Avaliação das Alterações na Plasticidade Sináptica Utilizando um Modelo de Traumatismo Cranioencefálico Leve

Summary

Aqui, é demonstrado como um modelo de traumatismo cranioencefálico fechado acordado pode ser usado para examinar os efeitos do traumatismo cranioencefálico leve repetido (r-mTBI) na plasticidade sináptica no hipocampo. O modelo replica características importantes do r-mTBI em pacientes e é usado em conjunto com a eletrofisiologia in vitro .

Abstract

Lesões cerebrais traumáticas leves (TCEm) são um problema de saúde prevalente na América do Norte. Há uma pressão crescente para utilizar modelos ecologicamente válidos de TCEm de cabeça fechada no contexto pré-clínico para aumentar a traduzibilidade para a população clínica. O modelo de lesão com cabeça fechada em vigília (ACHI) utiliza um impactor cortical controlado modificado para realizar o traumatismo cranioencefálico fechado, induzindo déficits comportamentais clinicamente relevantes sem a necessidade de craniotomia ou uso de anestésico.

Essa técnica normalmente não induz fatalidades, fraturas cranianas ou hemorragias cerebrais, e é mais consistente por ser uma lesão leve. De fato, a natureza leve do procedimento ACHI o torna ideal para estudos que investigam TCEm repetitivo (r-mTBI). Evidências crescentes indicam que o r-mTBI pode resultar em uma lesão cumulativa que produz sintomas comportamentais, alterações neuropatológicas e neurodegeneração. O r-mTBI é comum em jovens praticantes de esportes, e essas lesões ocorrem durante um período de robusta reorganização sináptica e mielinização, tornando a população mais jovem particularmente vulnerável às influências de longo prazo do r-mTBI.

Além disso, o r-mTBI ocorre em casos de violência por parceiro íntimo, uma condição para a qual há poucas medidas objetivas de rastreamento. Nesses experimentos, a função sináptica foi avaliada no hipocampo em ratos juvenis que haviam experimentado r-mTBI usando o modelo ACHI. Após as lesões, um fatiador de tecido foi utilizado para fazer cortes no hipocampo para avaliar a plasticidade sináptica bidirecional no hipocampo em 1 ou 7 dias após o r-mTBI. Em geral, o modelo ACHI fornece aos pesquisadores um modelo ecologicamente válido para estudar mudanças na plasticidade sináptica após mTBI e r-mTBI.

Introduction

O traumatismo cranioencefálico (TCE) é um importante problema de saúde, com ~2 milhões de casos no Canadá e nos Estados Unidos a cada ano ^1,2. O TCE afeta todas as faixas etárias e gêneros e tem uma taxa de incidência maior do que qualquer outra doença, incluindo câncer de mama, AIDS, doença de Parkinson e esclerose múltipla³. Apesar da prevalência do TCE, sua fisiopatologia permanece pouco compreendida e as opções de tratamento são limitadas. Em parte, isso ocorre porque 85% de todos os TCEs são classificados como leves (mTBI), e acredita-se que o mTBI produza apenas mudanças comportamentais limitadas e transitórias, sem consequências neuropsiquiátricas de longo^prazo4,5. Atualmente, reconhece-se que a recuperação do TCEm pode levar de semanas a^anos5,6, precipitar quadros neurológicos mais graves⁴ e que mesmo repetidos impactos “subconcussivos” afetam o cérebro⁷. Isso é alarmante, pois atletas de esportes como hóquei/futebol têm >10 impactos subconcussivos na cabeça por jogo/sessão de treino7,8,9,10.

Os adolescentes têm a maior incidência de TCEm e, no Canadá, cerca de um em cada 10 adolescentes procura atendimento médico por concussão relacionada ao esporte^{anualmente 11,12}. Na realidade, qualquer impacto subconcussivo da cabeça ou TCEm pode causar danos difusos ao cérebro, e isso também poderia criar um estado mais vulnerável para lesões subsequentes e/ou condições neurológicas mais graves 13,14,15,16,17. No Canadá, é reconhecido legalmente pela lei de Rowan que lesões prévias podem aumentar a vulnerabilidade do cérebro a novas lesões¹⁸, mas a compreensão mecanicista do r-mTBI permanece lamentavelmente inadequada. Está claro, no entanto, que o TCEm único e o r-mTBI podem afetar a capacidade de aprendizagem durante os anos^{escolares 19,20}, ter resultados específicos por sexo 21,22,23,2 ⁴ e prejudicar a capacidade cognitiva mais tarde na vida^16,25,26. De fato, análises de coorte associam fortemente o r-mTBI no início da vida com demência mais tarde^27,28. O r-mTBI também está potencialmente associado à encefalopatia traumática crônica (ETC), que é caracterizada pelo acúmulo de proteína tau hiperfosforilada e atrofia cortical progressiva e precipitada por inflamação significativa 27,29,30,31. Embora as ligações entre r-mTBI e CTE sejam atualmente controversas³², esse modelo permitirá que elas sejam exploradas em maior detalhe em um cenário pré-clínico.

O TCEm é frequentemente descrito como uma “lesão invisível”, pois ocorre dentro de um crânio fechado e é difícil de detectar mesmo com técnicas modernas de imagem^33,34. Um modelo experimental preciso de TCEm deve aderir a dois princípios. Primeiramente, deve-se recapitular as forças biomecânicas normalmente observadas na população clínica³⁵. Em segundo lugar, o modelo deve induzir desfechos comportamentais heterogêneos, algo que também é altamente prevalente em populações clínicas^36,37,38. Atualmente, a maioria dos modelos pré-clínicos tende a ser mais grave, envolvendo craniotomia, apoio cefálico estereotáxico, anestesia e impactos corticais controlados (ICC), que produzem danos estruturais significativos e déficits comportamentais mais extensos do que normalmente observados clinicamente³³. Outra preocupação com muitos modelos pré-clínicos de concussão que envolvem craniotomias é que esse procedimento em si cria inflamação no cérebro, e isso pode exacerbar os sintomas de TCEm e neuropatologia de qualquer lesão subsequente^39,40. A anestesia também introduz vários fatores de confusão complexos, incluindo a redução da inflamação 41,42,43, modulação da função microglial 44, liberação de glutamato⁴⁵, entrada de Ca²⁺ através dos receptores NMDA 46^, pressão intracraniana e metabolismo cerebral ⁴⁷. A anestesia ainda introduz fatores de confusão, aumentando a permeabilidade da barreira hematoencefálica (BHE), a hiperfosforilação da tau e os níveis de corticosteroides, enquanto reduz a função cognitiva 48,49,50,51. Além disso, lesões difusas fechadas de cabeça representam a grande maioria dos TCEm clínicos⁵². Eles também permitem estudar melhor a multiplicidade de fatores que podem influenciar os desfechos comportamentais, incluindo sexo²¹, idade 53, intervalo interlesão¹⁵, gravidade⁵⁴ e número de lesões²³.

A direção das forças acelerativas/desacelerativas (verticais ou horizontais) também é uma consideração importante para os resultados comportamentais e moleculares. Pesquisas de Mychasiuk e colaboradores compararam dois modelos de TCEm difuso de cabeça fechada: queda de peso (forças verticais) e impacto lateral (forças horizontais)⁵⁵. Tanto a análise comportamental quanto a molecular revelaram desfechos heterogêneos dependentes do modelo e do sexo após o TCEm. Assim, modelos animais que ajudam a evitar procedimentos cirúrgicos, ao mesmo tempo em que incorporam forças lineares e rotacionais, são mais representativos das condições fisiológicas sob as quais essas lesões normalmente ocorrem^33,56. O modelo ACHI foi criado em resposta a essa necessidade, permitindo a indução rápida e reprodutível de TCEm em ratos, evitando procedimentos (i.e., anestesia) que sabidamente enviesam as diferenças entre os^{sexos 57}.

Protocol

A aprovação para todos os procedimentos com animais foi fornecida pelo Comitê de Cuidados com Animais da Universidade de Victoria em conformidade com as normas do Conselho Canadense de Cuidados com Animais (CCAC). Todos os ratos machos Long-Evans foram criados internamente ou comprados (veja a Tabela de Materiais). 1. Condições de alojamento e de reprodução Permitir que os animais se aclimatem ao seu ambiente de alojamento por 1 semana antes d…

Representative Results

O modelo de traumatismo cranioencefálico fechado acordado é um método viável de indução de r-mTBI em ratos jovens. Ratos expostos ao r-mTBI com o modelo ACHI não apresentaram déficits comportamentais evidentes. Os indivíduos nesses experimentos não apresentaram latência para direita ou apneia em nenhum momento durante o procedimento de r-mTBI, indicando que este foi realmente um procedimento de TCE leve. Diferenças comportamentais sutis emergiram no PNA; Como descrito acima, os ratos foram pontuados em quatro…

Discussion

A maioria das pesquisas pré-clínicas tem utilizado modelos de TCEm que não recapitulam as forças biomecânicas observadas na população clínica. Aqui, mostra-se como o modelo ACHI pode ser usado para induzir r-mTBIs em ratos juvenis. Esse modelo fechado de r-mTBI apresenta vantagens significativas em relação aos procedimentos mais invasivos. Primeiro, o IHAC normalmente não causa fraturas cranianas, hemorragias cerebrais ou mortes, o que seria contraindicação de TCE “leve” em populações clínicas<sup class="…

Materials

3D-printed helment			Designed and constructed by Christie laboratory (See Specifications in Christie et al. (2019), Current Protocols in Neuroscience)
Agarose	Fisher Scientific (BioReagents)	BP160500
Anesthesia chamber	Home Made	N/A	Plexiglass Container
Automatic Heater Controller	Warner Electric	TC-324B
Axon Digidata	Molecular Devices	1440A	Low-noise Data Acquisition System
Balance beam			Can be constructed or purchased (100 cm long x 2 cm wide x 0.75 cm thick)
Calcium Chloride	Bio Basic Canada Inc.	CD0050	For aCSF
Camera	Dage MTI	NC-70
Carbogen tank	Praxair	MM OXCD5C-K	Carbon Dioxide 5%, Oxygen 95%
Clampex Software	Molecular Devices	Clampex 10.5 Version
Compresstome Vibrating Microtome	Precisionary	VF 310-0Z
Concentric Bipolar Electrode	FHC Inc.	CBAPC75
Dextrose (D-Glucose)	Fisher Scientific (Chemical)	D16-3	aCSF
Digital Stimulus Isolation Amplifier	Getting Instruments, Inc.	Model 4D
Disodium Phosphate	Fisher Scientific (Chemical)	S373-500	PBS
Dissection Tools
Feather Double Edge Blade	Electron Microscopy Sciences	72002-10
Filter Paper	Whatman 1	1001-055
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-1000
Hair Claw Clip			Can be obtained from any department store
Home and Recovery Cages			Normal rat cages from animal care unit.
Hum Bug Noise Eliminator	Quest Scientific	726300
Isoflurane USP	Fresenius Kabi	CP0406V2
Isotemp 215 Digital Water Bath	Fisher Scientific	15-462-15
Leica Impact One CCI unit	Leica Biosystems		Tip is modified to hold 7mm rubber impact tip
Long-Evans rats, male	Charles River Laboratories (St. Constant, PQ)
Low-Density Foam Pad			3" polyurethane foam sheet
Magnesium Chloride	Fisher Scientific (Chemical)	M33-500	aCSF
Male Long Evans Rats	Charles River Laboratories		Animals ordered from Charles River Laboratories, or pups bred at the University of Victoria
MultiClamp 700B Amplifier	Molecular Devices	Model 700B
pH Test Strips	VWR Chemicals BDH	BDH83931.601
Potassium Chloride	Fisher Scientific (Chemical)	P217-500	aCSF, PBS
Potassium Phosphate	Sigma	P9791-500G	PBS
Push Button Controller	Siskiyou Corporation	MC1000e	Four-axis Closed Loop Controller Push-Button
Sample Discs	ELITechGroup	SS-033	For use with Vapor Pressure Osmometer
Small towel
Sodium Bicarbonate	Fisher Scientific (Chemical)	S233-500	aCSF
Sodium Chloride	Fisher Scientific (Chemical)	S271-3	For aCSF, PBS
Sodium Phosphate	Fisher Scientific (Chemical)	S369-500	aCSF
Soft Plastic Restraint Cones	Braintree Scientific	model DC-200
Stopwatch			Many lab members use their iPhone for this
Table or large cart with raised edges			For NAP and ACHI
Thin Wall Borosilicate Glass (with Filament)	Sutter Instrument	BF150-110-10	Outside diameter: 1.5 mm; Inside diameter: 1.10 mm; Length: 10 cm
Upright Microscope	Olympus	Olympus BX5OWI	5x MPlan 0.10 NA Objective lens
Vapor Pressure Osmometer	Vapro	Model 5600	aCSF should be 300-310 mOSM
Vetbond Tissue Adhesive	3M	1469SB
Vibraplane Vibration Isolation Table	Kinetic Systems	9101-01-45