-selective channels in tight junctions of epithelial cells. Journal of Cell Science. 115, 4969-4976 (2002).
- Yu, A. S., et al. Molecular basis for cation selectivity in claudin-2-based paracellular pores: identification of an electrostatic interaction site. The Journal of General Physiology. 133 (1), 111-127 (2009).
- Kasahara, H., Aoki, H. Gene silencing using adenoviral RNAi vector in vascular smooth muscle cells and cardiomyocytes. Methods in Molecular Medicine. 112, 155-172 (2005).
- Bolognesi, B., Lehner, B. Reaching the limit. eLife. 7, 39804 (2018).
- Atasheva, S., Shayakhmetov, D. M. Cytokine responses to adenovirus and adenovirus vectors. Viruses. 14 (5), 888 (2022).
- Sanchez Freire, V., et al. MicroRNAs may mediate the down-regulation of neurokinin-1 receptor in chronic bladder pain syndrome. American Journal of Pathology. 176 (1), 288-303 (2010).
