Экспрессия трансгенов в уротелии нативного мочевого пузыря с использованием аденовирус-опосредованной трансдукции
Summary
Описаны способы генерации больших количеств рекомбинантных аденовирусов, которые затем могут быть использованы для трансдукции нативного уротелия грызунов, позволяющего экспрессировать трансгены или подавлять эндогенные генные продукты.
Abstract
Предполагается, что в дополнение к образованию барьера с высоким сопротивлением уротелий, выстилающий почечную лоханку, мочеточники, мочевой пузырь и проксимальный отдел уретры, воспринимает и передает информацию об окружающей среде в подлежащие ткани, способствуя мочеиспусканию и поведению. Нарушение уротелиального барьера или его сенсорной/преобразовательной функции может привести к заболеванию. Изучение этих сложных событий затруднено отсутствием простых стратегий изменения экспрессии генов и белков в уротелии. Здесь описаны методы, которые позволяют исследователям генерировать большое количество аденовируса с высоким титром, который затем может быть использован для трансдукции уротелия грызунов с высокой эффективностью и относительно простым способом. Как кДНК, так и малые интерферирующие РНК могут быть экспрессированы с помощью аденовирусной трансдукции, а влияние экспрессии трансгена на функцию уротелия можно оценить через 12 часов или несколько дней. Эти методы имеют широкое применение для изучения нормальной и аномальной уротелиальной биологии с использованием моделей мышей или крыс.
Introduction
Уротелий представляет собой специализированный эпителий, который выстилает почечную лоханку, мочеточники, мочевой пузырь и проксимальный отделуретры 1. Он состоит из трех слоев: слоя высокодифференцированных и поляризованных, часто двуядерных зонтичных клеток, апикальные поверхности которых омываются мочой; промежуточный клеточный слой с популяцией двуядерных транзитно-амплифицирующих клеток, которые могут давать начало поверхностным зонтичным клеткам в ответ на их острую потерю; и один слой базальных клеток, подмножество которых функционирует как стволовые клетки, которые могут регенерировать весь уротелий в ответ на хроническое повреждение. Зонтичные клетки в основном ответственны за формирование высокорезистентного уротелиального барьера, компоненты которого включают апикальную мембрану (богатую холестерином и цереброзидами) с низкой проницаемостью для воды и растворенных веществ и высокоомистный апикальный соединительный комплекс (состоящий из плотных соединений, адгезивных соединений, десмосом и связанного с ними актомиозинового кольца)1 . Как апикальная поверхность зонтичной клетки, так и ее соединительное кольцо расширяются во время наполнения мочевого пузыря и быстро возвращаются в предварительно заполненное состояние после мочеиспускания 1,2,3,4,5. В дополнение к своей роли в барьерной функции, предполагается также, что уротелий обладает сенсорными и преобразовательными функциями, которые позволяют ему ощущать изменения во внеклеточной среде (например, растяжение) и передавать эту информацию через высвобождение медиаторов (включая АТФ, аденозин и ацетилхолин) в подлежащие ткани, включая субуротелиальные афферентные нервные отростки 6,7,8 . Недавние доказательства этой роли были обнаружены у мышей, у которых отсутствует уротелиальная экспрессия как Piezo1, так и Piezo2, что приводит к изменению функции мочеиспускания9. Кроме того, у крыс, сверхэкспрессирующих порообразующий белок CLDN2 с плотным соединением в зонтичном клеточном слое, развиваются воспаление и боль, аналогичные тем, которые наблюдаются у пациентов с интерстициальным циститом10. Предполагается, что нарушение уротелиальной сенсорной/преобразовательной или барьерной функции может способствовать нескольким заболеваниям мочевого пузыря 6,11.
Лучшее понимание биологии уротелия в нормальных и болезненных состояниях зависит от наличия инструментов, которые позволят исследователям легко подавлять экспрессию эндогенных генов или разрешать экспрессию трансгенов в нативной ткани. В то время как один из подходов к подавлению экспрессии генов заключается в создании условных мышей с нокаутом уротелия, этот подход зависит от наличия мышей с флоксированными аллелями, является трудоемким и может занять от нескольких месяцев донескольких лет. Неудивительно, что исследователи разработали методы трансфекции или трансдукции уротелия, что может привести к результатам в более короткие сроки. Опубликованные методы трансфекции включают использование катионных липидов13, антисмысловых фосфоротиосодержащих олигодеоксинуклеотидов 14 или антисмысловых нуклеиновых кислот, привязанных к 11-мерному пептиду15 белка ТАТ ВИЧ. Тем не менее, основное внимание в этом протоколе уделяется использованию аденовирально-опосредованной трансдукции, хорошо изученной методологии, которая эффективна при доставке генов в широкий спектр клеток, была протестирована в многочисленных клинических испытаниях и совсем недавно использовалась для доставки кДНК, кодирующей капсидный белок COVID-19, реципиентам одного варианта вакцины противCOVID-19 16. 17. Для более подробного описания жизненного цикла аденовируса, аденовирусных векторов и клинического применения аденовирусов читатель направляется к ссылке17.
Важной вехой в использовании аденовирусов для трансдукции уротелия стал отчет Ramesh et al., в котором показано, что короткие предварительные обработки детергентами, включая N-додецил-β-D-мальтозид (DDM), резко усиливают трансдукцию уротелия аденовирусом, кодирующим β-галактозидазу18. Используя это исследование в качестве руководства, аденовирально-опосредованная трансдукция уротелия в настоящее время используется для экспрессии различных белков, включая ГТФазы семейства Rab, факторы обмена гуанин-нуклеотидов, моторные фрагменты миозина, порообразующие плотные соединения, связанные с клаудинами, и ADAM17 10,19,20,21,22 . Тот же подход был адаптирован для экспрессии малых интерферирующих РНК (миРНК), эффекты которых были спасены коэкспрессирующими миРНК-резистентными вариантами трансгена22. Описанный здесь протокол включает в себя общие методы получения больших количеств высококонцентрированного аденовируса, что является требованием для этих методов, а также адаптацию методов Ramesh et al.18 для экспрессии трансгенов в уротелии с высокой эффективностью.
Protocol
Representative Results
Discussion
В то время как Рамеш и др. были сосредоточены на разработке стратегий использования аденовирусной трансдукции в лечении рака мочевого пузыря 18, более поздние отчеты продемонстрировали полезность этих методов для изучения нормальной уротелиальной биологии / физиологии и патофизиолог?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана наградой пилотного проекта через P30DK079307 (для M.G.D.), грантом NIH R01DK119183 (для G.A. и MDC), грантом NIH R01DK129473 (для G.A.), премией Американской ассоциации урологов за развитие карьеры и грантом Фонда Уинтерса (для Н.М.), ядром визуализации клеток и модельных организмов почек Питтсбургского центра исследований почек (P30DK079307), и S10OD028596 (G.A.), который финансировал покупку конфокальной системы, используемой для захвата некоторых изображений, представленных в этой рукописи.
Materials
| 10 mL pipette | Corning Costar (Millipore Sigma) | CLS4488 | sterile, serological pipette, individually wrapped |
| 12 mL ultracentrifuge tube | ThermoFisher | 06-752 | PET thinwall ultracentrifuge tube |
| 15 mL conical centrifuge tube | Falcon (Corning) | 352097 | sterile |
| 18 G needle | BD | 305196 | 18 G x 1.5 in needle |
| 20 mL pipette | Corning Costar (Millipore Sigma) | CLS4489 | sterile, serological pipette, individually wrapped |
| 50 mL conical centrifuge tube | Falcon (Corning) | 352098 | sterile |
| 5 mL pipette | Corning Costar (Millipore Sigma) | CLS4487 | sterile, serological pipette, individually wrapped |
| Cavicide | Henry Schein | 6400012 | Anti-viral solution |
| Cell culture dish – 15 cm | Falcon (Corning) | 353025 | sterile, tissue-culture treated (150 mm x 25 mm dish) |
| Cell scraper | Sarstedt | 893.1832 | handle length 24 cm, blade length 1.7 cm |
| CsCl | Millipore Sigma | C-4306 | Molecular Biology grade ≥ 98% |
| DMEM culture medium (high glucose) | Gibco (ThermoFisher) | 11965092 | with 4.5 g/L glucose + L-glutamine + phenol red |
| EDTA | Millipore Sigma | EDS | Bioiultra grade ≥ 99% |
| Fetal bovine serum | Hyclone (Cytiva) | SH30070.03 | defined serum |
| Glass pipette | Fisher Scientific | 13-678-20A | 5.75 in glass pipette, autoclaved |
| Glycerol | Millipore Sigma | G-5516 | Molecular Biology grade ≥ 99% |
| HEK293 cells | ATCC | CRL-3216 | HEK293T cells are a variant of HEK293 cells that express the SV40 large T-antigen |
| Isoflurane | Covetrus | 29405 | |
| IV catheter – mouse | Smith Medical Jelco | 3063 | 24 G x 3/4 in Safety IV catheter radiopaque |
| IV catheter – rat | Smith Medical Jelco | 3060 | 22 G x 1 in Safety IV catheter radiopaque |
| KCl | Millipore Sigma | P-9541 | Molecular Biology grade ≥ 99% |
| KH2PO4 | Millipore Sigma | P5655 | Cell culture grade ≥ 99% |
| Na2HPO4•7 H2O | Millipore Sigma | 431478 | ≥ 99.99% |
| NaCl | Millipore Sigma | S3014 | Molecular Biology grade ≥ 99% |
| N-dodecyl-β-D-maltoside | Millipore Sigma | D4641 | ≥ 98% |
| Nose cone for multiple animals | custom designed | commercial options include one from Parkland Scientific (RES3200) | |
| PD-10 column | GE Healthcare | 17-085-01 | Prepacked columns filled ith Sephadex G-25M |
| Penicillin/streptomycin antibiotic (100x) | Gibco (ThermoFisher) | 15070063 | 100x concentrated solution |
| Spectrophotometer | Eppendorf | BioPhotometer | |
| Stand and clamp | Fisher Scientific | 14-679Q and 05-769-8FQ | available from numerous suppliers |
| Sterile filter unit | Fisher Scientific (Nalgene) | 09-740-65B | 0.2 µm rapid-flow filter unit (150 mL) |
| Sterile filter unit 0.2 µm (syringe) | Fisher Scientific | SLGV004SL | Millipore Sigma Milex 0.22 µm filter unit that attaches to syringe |
| Super speed centrifuge | Eppendorf | 5810R | with Eppendorf F34-6-38 fixed angle rotor (12,000 rpm) |
| Syringe (1 mL) | BD | 309628 | 1-mL syringe Luer-lok tip – sterile |
| Syringe (3 mL) | BD | 309656 | 3-mL syringe slip tip – sterile |
| Table-top centrifuge (low speed) | Eppendorf | 5702 | with swinging bucket rotor |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | polyethylene 3.4 mL transfer pipette |
| Tris-base | Millipore Sigma | 648310-M | Molecular Biology grade |
| TrypLE select protease solution | Gibco (ThermoFisher) | 12604013 | TrypLE express enzyme (1x), no phenol red |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-80 XP | with Beckman SW41 rotor (41,000 rpm) |
| Vaporizer | General Anesthetic Services, Inc. | Tec 3 | Isoflurane vaporizer |
| Vortex Mixer | VWR | 10153-838 | analog vortex mixer |
Riferimenti
- Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The Urothelium: Life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).
- Truschel, S. T., et al. Stretch-regulated exocytosis/endocytosis in bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 13 (3), 830-846 (2002).
- Lewis, S. A., de Moura, J. L. C. Incorporation of cytoplasmic vesicles into apical membrane of mammalian urinary bladder epthelium. Nature (London). 297 (5868), 685-688 (1982).
- Eaton, A. F., et al. Expansion and contraction of the umbrella cell apical junctional ring in response to bladder filling and voiding. Molecular Biology of the Cell. 30 (16), 2037-2052 (2019).
- Yu, W., Khandelwal, P., Apodaca, G. Distinct apical and basolateral membrane requirements for stretch-induced membrane traffic at the apical surface of bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 20 (1), 282-295 (2009).
- Birder, L., Andersson, K. E. Urothelial signaling. Physiological Reviews. 93 (2), 653-680 (2013).
- Birder, L. A. Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions. Autonomic Neuroscience. 182, 89-94 (2014).
- Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. The uroepithelial-associated sensory web. Kidney International. 72 (9), 1057-1064 (2007).
- Dalghi, M. G., et al. Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception. Journal of Clinical Investigation Insight. 6 (19), 152984 (2021).
- Montalbetti, N., et al. Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis. American Journal of Physiology: Renal Physiology. 309 (12), 1070-1081 (2015).
- Keay, S. K., Birder, L. A., Chai, T. C. Evidence for bladder urothelial pathophysiology in functional bladder disorders. BioMed Research International. 2014, 865463 (2014).
- Friedel, R. H., Wurst, W., Wefers, B., Kuhn, R. Generating conditional knockout mice. Methods in Molecular Biology. 693, 205-231 (2011).
- Kashyap, M., et al. Down-regulation of nerve growth factor expression in the bladder by antisense oligonucleotides as new treatment for overactive bladder. Journal of Urology. 190 (2), 757-764 (2013).
- Bolenz, C., et al. Cellular uptake and ex vivo urothelial penetration by oligodeoxynucleotides for optimizing treatment of transitional cell carcinoma. Analytical and Quantitative Cytology and Histology. 30 (5), 265-273 (2008).
- Tyagi, P., et al. Intravesical antisense therapy for cystitis using TAT-peptide nucleic acid conjugates. Molecular Pharmaceutics. 3 (4), 398-406 (2006).
- Sadoff, J., et al. Interim results of a phase 1-2a trial of Ad26.COV2.S Covid-19 vaccine. New England Journal of Medicine. 384 (19), 1824-1835 (2021).
- Lee, C. S., et al. Adenovirus-mediated gene delivery: Potential applications for gene and cell-Based therapies in the new era of personalized medicine. Genes & Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).
- Ramesh, N., et al. Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium. Molecular Therapy. 10 (4), 697-705 (2004).
- Khandelwal, P., et al. Rab11a-dependent exocytosis of discoidal/fusiform vesicles in bladder umbrella cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15773-15778 (2008).
- Khandelwal, P., Ruiz, W. G., Apodaca, G. Compensatory endocytosis in bladder umbrella cells occurs through an integrin-regulated and RhoA- and dynamin-dependent pathway. The European Molecular Biology Organization journal. 29 (12), 1961-1975 (2010).
- Khandelwal, P., et al. A Rab11a-Rab8a-Myo5B network promotes stretch-regulated exocytosis in bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 24 (7), 1007-1019 (2013).
- Prakasam, H. S., et al. A1 adenosine receptor-stimulated exocytosis in bladder umbrella cells requires phosphorylation of ADAM17 Ser811 and EGF receptor transactivation. Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3798-3812 (2014).
- Gallo, L. I., et al. RAB27B requirement for stretch-induced exocytosis in bladder umbrella cells. American Journal of Physiology Cell Physiology. 314 (3), 349-365 (2018).
- Amasheh, S., et al. Claudin-2 expression induces cation-selective channels in tight junctions of epithelial cells. Journal of Cell Science. 115, 4969-4976 (2002).
- Yu, A. S., et al. Molecular basis for cation selectivity in claudin-2-based paracellular pores: identification of an electrostatic interaction site. The Journal of General Physiology. 133 (1), 111-127 (2009).
- Kasahara, H., Aoki, H. Gene silencing using adenoviral RNAi vector in vascular smooth muscle cells and cardiomyocytes. Methods in Molecular Medicine. 112, 155-172 (2005).
- Bolognesi, B., Lehner, B. Reaching the limit. eLife. 7, 39804 (2018).
- Atasheva, S., Shayakhmetov, D. M. Cytokine responses to adenovirus and adenovirus vectors. Viruses. 14 (5), 888 (2022).
- Sanchez Freire, V., et al. MicroRNAs may mediate the down-regulation of neurokinin-1 receptor in chronic bladder pain syndrome. American Journal of Pathology. 176 (1), 288-303 (2010).
