सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया में अगुणित की संभोग क्षमता का निर्धारण
Summary
इस काम में, खमीर सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया में संभोग दक्षता की मात्रा का ठहराव करने के लिए एक मजबूत विधि का वर्णन किया गया है। यह विधि विशेष रूप से प्रजातिकरण अध्ययनों में पूर्व-युग्मक बाधाओं की मात्रा का ठहराव करने के लिए उपयोगी है।
Abstract
सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया आनुवंशिकी , विकास और आणविक जीव विज्ञान में एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला मॉडल जीव है। हाल के वर्षों में, यह प्रजातिकरण से संबंधित समस्याओं का अध्ययन करने के लिए एक लोकप्रिय मॉडल जीव भी बन गया है। खमीर के जीवन चक्र में अलैंगिक और यौन प्रजनन चरण दोनों शामिल हैं। विकास प्रयोगों को करने में आसानी और जीव की छोटी पीढ़ी का समय प्रजनन बाधाओं के विकास के अध्ययन की अनुमति देता है। जिस दक्षता के साथ दो संभोग प्रकार (ए और α) ए / α द्विगुणित बनाने के लिए संभोग करते हैं, उसे संभोग दक्षता के रूप में जाना जाता है। अगुणित के बीच संभोग दक्षता में कोई भी कमी एक पूर्व-युग्मक बाधा को इंगित करती है। इस प्रकार, दो अगुणित के बीच प्रजनन अलगाव की सीमा को निर्धारित करने के लिए, संभोग दक्षता को निर्धारित करने के लिए एक मजबूत विधि की आवश्यकता होती है। इस अंत में, एक सरल और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत किया गया है। प्रोटोकॉल में चार मुख्य चरण शामिल हैं, जिसमें वाईपीडी प्लेट पर अगुणित को पैच करना, अगुणित को समान संख्या में मिलाना, एकल कॉलोनियों के लिए पतला और चढ़ाना और अंत में, ड्रॉप-आउट प्लेट पर कॉलोनियों की संख्या के आधार पर दक्षता की गणना करना शामिल है। ऑक्सोट्रोफिक मार्करों को स्पष्ट रूप से अगुणित और द्विगुणित के बीच अंतर करने के लिए नियोजित किया जाता है।
Introduction
सैकरोमाइसेस सेरेविसिया, जिसे आमतौर पर नवोदित खमीर कहा जाता है, एक एककोशिकीय यूकेरियोट है। इसमें दो संभोग प्रकार हैं, ए और α, और अलैंगिक और यौन प्रजनन चक्र दोनों प्रदर्शित करता है। ए और α संभोग प्रकार अगुणित होते हैं और आसपास के वातावरण में अन्य संभोग प्रकार की अनुपस्थिति में माइटोटिक रूप से विभाजित हो सकते हैं, जो खमीर के अलैंगिक चक्र का प्रतिनिधित्व करता है। जब दो संभोग प्रकार निकटता में होते हैं, तो वे माइटोटिक रूप से विभाजित करना बंद कर देते हैं और एक द्विगुणित कोशिका बनाने के लिए फ्यूज होते हैं। द्विगुणित खमीर या तो माइटोटिक रूप से विभाजित हो सकता है जब पोषक तत्व मौजूद होते हैं या एक खराब कार्बन स्रोत की उपस्थिति में नाइट्रोजन भुखमरी की स्थितियों के तहत अर्धसूत्रीविभाजन से गुजर सकते हैं जो गैर-किण्वित है, जैसे कि एसीटेट1। इसके परिणामस्वरूप बीजाणुओं का निर्माण होता है, जो अनुकूल विकास की स्थिति होने तक निष्क्रिय रहते हैं। जीवन चक्र तब पूरा होता है जब ये बीजाणु अंकुरित होते हैं और दो अगुणित प्रकार अगुणित पूल 2,3 (चित्रा 1) में वापस जारी किए जाते हैं।
खमीर कोशिकाओं के संभोग में कई चरण शामिल हैं, जैसे कि एग्लूटीनेशन, एक संभोग प्रक्षेपण या “शमू” का गठन, इसके बाद सेल और परमाणु संलयन 4,5। संभोग शुरू करने के लिए दो संभोग प्रकार ए और α क्रमशः ए-फैक्टर और α-फैक्टर का उत्पादन करते हैं। ये कारक पॉलीपेप्टाइड फेरोमोन हैं जो विपरीत संभोग प्रकार5 की कोशिका सतह पर मौजूद रिसेप्टर्स (स्टे 2 और स्टे 3) से बंधते हैं। रिसेप्टर्स के लिए फेरोमोन का बंधन फेरोमोन प्रतिक्रिया मार्ग, माइटोजन-सक्रिय प्रोटीन काइनेज (एमएके) सिग्नल ट्रांसडक्शन मार्ग 6,7,8 शुरू करता है। इसके परिणामस्वरूप जी 1 चरण में कोशिका चक्र की गिरफ्तारी होती है, जिससे चयापचय रूप से सक्रिय स्थिर चरण9 होता है। कोशिकाएं तब माइटोटिक रूप से विभाजित करना बंद कर देती हैं, और संभोग के लिए आवश्यक प्रोटीन संश्लेषित होते हैं। चूंकि अगुणित कोशिकाएं एक-दूसरे की ओर नहीं बढ़ सकती हैं, इसलिए एक संभोग प्रक्षेपण या “शमू” को संभोग साथी की ओर निर्देशित किया जाता है। जब कोशिकाएं संपर्क में आती हैं, तो कोशिका भित्ति खराब हो जाती है, और साइटोप्लाज्मिक सामग्री फ्यूज हो जाती है, जिसके परिणामस्वरूप एक द्विगुणित कोशिका10,11 बनाने के लिए संभोग होता है। अगुणित के बीच संभोग दक्षता का उपयोग प्रयोगशाला-विकसित उपभेदों में प्रजातिकरण के माप के रूप में किया गया है, साथ ही साथ मौजूदा प्रजातियों12 के बीच भी किया गया है।
एक साधारण यूकेरियोटिक जीव होने के नाते, खमीर जटिल यूकेरियोटिक जीवों से जुड़े बड़ी संख्या में शोध प्रश्नों के लिए पसंद का मॉडल है। ऐसा ही एक प्रश्न प्रजातिकरण और प्रजनन बाधाओं के विकास से जुड़ा हुआ है13,14. यौन प्रजनन करने वाले जीवों के लिए, एक प्रजाति को अर्न्स्ट मायर15 द्वारा प्रस्तावित जैविक प्रजाति अवधारणा (बीएससी) द्वारा परिभाषित किया गया है। इस अवधारणा के अनुसार, एक आबादी के दो व्यक्तियों को दो अलग-अलग प्रजातियों से संबंधित कहा जाता है यदि वे इंटरब्रीड नहीं कर सकते हैं और प्रजनन रूप से अलग हैं। यौन प्रजनन चक्र का टूटना (जिसमें युग्मनज बनाने के लिए युग्मकों का संलयन शामिल है, एक संतान में युग्मनज का विकास, और संतान में यौन परिपक्वता की प्राप्ति) प्रजनन अलगाव की ओर जाता है। जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है, एस सेरेविसिया का जीवन चक्र यौन प्रजनन चक्र के बराबर है: ए) दो संभोग प्रकारों ए और α का संलयन यौन प्रजनन जीवों में युग्मकों के संलयन के समान है; बी) माइटोटिक विभाजन से गुजरने के लिए द्विगुणित की क्षमता संतान में विकसित होने वाले युग्मनज के बराबर है; और ग) स्पोरुलेशन से गुजरने वाला द्विगुणित युग्मकजनन की प्रक्रिया के बराबर है।
पूर्व-युग्मक अलगाव तब होता है जब संभोग देखा जाता है। आनुवंशिक रूप से भिन्न दो प्रकारों के साथ संभोग करने का समान अवसर दिया जाता है , एक α प्रकार अधिमानतः एक के साथ दूसरे के साथ संभोग करता है या इसके विपरीत14। विकास प्रयोगों के मामले में जिसमें विभिन्न वातावरणों में अगुणित विकसित हुए हैं, एक संभोग परख का प्रदर्शन करके पूर्व-संभोग बाधा की उपस्थिति निर्धारित की जा सकती है। पूर्वज की तुलना में संभोग दक्षता में कमी एक पूर्व-संभोग बाधा के विकास को इंगित करती है। पोस्ट-जाइगोटिक अलगाव द्विगुणित की अक्षमता के कारण उत्पन्न हो सकता है जो प्रभावी माइटोटिक विभाजन से गुजरने में असमर्थता और / या अगुणित बीजाणुओंको बनाने के लिए स्पोरुलेशन करता है। इन्हें क्रमशः द्विगुणित की वृद्धि दर को मापकर और स्पोरुलेशन दक्षता की गणना करके निर्धारित किया जा सकता है। इसलिए, प्रजनन बाधाओं के विकास का अध्ययन करने के लिए, (ए) संभोग दक्षता, (बी) द्विगुणित की माइटोटिक वृद्धि, और (सी) द्विगुणित की स्पोरुलेशन दक्षता को निर्धारित करने के लिए मजबूत तरीकों की आवश्यकता होती है। इस काम में, खमीर उपभेदों की संभोग दक्षता को निर्धारित करने के लिए एक मजबूत विधि की सूचना दी गई है।
प्रयोगशाला प्रयोगों में, संभोग की घटना का पता लगाने के तरीकों में से एक ऑक्सोट्रोफिक मार्करों का उपयोग करके है जो पोषण संबंधी आवश्यकताओं के पूरक हैं। जब दो संभोग प्रकार दो अलग-अलग अमीनो एसिड के लिए ऑक्सोट्रोफिक होते हैं, तो केवल दो संभोग प्रकारों के संलयन द्वारा गठित द्विगुणित कोशिका दोनों अमीनो एसिड में कमी वाले माध्यम पर बढ़ सकती है। इस प्रकार, ऑक्सोट्रोफिक मार्कर गुणात्मक और मात्रात्मक रूप से संभोग का पता लगाने के लिए उपयोगी हैं। अर्धसूत्रीविभाजन16 के बाद तनाव के संभोग प्रकार की पहचान करने के लिए एक गुणात्मक परीक्षण पर्याप्त होगा। मात्रात्मक परीक्षण आवश्यक हैं जब कोई संभोग मार्ग17,18 में शामिल जीन का अध्ययन करते समय संभोग में कमी की पहचान करने में रुचि रखता है। इसके अलावा, प्रजातिकरण अध्ययनों में खमीर का तेजी से उपयोग किया जा रहा है, एक सुविधाजनक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य संभोग परख आवश्यक है, क्योंकि संभोग दक्षता का परिमाणीकरण पूर्व-युग्मक बाधा का एक उपाय है।
दो खमीर संभोग प्रकारों के बीच संभोग दक्षता को पहले 16,19,20 निर्धारित किया गया है। पहले इस्तेमाल किए गए अधिकांश तरीके अपने डिजाइन में कुछ विविधताओं के साथ समान हैं 16,21,22,23,24,25। उनमें से कुछ प्रारंभिक लॉग चरण संस्कृतियों का उपयोग करते हैं, जबकि कुछ अन्य अगुणित उपभेदों के मध्य-लॉग चरण संस्कृतियों का उपयोग करते हैं। उन अनुपातों में भिन्नताएं हैं जिनमें दो संभोग प्रकार मिश्रित होते हैं। लगभग सभी प्रोटोकॉल एक नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली का उपयोग करते हैं। पहले से उगाई गई संस्कृतियों से लिए गए दोनों संभोग प्रकारों के निलंबन को वाईपीडी प्लेट पर रखे नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली पर मिश्रित और फ़िल्टर किया जाता है। प्रोटोकॉल की विविधताओं में से एक में, अगुणित निलंबन को सीधे वाईपीडी प्लेट21 पर पैच किया जाता है। दो संभोग प्रकारों के फेरोमोन उत्पादन में शामिल जीन से निपटने वाले प्रयोगों में, फेरोमोन को बाहरी रूप से जोड़ा जाता है जबकि दो संभोग प्रकार24 के निलंबन होते हैं।
अगुणित मिश्रण के बाद कुछ घंटों (आमतौर पर लगभग 5 घंटे) के लिए इनक्यूबेशन के बाद, कोशिकाओं को झिल्ली से धोया जाता है, पतला किया जाता है, और चयनात्मक मीडिया पर चढ़ाया जाता है। 1973 में रिपोर्ट की गई पहले की विधियों में से एक में, युग्मनज गठन या संभोग की दक्षता की गणना हेमोसाइटोमीटर26 का उपयोग करके माइक्रोस्कोप के तहत बुडेड कोशिकाओं, अनब्यूडेड कोशिकाओं और संभोग जोड़े की संख्या की गणना करके की गई थी। हालांकि, बाद में रिपोर्ट किए गए अधिकांश तरीके अगुणित और द्विगुणित को अलग करने के लिए ऑक्सोट्रोफिक मार्करों का उपयोग करते हैं। संभोग दक्षता की गणना सेलुलर पूल 16,21,23 में द्विगुणित और अगुणित कोशिकाओं की संख्या के सापेक्ष द्विगुणित कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में की जाती है।
हालांकि, प्रजातिकरण का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल जीव के रूप में खमीर का उपयोग करने वाली कई रिपोर्टों के बावजूद, संभोग की दक्षता की गणना के लिए अब तक साहित्य में कोई मानकीकृत प्रोटोकॉल नहीं है। लॉग चरण में कोशिकाएं संभोग दक्षता की मात्रा का ठहराव के लिए आदर्श नहीं हो सकती हैं। संभोग के दौरान, दो अगुणित के कोशिका चक्र को गिरफ्तार किया जाता है, और इसलिए, संभोग के दौरान कोशिकाएं9 विभाजित नहीं होती हैं। चूंकि सेल चक्र को स्थिर चरण27 में कोशिकाओं में इसी तरह गिरफ्तार करने के लिए भी जाना जाता है, ऐसी कोशिकाओं का उपयोग प्रोटोकॉल को अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य बना सकता है। स्थिर चरण कोशिकाओं को संभोग के लिए वाईपीडी प्लेटों (यानी, पोषण समृद्ध वातावरण) पर मिश्रित और रखा जा सकता है। पारंपरिक प्रक्रियाओं में नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली और कोशिकाओं को धोने की भी आवश्यकता होती है, जिससे प्रक्रिया बोझिल हो जाती है और त्रुटियों को संभालने के लिए उत्तरदायी हो जाती है। इसके अलावा, आज तक उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल एक अगुणित के संदर्भ में संभोग दक्षता को मापते हैं। हालांकि, प्रजनन अलगाव को मापते समय, संभोग दक्षता को एकल अगुणित के बजाय अगुणित के एक विशेष संयोजन के लिए निर्धारित किया जाता है।
इन मुद्दों को हल करने के लिए, यहां, हम खमीर में संभोग दक्षता की मात्रा का ठहराव करने के लिए एक मजबूत विधि की रिपोर्ट करते हैं जो अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और उपयोग करने में आसान है। इसके अलावा, इस विधि और यहां नियोजित खमीर उपभेदों का उपयोग संभोग बाधाओं के विकास पर जीन प्रवाह के प्रभाव की जांच करने वाले अध्ययनों में भी किया जा सकता है।
इस अध्ययन में एस सेरेविसिया के दो अलग-अलग उपभेदों का उपयोग किया गया था। उपभेदों में से एक एसके 1 पृष्ठभूमि से लिया गया है; यह हमारी प्रयोगशाला में एमएटी लोकस के पास ऑक्सोट्रोफिक मार्करों को जोड़कर संशोधित किया गया था। अगुणित के परिणामी जीनोटाइप तालिका 1 28,29,30 में प्रदान किए गए हैं। एसके 1 स्ट्रेन में, एक अगुणित में एमएटी लोकस के पास टीआरपी 1 जीन डाला गया था, और α अगुणित में एलईयू 2 जीन मैट लोकस के पास डाला गया था। एससीएएम स्ट्रेन में, टीआरपी 1 और यूआरए 3 जीन क्रमशः ए और α अगुणित में डाले गए थे। सम्मिलन का स्थान क्रोमोसोम III के ARS क्षेत्र में था (Chr III: 197378..197609)। यहां रिपोर्ट किए गए प्रोटोकॉल के लिए, जीनोम पर कहीं भी ऑक्सोट्रोफिक मार्कर पर्याप्त होंगे। हालांकि, एमएटी लोकस के पास ऑक्सोट्रोफिक मार्कर होने का मतलब है कि इन उपभेदों का उपयोगप्रजातिकरण 31,32 पर जीन प्रवाह के प्रभाव की जांच करने वाले अध्ययनों के लिए भी किया जा सकता है। पुनर्संयोजन के कारण मार्करों के फेरबदल को रोकने के लिए मार्करों को एमएटी लोकस के करीब जोड़ा गया था। इसलिए, इस प्रोटोकॉल का उपयोग प्रजातिकरण से जुड़े अध्ययनों में संभोग दक्षता को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है और संभोग मार्ग में शामिल प्रोटीन का अध्ययन करते समय संभोग दक्षता के परिवर्तन की पहचान करने के लिए भी किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
संभोग मार्गों में शामिल जीन से संबंधित अध्ययन करने या संभोग व्यवहार पर बाहरी वातावरण के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एस सेरेविसिया में संभोग दक्षता का परिमाणीकरण आवश्यक है। पिछले दो दशकों में, एस…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस कार्य को डीबीटी/वेलकम ट्रस्ट (इंडिया एलायंस) अनुदान (आईए/एस/19/2/504632) द्वारा वित्त पोषित किया गया था, जो डीबीटी/वेलकम ट्रस्ट (इंडिया एलायंस) अनुदान (आईए/एस/19/2/504632) द्वारा समर्थित एक रिसर्च फेलो है। एएम को वैज्ञानिक और औद्योगिक अनुसंधान परिषद (सीएसआईआर), भारत सरकार द्वारा एक वरिष्ठ रिसर्च फेलो (09/087 (0873)/2017-ईएमआर-आई) के रूप में समर्थित किया गया है। लेखक चर्चा के लिए पाइके जयदेव भट को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| Adenine | Sigma Life Science | A8626 | |
| Agar Powder regular grade for bacteriology | SRL | 19661 (0140186) | |
| Ammonium Sulphate, Hi-AR | HiMedia | GRM1273 | |
| D-(+)-glucose | Sigma Life Science | G8270 | |
| Glass Petri plates | HiMedia | PW008 | 90 mm x 15 mm dimension |
| L-Arginine | Sigma Life Science | A8094 | |
| L-Aspartic acid | Sigma Life Science | A7219 | |
| L-Histidine monochloride monohydrate | Sigma Life Science | H5659 | |
| L-Isoleucine | Sigma Aldrich | I2752 | |
| L-Leucine | Sigma Life Science | L8912 | |
| L-Lysine | Aldrich | 62840 | |
| L-Methionine | Sigma Life Science | M5308 | |
| L-Phenylalanine | Sigma Life Science | P5482 | |
| L-Threonine | Sigma Aldrich | T8625 | |
| L-Tyrosine | Sigma Life Science | T8566 | |
| L-Valine | Sigma Life Science | V0513 | |
| Mating efficiency grid | 1 cm x 1.5 cm rectangular grid drawn on the Petri plate | ||
| Microcentrifuge tubes | Tarsons | 500010 | |
| Peptone | HiMedia | RM001 | |
| Uracil | Sigma Life Science | U0750 | |
| Yeast Extract Powder | HiMedia | RM027 | |
| Yeast Nitrogen Base w/o Amino acids and Ammonium Sulphate | BD Difco | 233520 |
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