Vurdere endringer i synaptisk plastisitet ved hjelp av en våken lukket hodeskademodell av mild traumatisk hjerneskade

Summary

Her er det demonstrert hvordan en våken lukket hodeskademodell kan brukes til å undersøke effekten av gjentatt mild traumatisk hjerneskade (r-mTBI) på synaptisk plastisitet i hippocampus. Modellen replikerer viktige egenskaper ved r-mTBI hos pasienter og brukes sammen med in vitro elektrofysiologi.

Abstract

Milde traumatiske hjerneskader (mTBI) er et utbredt helseproblem i Nord-Amerika. Det er økende press for å bruke økologisk gyldige modeller av mTBI med lukket hode i preklinisk setting for å øke oversettbarheten til den kliniske populasjonen. Den våkne lukkede hodeskademodellen (ACHI) bruker en modifisert kontrollert kortikal påvirkning for å levere lukket hodeskade, indusere klinisk relevante atferdsunderskudd uten behov for kraniotomi eller bruk av bedøvelse.

Denne teknikken induserer normalt ikke dødsfall, kraniebrudd eller hjerneblødninger, og er mer forenlig med å være en mild skade. Faktisk gjør den milde naturen til ACHI-prosedyren den ideell for studier som undersøker repeterende mTBI (r-mTBI). Økende bevis indikerer at r-mTBI kan resultere i en kumulativ skade som gir atferdssymptomer, nevropatologiske forandringer og nevrodegenerasjon. r-mTBI er vanlig hos ungdom som driver med idrett, og disse skadene oppstår i en periode med robust synaptisk omorganisering og myelinisering, noe som gjør den yngre befolkningen spesielt sårbar for de langsiktige påvirkningene av r-mTBI.

Videre forekommer r-mTBI ved partnervold, en tilstand der det er få objektive screeningtiltak. I disse forsøkene ble synaptisk funksjon vurdert i hippocampus hos unge rotter som hadde opplevd r-mTBI ved hjelp av ACHI-modellen. Etter skadene ble en vevskutter brukt til å lage hippocampusskiver for å evaluere toveis synaptisk plastisitet i hippocampus enten 1 eller 7 dager etter r-mTBI. Samlet sett gir ACHI-modellen forskere en økologisk gyldig modell for å studere endringer i synaptisk plastisitet etter mTBI og r-mTBI.

Introduction

Traumatisk hjerneskade (TBI) er et betydelig helseproblem, med ~ 2 millioner tilfeller i Canada og USA hvert år ^1,2. TBI påvirker alle aldersgrupper og kjønn og har en forekomst som er større enn noen annen sykdom, spesielt inkludert brystkreft, aids, Parkinsons sykdom og multippel sklerose³. Til tross for utbredelsen av TBI, er patofysiologien fortsatt dårlig forstått, og behandlingsalternativene er begrensede. Delvis skyldes dette at 85% av alle TBI er klassifisert som milde (mTBI), og mTBI har tidligere blitt antatt å produsere bare begrensede og forbigående atferdsendringer uten langsiktige nevropsykiatriske konsekvenser ^4,5. Det er nå anerkjent at mTBI-gjenoppretting kan ta uker til år^5,6, utløse mer alvorlige nevrologiske tilstander^4, og at selv gjentatte “sub-concussive” påvirkninger påvirker hjernen⁷. Dette er alarmerende ettersom idrettsutøvere i idretter som hockey/fotball har >10 hjernerystelser per kamp/treningsøkt 7,8,9,10.

Ungdom har den høyeste forekomsten av mTBI, og i Canada vil omtrent en av 10 tenåringer søke medisinsk hjelp for en sportsrelatert hjernerystelse årlig^11,12. I virkeligheten kan enhver sub-hjernerystende hodepåvirkning eller mTBI forårsake diffus skade på hjernen, og dette kan også skape en mer sårbar tilstand for påfølgende skader og / eller mer alvorlige nevrologiske tilstander 13,14,15,16,17. I Canada er det anerkjent juridisk via Rowans lov at tidligere skade kan øke hjernens sårbarhet for ytterligere skade¹⁸, men mekanistisk forståelse av r-mTBI forblir sørgelig utilstrekkelig. Det er imidlertid klart at single og r-mTBI kan påvirke læringskapasiteten i løpet av skoleårene 19,20, ha kjønnsspesifikke utfall 21,22,23,2 ⁴, og svekke kognitiv kapasitet senere i livet^16,25,26. Faktisk forbinder kohortanalyser sterkt r-mTBI tidlig i livet med demens senere på^27,28. r-mTBI er også potensielt assosiert med kronisk traumatisk encefalopati (CTE), som er preget av akkumulering av hyperfosforylert tau-protein og progressiv kortikal atrofi og utfelt av signifikant betennelse 27,29,30,31. Selv om koblingene mellom r-mTBI og CTE for tiden er kontroversielle³², vil denne modellen tillate dem å bli utforsket mer detaljert i en preklinisk setting.

En mTBI blir ofte beskrevet som en “usynlig skade”, da den forekommer i en lukket skalle og er vanskelig å oppdage selv med moderne bildebehandlingsteknikker^33,34. En nøyaktig eksperimentell modell av mTBI bør følge to prinsipper. Først bør den rekapitulere de biomekaniske kreftene som normalt observeres i den kliniske populasjonen³⁵. For det andre bør modellen indusere heterogene atferdsutfall, noe som også er svært utbredt i kliniske populasjoner^36,37,38. For tiden har flertallet av prekliniske modeller en tendens til å være mer alvorlige, og involverer kraniotomi, stereotaktisk hodestøtte, anestesi og kontrollerte kortikale påvirkninger (CCI) som gir betydelig strukturell skade og mer omfattende atferdsunderskudd enn normalt observert klinisk³³. En annen bekymring med mange prekliniske modeller for hjernerystelse som involverer kraniotomier, er at denne prosedyren i seg selv skaper betennelse i hjernen, og dette kan forverre mTBI-symptomer og nevropatologi fra enhver senere skade^39,40. Anestesi introduserer også flere komplekse forstyrrelser, inkludert reduksjon av betennelse 41,42,43, modulerende mikroglialfunksjon⁴⁴, glutamatfrigivelse 45, Ca²⁺ inngang gjennom NMDA-reseptorer 46^, intrakranielt trykk og cerebral metabolisme ⁴⁷. Anestesi introduserer videre forstyrrelser ved å øke blod-hjernebarrieren (BBB) permeabilitet, tau-hyperfosforylering og kortikosteroidnivåer, samtidig som kognitiv funksjon reduseres 48,49,50,51. I tillegg representerer diffuse, lukkede hodeskader de aller fleste kliniske mTBIs⁵². De tillater også en å bedre studere de mange faktorene som kan påvirke atferdsutfall, inkludert kjønn²¹, alder 53, inter-skadeintervall¹⁵, alvorlighetsgrad⁵⁴ og antall skader²³.

Retningen av de akselererende / retardative kreftene (vertikal eller horisontal) er også en viktig faktor for atferdsmessige og molekylære utfall. Forskning fra Mychasiuk og kolleger har sammenlignet to modeller av diffus lukket hodet mTBI: vektfall (vertikale krefter) og lateral påvirkning (horisontale krefter)⁵⁵. Både atferdsmessige og molekylære analyser viste heterogene modell- og kjønnsavhengige utfall etter mTBI. Dermed er dyremodeller som bidrar til å unngå kirurgiske prosedyrer, samtidig som de inkorporerer lineære og rotasjonskrefter, mer representative for de fysiologiske forholdene under hvilke disse skadene normalt forekommer^33,56. ACHI-modellen ble opprettet som svar på dette behovet, noe som muliggjør rask og reproduserbar induksjon av mTBI hos rotter samtidig som man unngår prosedyrer (dvs. anestesi) som er kjent for å skjevhet kjønnsforskjeller⁵⁷.

Protocol

Godkjenning for alle dyreprosedyrer ble gitt av University of Victoria Animal Care Committee i samsvar med Canadian Council on Animal Care (CCAC) standarder. Alle hannrotter av Long-Evans ble avlet internt eller kjøpt (se materialfortegnelsen). 1. Bolig- og avlsforhold La dyrene akklimatisere seg til sitt boligmiljø i 1 uke før avvenning på barseldagen (PND) 21. Hold rottene i standard burhus ved 22,5 °C ± 2,5 °C, med ad libitum<…

Representative Results

Den våkne lukkede hodeskademodellen er en levedyktig metode for å indusere r-mTBI hos unge rotter. Rotter utsatt for r-mTBI med ACHI-modellen viste ikke åpenbare atferdsunderskudd. Emner i disse forsøkene viste ikke latens til høyre eller apné på noe tidspunkt under r-mTBI-prosedyren, noe som indikerer at dette faktisk var en mild TBI-prosedyre. Subtile atferdsforskjeller dukket opp i NAP; Som beskrevet ovenfor ble rottene skåret på fire sensorimotoriske oppgaver (skremmerespons, lemforlengelse, strålegang og r…

Discussion

Det meste av preklinisk forskning har benyttet modeller av mTBI som ikke rekapitulerer de biomekaniske kreftene som er sett i den kliniske populasjonen. Her vises det hvordan ACHI-modellen kan brukes til å indusere r-mTBI hos unge rotter. Denne lukkede modellen av r-mTBI har betydelige fordeler i forhold til mer invasive prosedyrer. For det første forårsaker ACHI normalt ikke kraniefrakturer, hjerneblødninger eller dødsfall, som alle vil være kontraindikasjoner av en “mild” TBI i kliniske populasjoner<sup class="xr…

Materials

3D-printed helment			Designed and constructed by Christie laboratory (See Specifications in Christie et al. (2019), Current Protocols in Neuroscience)
Agarose	Fisher Scientific (BioReagents)	BP160500
Anesthesia chamber	Home Made	N/A	Plexiglass Container
Automatic Heater Controller	Warner Electric	TC-324B
Axon Digidata	Molecular Devices	1440A	Low-noise Data Acquisition System
Balance beam			Can be constructed or purchased (100 cm long x 2 cm wide x 0.75 cm thick)
Calcium Chloride	Bio Basic Canada Inc.	CD0050	For aCSF
Camera	Dage MTI	NC-70
Carbogen tank	Praxair	MM OXCD5C-K	Carbon Dioxide 5%, Oxygen 95%
Clampex Software	Molecular Devices	Clampex 10.5 Version
Compresstome Vibrating Microtome	Precisionary	VF 310-0Z
Concentric Bipolar Electrode	FHC Inc.	CBAPC75
Dextrose (D-Glucose)	Fisher Scientific (Chemical)	D16-3	aCSF
Digital Stimulus Isolation Amplifier	Getting Instruments, Inc.	Model 4D
Disodium Phosphate	Fisher Scientific (Chemical)	S373-500	PBS
Dissection Tools
Feather Double Edge Blade	Electron Microscopy Sciences	72002-10
Filter Paper	Whatman 1	1001-055
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-1000
Hair Claw Clip			Can be obtained from any department store
Home and Recovery Cages			Normal rat cages from animal care unit.
Hum Bug Noise Eliminator	Quest Scientific	726300
Isoflurane USP	Fresenius Kabi	CP0406V2
Isotemp 215 Digital Water Bath	Fisher Scientific	15-462-15
Leica Impact One CCI unit	Leica Biosystems		Tip is modified to hold 7mm rubber impact tip
Long-Evans rats, male	Charles River Laboratories (St. Constant, PQ)
Low-Density Foam Pad			3" polyurethane foam sheet
Magnesium Chloride	Fisher Scientific (Chemical)	M33-500	aCSF
Male Long Evans Rats	Charles River Laboratories		Animals ordered from Charles River Laboratories, or pups bred at the University of Victoria
MultiClamp 700B Amplifier	Molecular Devices	Model 700B
pH Test Strips	VWR Chemicals BDH	BDH83931.601
Potassium Chloride	Fisher Scientific (Chemical)	P217-500	aCSF, PBS
Potassium Phosphate	Sigma	P9791-500G	PBS
Push Button Controller	Siskiyou Corporation	MC1000e	Four-axis Closed Loop Controller Push-Button
Sample Discs	ELITechGroup	SS-033	For use with Vapor Pressure Osmometer
Small towel
Sodium Bicarbonate	Fisher Scientific (Chemical)	S233-500	aCSF
Sodium Chloride	Fisher Scientific (Chemical)	S271-3	For aCSF, PBS
Sodium Phosphate	Fisher Scientific (Chemical)	S369-500	aCSF
Soft Plastic Restraint Cones	Braintree Scientific	model DC-200
Stopwatch			Many lab members use their iPhone for this
Table or large cart with raised edges			For NAP and ACHI
Thin Wall Borosilicate Glass (with Filament)	Sutter Instrument	BF150-110-10	Outside diameter: 1.5 mm; Inside diameter: 1.10 mm; Length: 10 cm
Upright Microscope	Olympus	Olympus BX5OWI	5x MPlan 0.10 NA Objective lens
Vapor Pressure Osmometer	Vapro	Model 5600	aCSF should be 300-310 mOSM
Vetbond Tissue Adhesive	3M	1469SB
Vibraplane Vibration Isolation Table	Kinetic Systems	9101-01-45