アデノウイルスを介した形質導入を用いた天然膀胱尿路上皮における導入遺伝子の発現
Summary
大量の組換えアデノウイルスを生成するための方法が記載されており、次いで、それを使用して天然のげっ歯類の尿路上皮を形質導入し、導入遺伝子の発現または内因性遺伝子産物のダウンレギュレーションを可能にすることができる。
Abstract
高抵抗バリアを形成することに加えて、腎盂、尿管、膀胱、および近位尿道の内側を覆う尿路上皮は、その環境に関する情報を感知して下にある組織に伝達し、排尿機能と行動を促進すると仮定されています。尿路上皮バリアまたはその感覚/トランスデューサー機能の破壊は、疾患につながる可能性があります。これらの複雑な事象の研究は、尿路上皮における遺伝子およびタンパク質発現を変化させるための単純な戦略の欠如によって妨げられている。ここでは、研究者が大量の高力価アデノウイルスを生成することを可能にし、それを使用してげっ歯類の尿路上皮を高効率で比較的簡単な方法で形質導入することができる方法について説明します。cDNAと低分子干渉RNAの両方をアデノウイルス形質導入を用いて発現させることができ、尿路上皮機能に対する導入遺伝子発現の影響を12時間から数日後に評価することができる。これらの方法は、マウスまたはラット動物モデルを用いた正常および異常な尿路上皮生物学の研究に広く適用できます。
Introduction
尿路上皮は、腎盂、尿管、膀胱、および近位尿道1を覆う特殊な上皮です。それは3つの層で構成されています:高度に分化し分極したしばしば二核傘細胞の層であり、その頂端表面は尿に浸されています。それらの急性喪失に応答して表在性アンブレラ細胞を生じさせることができる二核トランジット増幅細胞の集団を有する中間細胞層。基底細胞の単層であり、そのサブセットは、慢性損傷に応答して尿路上皮全体を再生することができる幹細胞として機能する。アンブレラ細胞は主に、水や溶質に対する透過性の低い頂端膜(コレステロールとセレブロシドが豊富)や、高抵抗の頂端接合複合体(タイトジャンクション、アドヒアレンスジャンクション、デスモソーム、および関連するアクトミオシンリングで構成される)を含む高抵抗尿路上皮バリアの形成に関与しています1。.傘細胞の頂端表面とその接合リングの両方が膀胱充填中に拡張し、排尿後に急速に充填前の状態に戻ります1、2、3、4、5。バリア機能におけるその役割に加えて、尿路上皮はまた、細胞外環境の変化を感知することを可能にする感覚およびトランスデューサー機能を有すると仮定されている(例えば、伸張)そしてメディエーター(ATP、アデノシン、アセチルコリンを含む)の放出を介してこの情報を、下皮下求心性神経突起を含む下層組織に伝達する6,7,8。.この役割の最近の証拠は、Piezo1とPiezo2の両方の尿路上皮発現を欠くマウスで発見され、その結果、排尿機能が変化します9。さらに、傘細胞層でタイトジャンクション孔形成タンパク質CLDN2を過剰発現しているラットは、間質性膀胱炎の患者に見られるのと同様の炎症と痛みを発症します10。尿路上皮感覚/トランスデューサーまたはバリア機能の破壊がいくつかの膀胱障害に寄与する可能性があるという仮説が立てられています6,11。
正常状態および疾患状態における尿路上皮の生物学のより良い理解は、研究者が内因性遺伝子発現を容易にダウンレギュレートしたり、天然組織における導入遺伝子の発現を可能にしたりすることを可能にするツールの利用可能性にかかっています。遺伝子発現をダウンレギュレートする1つのアプローチは、条件付き尿路上皮ノックアウトマウスを生成することですが、このアプローチは、フロックス対立遺伝子を持つマウスの利用可能性に依存し、労働集約的であり、完了するまでに数か月から数年かかる場合があります12。当然のことながら、研究者は尿路上皮をトランスフェクトまたは形質導入する技術を開発しており、これによりより短い時間スケールで結果が得られる可能性があります。トランスフェクションのための公表された方法には、カチオン性脂質13、アンチセンスホスホロチオ化オリゴデオキシヌクレオチド14、またはHIV TATタンパク質につなが留されたアンチセンス核酸透過性11量体ペプチド15の使用が含まれる。ただし、このプロトコルの焦点は、広範囲の細胞への遺伝子送達に効率的である十分に研究された方法論であるアデノウイルス媒介形質導入の使用にあり、多数の臨床試験でテストされており、最近では、COVID-19カプシドタンパク質をコードするcDNAをCOVID-19ワクチンの1つの変異体のレシピエントに送達するために使用されました16。17.アデノウイルスのライフサイクル、アデノウイルスベクター、およびアデノウイルスの臨床応用のより完全な説明については、読者は参考文献17に向けられる。
尿路上皮を形質導入するためのアデノウイルスの使用における重要なマイルストーンは、N-ドデシル-β-D-マルトシド(DDM)を含む界面活性剤による短い前処理が、β-ガラクトシダーゼ18をコードするアデノウイルスによる尿路上皮の形質導入を劇的に増強したことを示したRameshらの報告でした。この原理実証研究をガイドとして、尿路上皮のアデノウイルス媒介形質導入は、RabファミリーGTPアーゼ、グアニンヌクレオチド交換因子、ミオシンモーターフラグメント、孔形成タイトジャンクション関連クローディン、およびADAM17 10、19、20、21、22を含むさまざまなタンパク質を発現するために使用されています10、19、20、21、22.同じアプローチが小さな干渉RNA(siRNA)を発現するように適応され、その効果は導入遺伝子22のsiRNA耐性変異体を共発現することによって救出された。ここで説明するプロトコルには、これらの技術の要件である大量の高濃度アデノウイルスを生成するための一般的な方法、および尿路上皮で導入遺伝子を高効率で発現させるためのRameshらの方法の適応が含まれます18。
Protocol
Representative Results
Discussion
Rameshらは、膀胱癌の治療にアデノウイルス形質導入を使用する戦略の開発に焦点を当てていましたが18、最近の報告では、正常な尿路上皮生物学/生理学および病態生理学の研究におけるこれらの技術の有用性が実証されています10,18,19,20,21。.このアプ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、P30DK079307(MGDへ)、NIH助成金R01DK119183(GAおよびMDCへ)、NIH助成金R01DK129473(GAへ)、米国泌尿器科学会キャリア開発賞、ウィンターズ財団助成金(NMへ)、ピッツバーグ腎臓研究センターの細胞生理学およびモデル生物腎臓イメージングコア(P30DK079307)によるパイロットプロジェクト賞によってサポートされました。 S10OD028596(G.A.へ)は、この原稿で提示された画像の一部をキャプチャするために使用される共焦点システムの購入に資金を提供しました。
Materials
| 10 mL pipette | Corning Costar (Millipore Sigma) | CLS4488 | sterile, serological pipette, individually wrapped |
| 12 mL ultracentrifuge tube | ThermoFisher | 06-752 | PET thinwall ultracentrifuge tube |
| 15 mL conical centrifuge tube | Falcon (Corning) | 352097 | sterile |
| 18 G needle | BD | 305196 | 18 G x 1.5 in needle |
| 20 mL pipette | Corning Costar (Millipore Sigma) | CLS4489 | sterile, serological pipette, individually wrapped |
| 50 mL conical centrifuge tube | Falcon (Corning) | 352098 | sterile |
| 5 mL pipette | Corning Costar (Millipore Sigma) | CLS4487 | sterile, serological pipette, individually wrapped |
| Cavicide | Henry Schein | 6400012 | Anti-viral solution |
| Cell culture dish – 15 cm | Falcon (Corning) | 353025 | sterile, tissue-culture treated (150 mm x 25 mm dish) |
| Cell scraper | Sarstedt | 893.1832 | handle length 24 cm, blade length 1.7 cm |
| CsCl | Millipore Sigma | C-4306 | Molecular Biology grade ≥ 98% |
| DMEM culture medium (high glucose) | Gibco (ThermoFisher) | 11965092 | with 4.5 g/L glucose + L-glutamine + phenol red |
| EDTA | Millipore Sigma | EDS | Bioiultra grade ≥ 99% |
| Fetal bovine serum | Hyclone (Cytiva) | SH30070.03 | defined serum |
| Glass pipette | Fisher Scientific | 13-678-20A | 5.75 in glass pipette, autoclaved |
| Glycerol | Millipore Sigma | G-5516 | Molecular Biology grade ≥ 99% |
| HEK293 cells | ATCC | CRL-3216 | HEK293T cells are a variant of HEK293 cells that express the SV40 large T-antigen |
| Isoflurane | Covetrus | 29405 | |
| IV catheter – mouse | Smith Medical Jelco | 3063 | 24 G x 3/4 in Safety IV catheter radiopaque |
| IV catheter – rat | Smith Medical Jelco | 3060 | 22 G x 1 in Safety IV catheter radiopaque |
| KCl | Millipore Sigma | P-9541 | Molecular Biology grade ≥ 99% |
| KH2PO4 | Millipore Sigma | P5655 | Cell culture grade ≥ 99% |
| Na2HPO4•7 H2O | Millipore Sigma | 431478 | ≥ 99.99% |
| NaCl | Millipore Sigma | S3014 | Molecular Biology grade ≥ 99% |
| N-dodecyl-β-D-maltoside | Millipore Sigma | D4641 | ≥ 98% |
| Nose cone for multiple animals | custom designed | commercial options include one from Parkland Scientific (RES3200) | |
| PD-10 column | GE Healthcare | 17-085-01 | Prepacked columns filled ith Sephadex G-25M |
| Penicillin/streptomycin antibiotic (100x) | Gibco (ThermoFisher) | 15070063 | 100x concentrated solution |
| Spectrophotometer | Eppendorf | BioPhotometer | |
| Stand and clamp | Fisher Scientific | 14-679Q and 05-769-8FQ | available from numerous suppliers |
| Sterile filter unit | Fisher Scientific (Nalgene) | 09-740-65B | 0.2 µm rapid-flow filter unit (150 mL) |
| Sterile filter unit 0.2 µm (syringe) | Fisher Scientific | SLGV004SL | Millipore Sigma Milex 0.22 µm filter unit that attaches to syringe |
| Super speed centrifuge | Eppendorf | 5810R | with Eppendorf F34-6-38 fixed angle rotor (12,000 rpm) |
| Syringe (1 mL) | BD | 309628 | 1-mL syringe Luer-lok tip – sterile |
| Syringe (3 mL) | BD | 309656 | 3-mL syringe slip tip – sterile |
| Table-top centrifuge (low speed) | Eppendorf | 5702 | with swinging bucket rotor |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | polyethylene 3.4 mL transfer pipette |
| Tris-base | Millipore Sigma | 648310-M | Molecular Biology grade |
| TrypLE select protease solution | Gibco (ThermoFisher) | 12604013 | TrypLE express enzyme (1x), no phenol red |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-80 XP | with Beckman SW41 rotor (41,000 rpm) |
| Vaporizer | General Anesthetic Services, Inc. | Tec 3 | Isoflurane vaporizer |
| Vortex Mixer | VWR | 10153-838 | analog vortex mixer |
Riferimenti
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