Uttryck av transgener i ursprungligt urinblåsurotel med adenovirusmedierad transduktion
Summary
Metoder beskrivs för generering av stora mängder rekombinanta adenovirus, som sedan kan användas för att transducera det ursprungliga gnagarurotelet vilket möjliggör uttryck av transgener eller nedreglering av endogena genprodukter.
Abstract
Förutom att bilda en högresistensbarriär antas urotelet som fodrar njurbäckenet, urinledarna, urinblåsan och proximala urinröret känna av och överföra information om sin miljö till de underliggande vävnaderna, vilket främjar tömningsfunktion och beteende. Störning av urotelbarriären, eller dess sensoriska / givarfunktion, kan leda till sjukdom. Att studera dessa komplexa händelser hindras av brist på enkla strategier för att förändra gen- och proteinuttryck i urotelet. Här beskrivs metoder som gör det möjligt för utredare att generera stora mängder adenovirus med hög titer, som sedan kan användas för att transducera gnagareurotel med hög effektivitet och på ett relativt enkelt sätt. Både cDNA och små interfererande RNA kan uttryckas med adenoviral transduktion, och effekten av transgenuttryck på urotelial funktion kan bedömas 12 timmar till flera dagar senare. Dessa metoder har bred tillämpbarhet för studier av normal och onormal urotelbiologi med hjälp av mus- eller råttdjursmodeller.
Introduction
Urotelet är det specialiserade epitelet som leder njurbäckenet, urinledarna, urinblåsan och proximala urinröret1. Den består av tre skikt: ett lager av mycket differentierade och polariserade ofta bi-nukleära paraplyceller, vars apikala ytor badas i urin; Ett intermediärt cellskikt med en population av transitförstärkande bikärnceller som kan ge upphov till ytliga paraplyceller som svar på deras akuta förlust. och ett enda lager av basalceller, varav en delmängd fungerar som stamceller som kan regenerera hela urotelet som svar på kronisk skada. Paraplyceller är huvudsakligen ansvariga för att bilda urotelbarriären med hög resistans, vars komponenter innefattar ett apikalt membran (rikt på kolesterol och cerebrosider) med låg permeabilitet för vatten och lösta ämnen och ett apikalt korsningskomplex med hög resistans (bestående av snäva korsningar, vidhäftande korsningar, desmosomer och en associerad aktomyosinring)1 . Både paraplycellens apikala yta och dess korsningsring expanderar under blåsfyllning och återgår snabbt till sitt förfyllda tillstånd efter tömning 1,2,3,4,5. Förutom sin roll i barriärfunktionen antas urotelet också ha sensoriska och givarfunktioner som gör det möjligt att känna av förändringar i den extracellulära miljön (t.ex. sträcka) och överföra denna information via frisättning av mediatorer (inklusive ATP, adenosin och acetylkolin) till underliggande vävnader, inklusive suburoteliala afferenta nervprocesser 6,7,8 . Nya bevis på denna roll finns hos möss som saknar urotelial uttryck av både Piezo1 och Piezo2, vilket resulterar i förändrad tömningsfunktion9. Dessutom utvecklar råttor som överuttrycker det porbildande proteinet CLDN2 i paraplycellskiktet inflammation och smärta som är analog med den som ses hos patienter med interstitiell cystit10. Det antas att störningar i urotelial sensorisk / givare eller barriärfunktion kan bidra till flera blåsstörningar 6,11.
En bättre förståelse av urotelets biologi i normala och sjukdomstillstånd beror på tillgången på verktyg som gör det möjligt för utredare att lätt nedreglera endogent genuttryck eller möjliggöra uttryck av transgener i den ursprungliga vävnaden. Medan ett tillvägagångssätt för att nedreglera genuttryck är att generera villkorliga uroteliala knockoutmöss, beror detta tillvägagångssätt på tillgången på möss med floxed alleler, är arbetsintensiv och kan ta månader till år att slutföra12. Inte överraskande har utredare utvecklat tekniker för att transfektera eller transducera urotelet, vilket kan leda till resultat på en kortare tidsskala. Publicerade metoder för transfektion inkluderar användning av katjoniska lipider13, anti-sense fosforotierade oligodeoxinukleotider 14 eller antisensnukleinsyror bundna till HIV TAT-proteinpenetrerande 11-merpeptid15. Fokus för detta protokoll ligger dock på användningen av adenoviralmedierad transduktion, en välstuderad metod som är effektiv vid genleverans till ett brett spektrum av celler, har testats i många kliniska prövningar och användes senast för att leverera cDNA som kodar för COVID-19-kapsidproteinet till mottagare av en variant av COVID-19-vaccinet16, 17. För en mer ingående beskrivning av adenovirusets livscykel, adenovirala vektorer och kliniska tillämpningar av adenovirus hänvisas läsaren till referens17.
En viktig milstolpe i användningen av adenovirus för att transducera urotelet var en rapport av Ramesh et al. som visade korta förbehandlingar med tvättmedel, inklusive N-dodecyl-β-D-maltosid (DDM) dramatiskt förbättrad transduktion av urotelet med ett adenovirus som kodar β-galaktosidas18. Med hjälp av denna proof-of-principle-studie som vägledning har adenoviralmedierad transduktion av urotelet nu använts för att uttrycka en mängd olika proteiner, inklusive Rab-familj GTPaser, guanin-nukleotidutbytesfaktorer, myosinmotorfragment, porbildande täta korsningsassocierade kladiner och ADAM17 10,19,20,21,22 . Samma tillvägagångssätt anpassades för att uttrycka små störande RNA (siRNA), vars effekter räddades genom samuttryckande siRNA-resistenta varianter av transgenen22. Protokollet som beskrivs här innehåller allmänna metoder för att generera stora mängder högkoncentrerat adenovirus, ett krav för dessa tekniker, liksom anpassningar av metoderna för Ramesh et al.18 för att uttrycka transgener i urotelet med hög effektivitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Medan Ramesh et al. fokuserade på att utveckla strategier för att använda adenoviral transduktion vid behandling av blåscancer 18, har nyare rapporter visat användbarheten av dessa tekniker för att studera normal urotelial biologi / fysiologi och patofysiologi 10,18,19,20,21 . De viktiga funktionerna i detta tillvägagångssätt i…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av ett pilotprojekt genom P30DK079307 (till M.G.D.), NIH-bidrag R01DK119183 (till G.A. och M.D.C.), NIH-bidrag R01DK129473 (till GA), ett American Urology Association Career Development-pris och ett Winters Foundation-bidrag (till N.M.), av Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores vid Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307), och av S10OD028596 (till G.A.), som finansierade inköpet av konfokalsystemet som användes för att fånga några av de bilder som presenteras i detta manuskript.
Materials
| 10 mL pipette | Corning Costar (Millipore Sigma) | CLS4488 | sterile, serological pipette, individually wrapped |
| 12 mL ultracentrifuge tube | ThermoFisher | 06-752 | PET thinwall ultracentrifuge tube |
| 15 mL conical centrifuge tube | Falcon (Corning) | 352097 | sterile |
| 18 G needle | BD | 305196 | 18 G x 1.5 in needle |
| 20 mL pipette | Corning Costar (Millipore Sigma) | CLS4489 | sterile, serological pipette, individually wrapped |
| 50 mL conical centrifuge tube | Falcon (Corning) | 352098 | sterile |
| 5 mL pipette | Corning Costar (Millipore Sigma) | CLS4487 | sterile, serological pipette, individually wrapped |
| Cavicide | Henry Schein | 6400012 | Anti-viral solution |
| Cell culture dish – 15 cm | Falcon (Corning) | 353025 | sterile, tissue-culture treated (150 mm x 25 mm dish) |
| Cell scraper | Sarstedt | 893.1832 | handle length 24 cm, blade length 1.7 cm |
| CsCl | Millipore Sigma | C-4306 | Molecular Biology grade ≥ 98% |
| DMEM culture medium (high glucose) | Gibco (ThermoFisher) | 11965092 | with 4.5 g/L glucose + L-glutamine + phenol red |
| EDTA | Millipore Sigma | EDS | Bioiultra grade ≥ 99% |
| Fetal bovine serum | Hyclone (Cytiva) | SH30070.03 | defined serum |
| Glass pipette | Fisher Scientific | 13-678-20A | 5.75 in glass pipette, autoclaved |
| Glycerol | Millipore Sigma | G-5516 | Molecular Biology grade ≥ 99% |
| HEK293 cells | ATCC | CRL-3216 | HEK293T cells are a variant of HEK293 cells that express the SV40 large T-antigen |
| Isoflurane | Covetrus | 29405 | |
| IV catheter – mouse | Smith Medical Jelco | 3063 | 24 G x 3/4 in Safety IV catheter radiopaque |
| IV catheter – rat | Smith Medical Jelco | 3060 | 22 G x 1 in Safety IV catheter radiopaque |
| KCl | Millipore Sigma | P-9541 | Molecular Biology grade ≥ 99% |
| KH2PO4 | Millipore Sigma | P5655 | Cell culture grade ≥ 99% |
| Na2HPO4•7 H2O | Millipore Sigma | 431478 | ≥ 99.99% |
| NaCl | Millipore Sigma | S3014 | Molecular Biology grade ≥ 99% |
| N-dodecyl-β-D-maltoside | Millipore Sigma | D4641 | ≥ 98% |
| Nose cone for multiple animals | custom designed | commercial options include one from Parkland Scientific (RES3200) | |
| PD-10 column | GE Healthcare | 17-085-01 | Prepacked columns filled ith Sephadex G-25M |
| Penicillin/streptomycin antibiotic (100x) | Gibco (ThermoFisher) | 15070063 | 100x concentrated solution |
| Spectrophotometer | Eppendorf | BioPhotometer | |
| Stand and clamp | Fisher Scientific | 14-679Q and 05-769-8FQ | available from numerous suppliers |
| Sterile filter unit | Fisher Scientific (Nalgene) | 09-740-65B | 0.2 µm rapid-flow filter unit (150 mL) |
| Sterile filter unit 0.2 µm (syringe) | Fisher Scientific | SLGV004SL | Millipore Sigma Milex 0.22 µm filter unit that attaches to syringe |
| Super speed centrifuge | Eppendorf | 5810R | with Eppendorf F34-6-38 fixed angle rotor (12,000 rpm) |
| Syringe (1 mL) | BD | 309628 | 1-mL syringe Luer-lok tip – sterile |
| Syringe (3 mL) | BD | 309656 | 3-mL syringe slip tip – sterile |
| Table-top centrifuge (low speed) | Eppendorf | 5702 | with swinging bucket rotor |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | polyethylene 3.4 mL transfer pipette |
| Tris-base | Millipore Sigma | 648310-M | Molecular Biology grade |
| TrypLE select protease solution | Gibco (ThermoFisher) | 12604013 | TrypLE express enzyme (1x), no phenol red |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-80 XP | with Beckman SW41 rotor (41,000 rpm) |
| Vaporizer | General Anesthetic Services, Inc. | Tec 3 | Isoflurane vaporizer |
| Vortex Mixer | VWR | 10153-838 | analog vortex mixer |
Riferimenti
- Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The Urothelium: Life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).
- Truschel, S. T., et al. Stretch-regulated exocytosis/endocytosis in bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 13 (3), 830-846 (2002).
- Lewis, S. A., de Moura, J. L. C. Incorporation of cytoplasmic vesicles into apical membrane of mammalian urinary bladder epthelium. Nature (London). 297 (5868), 685-688 (1982).
- Eaton, A. F., et al. Expansion and contraction of the umbrella cell apical junctional ring in response to bladder filling and voiding. Molecular Biology of the Cell. 30 (16), 2037-2052 (2019).
- Yu, W., Khandelwal, P., Apodaca, G. Distinct apical and basolateral membrane requirements for stretch-induced membrane traffic at the apical surface of bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 20 (1), 282-295 (2009).
- Birder, L., Andersson, K. E. Urothelial signaling. Physiological Reviews. 93 (2), 653-680 (2013).
- Birder, L. A. Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions. Autonomic Neuroscience. 182, 89-94 (2014).
- Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. The uroepithelial-associated sensory web. Kidney International. 72 (9), 1057-1064 (2007).
- Dalghi, M. G., et al. Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception. Journal of Clinical Investigation Insight. 6 (19), 152984 (2021).
- Montalbetti, N., et al. Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis. American Journal of Physiology: Renal Physiology. 309 (12), 1070-1081 (2015).
- Keay, S. K., Birder, L. A., Chai, T. C. Evidence for bladder urothelial pathophysiology in functional bladder disorders. BioMed Research International. 2014, 865463 (2014).
- Friedel, R. H., Wurst, W., Wefers, B., Kuhn, R. Generating conditional knockout mice. Methods in Molecular Biology. 693, 205-231 (2011).
- Kashyap, M., et al. Down-regulation of nerve growth factor expression in the bladder by antisense oligonucleotides as new treatment for overactive bladder. Journal of Urology. 190 (2), 757-764 (2013).
- Bolenz, C., et al. Cellular uptake and ex vivo urothelial penetration by oligodeoxynucleotides for optimizing treatment of transitional cell carcinoma. Analytical and Quantitative Cytology and Histology. 30 (5), 265-273 (2008).
- Tyagi, P., et al. Intravesical antisense therapy for cystitis using TAT-peptide nucleic acid conjugates. Molecular Pharmaceutics. 3 (4), 398-406 (2006).
- Sadoff, J., et al. Interim results of a phase 1-2a trial of Ad26.COV2.S Covid-19 vaccine. New England Journal of Medicine. 384 (19), 1824-1835 (2021).
- Lee, C. S., et al. Adenovirus-mediated gene delivery: Potential applications for gene and cell-Based therapies in the new era of personalized medicine. Genes & Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).
- Ramesh, N., et al. Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium. Molecular Therapy. 10 (4), 697-705 (2004).
- Khandelwal, P., et al. Rab11a-dependent exocytosis of discoidal/fusiform vesicles in bladder umbrella cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15773-15778 (2008).
- Khandelwal, P., Ruiz, W. G., Apodaca, G. Compensatory endocytosis in bladder umbrella cells occurs through an integrin-regulated and RhoA- and dynamin-dependent pathway. The European Molecular Biology Organization journal. 29 (12), 1961-1975 (2010).
- Khandelwal, P., et al. A Rab11a-Rab8a-Myo5B network promotes stretch-regulated exocytosis in bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 24 (7), 1007-1019 (2013).
- Prakasam, H. S., et al. A1 adenosine receptor-stimulated exocytosis in bladder umbrella cells requires phosphorylation of ADAM17 Ser811 and EGF receptor transactivation. Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3798-3812 (2014).
- Gallo, L. I., et al. RAB27B requirement for stretch-induced exocytosis in bladder umbrella cells. American Journal of Physiology Cell Physiology. 314 (3), 349-365 (2018).
- Amasheh, S., et al. Claudin-2 expression induces cation-selective channels in tight junctions of epithelial cells. Journal of Cell Science. 115, 4969-4976 (2002).
- Yu, A. S., et al. Molecular basis for cation selectivity in claudin-2-based paracellular pores: identification of an electrostatic interaction site. The Journal of General Physiology. 133 (1), 111-127 (2009).
- Kasahara, H., Aoki, H. Gene silencing using adenoviral RNAi vector in vascular smooth muscle cells and cardiomyocytes. Methods in Molecular Medicine. 112, 155-172 (2005).
- Bolognesi, B., Lehner, B. Reaching the limit. eLife. 7, 39804 (2018).
- Atasheva, S., Shayakhmetov, D. M. Cytokine responses to adenovirus and adenovirus vectors. Viruses. 14 (5), 888 (2022).
- Sanchez Freire, V., et al. MicroRNAs may mediate the down-regulation of neurokinin-1 receptor in chronic bladder pain syndrome. American Journal of Pathology. 176 (1), 288-303 (2010).
