Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

קביעת יעילות ההזדווגות של הפלואידים ב-Saccharomyces cerevisiae

Published: December 2, 2022 doi: 10.3791/64596
Automatic Translation
*1,2, *1, 1
1Department of Chemical Engineering, Indian Institute of Technology Bombay, 2Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of Michigan, Ann Arbor
* These authors contributed equally

Summary

בעבודה זו מתוארת שיטה חזקה לכימות יעילות ההזדווגות בשמרים Saccharomyces cerevisiae . שיטה זו שימושית במיוחד לכימות מחסומים קדם-זיגוטיים במחקרי התמיינות.

Abstract

Saccharomyces cerevisiae הוא אורגניזם מודל נפוץ בגנטיקה, אבולוציה וביולוגיה מולקולרית. בשנים האחרונות, הוא הפך גם אורגניזם מודל פופולרי ללמוד בעיות הקשורות speciation. מחזור החיים של שמרים כולל הן שלבי רבייה א-מיניים והן שלבי רבייה מינית. קלות ביצוע ניסויי האבולוציה וזמן הדור הקצר של האורגניזם מאפשרים לחקור את האבולוציה של מחסומי רבייה. היעילות שבה שני סוגי ההזדווגות (a ו-α) מזדווגים כדי ליצור את הדיפלואיד a/α מכונה יעילות ההזדווגות. כל ירידה ביעילות ההזדווגות בין הפלואידים מצביעה על מחסום קדם-זיגוטי. לכן, כדי לכמת את מידת בידוד הרבייה בין שני הפלואידים, נדרשת שיטה חזקה לכימות יעילות ההזדווגות. לשם כך מוצג כאן פרוטוקול פשוט וניתן לשחזור. הפרוטוקול כולל ארבעה שלבים עיקריים, הכוללים תיקון הפלואידים על צלחת YPD, ערבוב הפלואידים במספרים שווים, דילול וציפוי למושבות בודדות, ולבסוף חישוב היעילות בהתבסס על מספר המושבות על צלחת נשירה. סמנים אוקסוטרופיים משמשים כדי לעשות בבירור את ההבחנה בין הפלואידים לדיפלואידים.

Introduction

שמרי אפייה (Saccharomyces cerevisiae), הנקראים בדרך כלל שמרים ניצנים, הם אאוקריוט חד-תאי. יש לו שני סוגי הזדווגות, A ו- α, והוא מציג מחזורי רבייה א-מיניים ומיניים. סוגי ההזדווגות a ו-α הם הפלואידים ויכולים להתחלק באופן מיטוטי בהיעדר סוג ההזדווגות האחר בסביבה, המייצג את המחזור הא-מיני של שמרים. כאשר שני סוגי ההזדווגות נמצאים בסמיכות, הם מפסיקים להתחלק באופן מיטוטי ומתמזגים ליצירת תא דיפלואידי. השמרים הדיפלואידים יכולים להתחלק באופן מיטוטי כאשר קיימים חומרים מזינים או לעבור מיוזה בתנאים של רעב חנקן בנוכחות מקור פחמן דל שאינו ניתן לתסיסה, כגון אצטט1. התוצאה היא היווצרות נבגים, אשר נשארים רדומים עד שיש תנאי צמיחה נוחים. מחזור החיים מושלם כאשר הנבגים האלה נובטים, ושני סוגי ההפלואידים משתחררים חזרה לבריכה הפלואידית 2,3 (איור 1).

ההזדווגות של תאי שמרים כוללת מספר שלבים, כגון agglutination, היווצרות היטל הזדווגות או "shmoo", ואחריו תאים והיתוך גרעיני 4,5. שני סוגי ההזדווגות a ו-α מייצרים גורם A ו-α-factor, בהתאמה, כדי ליזום הזדווגות. גורמים אלה הם פרומונים פוליפפטידים הנקשרים לקולטנים (Ste2 ו- Ste3) הנמצאים על פני התא של סוג ההזדווגות הנגדי5. קשירת הפרומונים לקולטנים מתחילה את מסלול תגובת הפרומון, מסלול העברת האותקינאז המופעל על ידי מיטוגן (MAPK) 6,7,8. התוצאה היא עצירה של מחזור התא בשלב G1, מה שמוביל לשלבנייח פעיל מטבולית 9. התאים מפסיקים להתחלק באופן מיטוטי, והחלבונים הדרושים להזדווגות מסונתזים. מכיוון שהתאים ההפלואידים אינם יכולים לנוע זה לעבר זה, השלכת הזדווגות או "שמו" מכוונת כלפי בן הזוג המזדווג. כאשר התאים באים במגע, דופן התא מתפרקת, והתוכן הציטופלזמי מתמזג, וכתוצאה מכך מזדווג ליצירת תא דיפלואידי10,11. יעילות ההזדווגות בין הפלואידים שימשה כמדד לדגימה בזנים שפותחו במעבדה, כמו גם בין מינים קיימים12.

בהיותם אורגניזם איקריוטי פשוט, שמרים הם מודל הבחירה למספר רב של שאלות מחקר הקשורות לאורגניזמים איקריוטים מורכבים. שאלה אחת כזו קשורה לספקולציה ולאבולוציה של מחסומי רבייה13,14. עבור אורגניזמים המתרבים מינית, מין מוגדר על ידי מושג המין הביולוגי (BSC) המוצע על ידי ארנסט מאייר15. על פי תפיסה זו, שני פרטים באוכלוסייה אמורים להשתייך לשני מינים שונים אם הם אינם יכולים להתרבות זה עם זה והם מבודדים מבחינה רבייה. פירוק מחזור הרבייה המינית (הכולל מיזוג של גמטות ליצירת זיגוטה, התפתחות הזיגוטה לצאצא והשגת בגרות מינית בצאצאים) מוביל לבידוד הרבייה. כפי שניתן לראות באיור 1, מחזור החיים של S. cerevisiae דומה למחזור הרבייה המינית: א) האיחוי של שני סוגי ההזדווגות a ו-α דומה לאיחוי של גמטות באורגניזמים המתרבים מינית; ב) יכולתו של הדיפלואיד לעבור חלוקה מיטוטית שקולה להתפתחות הזיגוטה לצאצאים; ג) הדיפלואיד העובר נבג דומה לתהליך של גמטוגנזה14.

בידוד טרום זיגוטי מתרחש כאשר נצפתה הזדווגות אסורטיבית. בהינתן הזדמנות שווה להזדווג עם שני טיפוסים שונים גנטית, סוג α מעדיף להזדווג עם אחד על פני השני או להיפך14. במקרה של ניסויי אבולוציה שבהם הפלואידים התפתחו בסביבות שונות, ניתן לקבוע את נוכחותו של מחסום טרום הזדווגות על ידי ביצוע בדיקת הזדווגות. ירידה ביעילות ההזדווגות בהשוואה לאב הקדמון מצביעה על התפתחות מחסום טרום הזדווגות. בידוד פוסט-זיגוטי עלול להיווצר עקב חוסר היכולת של הדיפלואיד לעבור חלוקה מיטוטית יעילה ו/או נבגים ליצירת נבגים הפלואידים14. אלה ניתנים לכימות על ידי מדידת קצב הצמיחה של הדיפלואידים וחישוב יעילות הנבג, בהתאמה. לפיכך, כדי לחקור את האבולוציה של מחסומי הרבייה, נדרשות שיטות חזקות לכימות (א) יעילות ההזדווגות, (ב) הצמיחה המיטוטית של הדיפלואיד, ו-(ג) יעילות הנבג של הדיפלואיד. בעבודה זו מדווחת שיטה חזקה לכימות יעילות ההזדווגות של זני שמרים.

בניסויי מעבדה, אחת הדרכים שבהן ניתן לזהות את התרחשות ההזדווגות היא באמצעות סמנים אוקסוטרופיים המשלימים את הדרישות התזונתיות. כאשר שני סוגי ההזדווגות הם אוקסוטרופיים עבור שתי חומצות אמינו שונות, רק התא הדיפלואידי שנוצר על ידי איחוי של שני סוגי ההזדווגות יכול לגדול על מדיום חסר בשתי חומצות האמינו. לפיכך, סמנים auxotrophic שימושיים לזיהוי הזדווגות הן איכותית והן כמותית. בדיקה איכותנית תספיק כדי לזהות את סוג ההזדווגות של זן לאחר מיוזה16. בדיקות כמותיות חיוניות כאשר מעוניינים לזהות ירידה בהזדווגות תוך לימוד הגנים המעורבים במסלול ההזדווגות17,18. בנוסף, כאשר שמרים נמצאים בשימוש הולך וגובר במחקרי התמיינות, יש צורך בבדיקת הזדווגות נוחה וניתנת לשחזור, שכן כימות יעילות ההזדווגות הוא מדד למחסום הקדם-זיגוטי.

יעילות ההזדווגות בין שני סוגי השמרים כומתה בעבר16,19,20. רוב השיטות בשימוש בעבר דומות בעיצוב שלהם עם כמה וריאציות16,21,22,23,24,25. חלקם משתמשים בתרביות בשלב היומן המוקדם, בעוד שאחרים משתמשים בתרביות בשלב הביניים של זנים הפלואידים. ישנן וריאציות ביחסים שבהם שני סוגי ההזדווגות מעורבים. כמעט כל הפרוטוקולים משתמשים בקרום ניטרוצלולוז. תרחיפים של שני סוגי ההזדווגות שנלקחו מתרבויות שגודלו בעבר מעורבבים ומסוננים על קרום ניטרוצלולוז המונח על צלחת YPD. באחת הווריאציות של הפרוטוקול, המתלה הפלואידי מודבק ישירות על לוחית YPD21. בניסויים העוסקים בגנים המעורבים בייצור הפרומונים של שני סוגי ההזדווגות, מוסיפים את הפרומונים באופן חיצוני תוך ביצוע ההשעיות של שני סוגי ההזדווגות24.

לאחר הדגירה במשך מספר שעות (בדרך כלל סביב 5 שעות) לאחר ערבוב ההפלואידים, התאים נשטפים מהממברנה, מדוללים ומצופים על מדיה סלקטיבית. באחת השיטות המוקדמות יותר שדווחו בשנת 1973, היעילות של היווצרות זיגוטה או הזדווגות חושבה על ידי ספירת מספר התאים הניצנים, תאים ללא ניצנים וזוגות הזדווגות תחת מיקרוסקופ באמצעות המוציטומטר26. עם זאת, רוב השיטות שדווחו מאוחר יותר משתמשות בסמנים אוקסוטרופיים כדי להבחין בין הפלואידים לדיפלואידים. יעילות ההזדווגות מחושבת כאחוז התאים הדיפלואידים ביחס למספר התאים הדיפלואידים וההפלואידים במאגר התאי 16,21,23.

עם זאת, למרות מספר דיווחים המשתמשים בשמרים כאורגניזם מודל לחקר התמיינות, עד כה לא דווח בספרות פרוטוקול סטנדרטי לחישוב יעילות ההזדווגות. תאים בשלב היומן עשויים שלא להיות אידיאליים לכימות יעילות ההזדווגות. במהלך ההזדווגות, מחזור התאים של שני הפלואידים נעצר, ולכן התאים במהלך ההזדווגות אינם מתחלקים9. מכיוון שמחזור התא ידוע גם ככזה שנעצר באופן דומה בתאים בשלב27 הנייח, שימוש בתאים כאלה יכול להפוך את הפרוטוקול ליותר ניתן לשחזור. ניתן לערבב תאי פאזה נייחים ולפרוס אותם על לוחות YPD (כלומר, סביבה עשירה מבחינה תזונתית) לצורך הזדווגות. ההליכים הקונבנציונליים דורשים גם קרום ניטרוצלולוז ושטיפת התאים, מה שהופך את התהליך למסורבל ועלול להתמודד עם טעויות. בנוסף, הפרוטוקולים ששימשו עד כה מכמתים את יעילות ההזדווגות במונחים של הפלואיד אחד. עם זאת, בעת מדידת בידוד הרבייה, יעילות ההזדווגות מכומתת עבור שילוב מסוים של הפלואידים ולא עבור הפלואיד יחיד.

כדי להתמודד עם בעיות אלה, אנו מדווחים כאן על שיטה חזקה לכימות יעילות ההזדווגות בשמרים שהיא מאוד ניתנת לשחזור וקלה לשימוש. יתר על כן, שיטה זו וזני השמרים המשמשים כאן יכולים לשמש גם במחקרים הבוחנים את השפעת זרימת הגנים על האבולוציה של מחסומי הזדווגות.

במחקר זה נעשה שימוש בשני זנים שונים של S. cerevisiae. אחד הזנים נגזר מרקע SK1; זה שונה במעבדה שלנו על ידי הוספת הסמנים auxotrophic ליד מוקד MAT. הגנוטיפים המתקבלים של הפלואידים מוצגים בטבלה 128,29,30. בזן SK1, בהפלואיד הוכנס הגן TRP1 ליד מוקד ה-MAT, ובהפלואיד α הוכנס הגן LEU2 ליד מוקד ה-MAT. בזן ה-Scam הוכנסו הגנים TRP1 ו-URA3 להפלואידים a ו-α, בהתאמה. מיקום ההחדרה היה באזור ARS של כרומוזום III (Chr III: 197378..197609). עבור הפרוטוקול המדווח כאן, סמנים אוקסוטרופיים בכל מקום בגנום יספיקו. עם זאת, הימצאות הסמנים האוקסוטרופיים ליד מוקד MAT פירושה כי זנים אלה יכולים לשמש גם למחקרים הבוחנים את ההשפעה של זרימת גנים על speciation31,32. הסמנים נוספו קרוב למוקד MAT כדי למנוע ערבוב מחדש של הסמנים עקב רקומבינציה. לפיכך, פרוטוקול זה יכול לשמש לכימות יעילות ההזדווגות במחקרים הכוללים ספקולציה וגם כדי לזהות את השינוי ביעילות ההזדווגות כאשר חוקרים את החלבונים המעורבים במסלול ההזדווגות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: הפרוטוקול כולל באופן כללי את השלבים הבאים: (1) תיקון ההפלואידים ברשתות יעילות ההזדווגות על צלחת YPD, (2) ערבוב ההפלואידים במספרים שווים לאחר דגירה של 24 שעות ומתן מספר שעות להפלואידים המעורבים להזדווג (7 שעות במחקר זה), (3) ציפוי התאים המעורבים ב- YPD לבידוד מושבות בודדות לאחר 7 שעות ב- 30 מעלות צלזיוס, ולבסוף, (4) קביעת מספר הדיפלואידים שנוצרו באמצעות הסמנים האוקסוטרופיים. שלבים אלה יידונו בפירוט להלן (ראו גם איור 2).

1. תיקון הפלואידים ברשתות יעילות ההזדווגות

  1. החיו את הפלואידים A ו-α ממלאי המקפיא על ידי פסים על צלחת אגר YPD (2% אגר, 2% דקסטרוז, 1% פפטון, 0.5% תמצית שמרים), ואפשרו להם לגדול במשך 48 שעות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס כדי להשיג מושבות בודדות מבודדות.
  2. יש לחסן מושבות בודדות מצלחת ה-YPD ב-5 מ"ל של מדיום YPD (2% דקסטרוז, 1% פפטון, 0.5% תמצית שמרים), ולדגור ב-30°C במשך 48 שעות עם רעידות של 250 סל"ד. התאים נמצאים בשלב נייח של צמיחה לאחר תקופת דגירה זו.
  3. ציירו רשת יעילות הזדווגות על צלחת YPD טרייה. ציירו את הרשת כמלבן בגודל 1 ס"מ x 1.5 ס"מ המחולק לשלוש קופסאות כך שלכל אחת מהן מידות של 1 ס"מ x 0.5 ס"מ, כפי שמוצג באיור 2A.
  4. טלאי 5 μL של תרבית YPD של שני סוגי ההזדווגות במלבן השמאלי והימני ביותר (איור 2B). נפח זה מתאים בערך 5 x 105 תאים הפלואידים המונחים בכל קטע. לדגור את הצלחות במשך 24 שעות ב 30 ° C.
    הערה: מטרת הרשת היא להפוך את מדדי הניסוי למדויקים (כגון מספר התאים בניסוי). גודל הרשת קטן מספיק כדי שניתן יהיה לשלוף אותו באופן ניסיוני, אך גדול מספיק כדי שניתן יהיה לתפעל אותו בקלות (כמו הרמת תאים מרשת) ולא יהיה רגיש להיסחפות או לאירועים מקריים.

2. ערבוב של הפלואידים והזדווגות

הערה: לאחר 24 שעות (איור 2C), מספר שווה של תאים משני סוגי ההפלואידים מגרדים משתי הרשתות, מעורבבים ומונחים במלבן המרכזי (איור 2D).

  1. על מנת לערבב מספר שווה של תאים, יש להסיר כ-1/3 מהמדבקה שהונחה בקופסאות החיצוניות באמצעות קיסם סטרילי, ולהשהות מחדש ב-20 מיקרוליטר מים בבקבוקון סטרילי של 1.5 מ"ל לכל אחד מההפלואידים.
  2. לדלל 5 μL של השעיה זו ב 2 מ"ל של מים. מדוד את OD של מתלה מדולל זה באמצעות ספקטרופוטומטר ב 600 ננומטר. ערבב מספר שווה של תאים משני הזנים, בהתבסס על ערך OD ומספר תאים/מ"ל ב- OD אחד עבור זן מסוים זה. חשב את הנפח הדרוש לערבוב, ושואף אותו מ -15 μL הנותרים של ההשעיה הפלואידית הבודדת.
    הערה: מספר התאים המתוקנים במלבן המרכזי הוא כזה שהתאים יוצרים חד-שכבתי. בהתחשב בתא השמרים ככדור ברדיוס של 2.58 מיקרומטר33, קופסה מלבנית של 1 ס"מ x 0.5 ס"מ תזדקק לכ 1.7 x 106 תאים כדי ליצור חד-שכבתי. יש להקפיד לוודא שאין מגע פיזי בין התאים המזווגים לבין שתי רשתות התאים ההפלואידים. מכיוון שיש לערבב מספרים שווים של כל סוג של תאים הפלואידים, מתווספים 8.5 x 105 תאים מכל זן. מספר התא מחושב בהתבסס על מדידות OD, בהתחשב בכך ש- OD אחד ב- 600 ננומטר שווה ערך בקירוב ל- 1 x 107 תאים34. לדוגמה, אם OD600 של תרחיף הפלואידי הוא 0.17 וזה של הפלואיד α הוא 0.11, ניתן לחשב את מספר התאים ב- 5 μL של כל תרחיף הפלואידי. כדי להבטיח 8.5 x 105 תאים מכל סוג הפלואידים, 1.25 μL של הפלואיד ו 1.93 μL של α מתלים haploid מעורבים.
  3. מוסיפים את הנפחים הנדרשים של שני ההפלואידים בבקבוקון טרי וסטרילי של 1.5 מ"ל, ומערבבים היטב באמצעות פיפטה. הנפח הסופי של מתלה זה הוא בדרך כלל סביב 6-8 μL. תקן מתלה זה ברשת המרכזית. דגרו על הצלחת בטמפרטורה של 30°C במשך 7 שעות, מה שמאפשר להפלואידים מספיק זמן להזדווג (איור 2E).

3. ציפוי תאים מעורבים על אגר YPD

  1. לאחר תקופת הדגירה של 7 שעות, לגרד את התאים מן המלבן המרכזי באמצעות קיסם או קצה פיפטה, לדלל 2 מ"ל של מים סטריליים. לאחר מכן, מרחו את תרחיף התאים על אגר YPD כדי להשיג מושבות בודדות. כדי לקבוע את גורם הדילול הדרוש להשגת מושבות בודדות, למדוד את OD של הצינור הראשון שבו תאים גרוטים מתווספים. יש לקבוע גורמי דילול ספציפיים עבור כל סוג תא / זן הנמצא בשימוש.
    הערה: לדוגמה, OD600 של 0.15 מתאים ל- 3 x 106 תאים בהשעיה של 2 מ"ל (בהתחשב בכך ש- OD אחד = 1 x 107 תאים/מ"ל). כדי להשיג כמה מאות מושבות על צלחת YPD, מתלה התא מדולל סדרתית בשעה 1:20 פעמיים, ולאחר מכן 100 μL של הדילול הסופי משמש להתפשטות.
  2. לאחר הציפוי, לדגור על לוחות YPD ב 30 ° C במשך 36-48 שעות עד שיש מושבות בודדות. ודאו שבכל ניסוי הזדווגות מתקבלות כמה מאות מושבות בודדות לצורך סינון, כדי להבטיח שניתן יהיה לזהות מובהקות סטטיסטית בנתונים (איור 2F).

4. בדיקת דיפלואידים באמצעות סמנים אוקסוטרופיים

  1. לקבוע איזה חלק של המושבות המתקבלות הן דיפלואידיות. כדי לזהות את המושבות הדיפלואידיות על הצלחת, העבירו את המושבות הבודדות על-ידי הדבקתן בנפרד על צלחת נשירה כפולה (2% גלוקוז, 0.66% בסיס חנקן, 0.05% תערובת חומצות אמינו נשירה כפולה ו-2% אגר) חסרות את חומצות האמינו שהזנים הם אוקסוטרופיים עבורן, כפי שמוצג באיור 2G. לדגור את הצלחות ב 30 ° C במשך 48 שעות.
    הערה: ניתן להעביר את המושבות גם ללוח הנשירה הכפול באמצעות ציפוי העתק. במחקר זה נעשה שימוש במדיום הנשירה של טריפטופן ולאוצין (trp− leu−) בעת כימות יעילות ההזדווגות של זני SK1AM, וטריפטופן ואורציל (trp− ura−) מדיום נשירה שימש עבור זני ScAM. רק המושבות הדיפלואידיות גדלות על צלחת הנשירה הכפולה מכיוון שיש להן את שני הסמנים האוקסוטרופיים: הגנים TRP1 ו- LEU2 בזני SK1AM והגנים TRP1 ו- URA3 בזני ScAM.
  2. בנוסף, פסים או העתקים את לוחות המושבות על מדיה אחת נושרת (trp− או leu− או ura−) כדי לכמת את התדירות של כל אחד משני סוגי הפלואיד באוכלוסייה.
  3. חשב את יעילות ההזדווגות, η, באופן הבא:
    Equation 1Eq (1)
    כאשר מספר ההפלואידים שהזדווגו שווה פשוט לכפול ממספר הדיפלואידים שזוהו על לוחית הנשירה הכפולה (שכן כל דיפלואיד נוצר כתוצאה מהזדווגות של שני הפלואידים). המספר הכולל של הפלואידים שווה לסכום של מספר הפלואידים הפסים בתוספת פי שניים ממספר הדיפלואידים המפוספסים.
    הערה: לדוגמה, אם רק 60 מושבות גדלות לאחר ציפוי פסים/העתקים של 100 מושבות על מצע נשירה כפול, ניתן לכמת את יעילות ההזדווגות כ-75% (מכיוון ש-60 x 2 הפלואידים הזדווגו כדי ליצור את 60 הדיפלואידים, ו-40 הפלואידים לא הזדווגו).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כימות יעילות ההזדווגות של שני סוגי ההזדווגות
הפרוטוקול המתואר כאן שימש לכימות יעילות ההזדווגות בין שני זני שמרים – בין SK1AM a ל-SK1AM α ובין ScAMa ל-Scamα (איור 3A). בניסויים אלה, ההזדווגות בין שני הפלואידים חזרה על עצמה לפחות 12 פעמים. בכל אחת מהחזרות של הניסוי, לפחות 100 מושבות היו מפוספסות על מדיה נשירה כפולה. חוסנו של הפרוטוקול איפשר בידול קל של יעילות ההזדווגות בין שני הזנים, SK1AM ו-ScAM. בעוד שזני SK1 הזדווגו עם יעילות גבוהה מאוד, זני ה-ScAM הזדווגו עם נצילות נמוכה יחסית (איור 3A). זה אולי לא מפתיע, שכן זני Scam מקורם בהזדווגות היברידית בין הזנים S. cerevisiae ו- S. carlsbergensis 35.

בנוסף להבחנה בין יעילות ההזדווגות בין הזנים, שיטה זו יכולה לשמש גם לכימות ההבדלים ביעילות ההזדווגות של הזנים בסביבות שונות. כפי שניתן לראות באיור 3B, יעילות ההזדווגות של זני ScAM ירדה באופן משמעותי כאשר הסביבה לא הכילה גלוקוז כמקור פחמן עיקרי. הזדווגות היא תהליך יקר מבחינה אנרגטית, וצמיחה על מקורות פחמן חלופיים מפחיתה איכותית את יעילות ההזדווגות.

דינמיקה של יעילות הזדווגות
יכולת החזרה הגבוהה של השיטה מאפשרת גם לעקוב אחר הדינמיקה של יעילות ההזדווגות. כאשר הרשו לנו להזדווג לפרקי זמן שונים (איור 3C), לא נצפתה הזדווגות במשך 4-5 השעות הראשונות; הדיפלואידים הראשונים הופיעו רק לאחר פרק זמן זה. יש להניח שזהו הזמן הדרוש להשלמת תהליך ההזדווגות בסביבה הנתונה. לאחר מכן, יעילות ההזדווגות עלתה במהירות. עם זאת, מעבר ל-7 שעות, חישובי יעילות ההזדווגות מושפעים מהעובדה שצמיחה מיטוטית מתחילה להתרחש על הצלחת. זיהוי ובחירה של דיפלואידים מוקדמים או מאוחרים בדרך זו יכולים לאפשר תכנון של ניסויים שמטרתם לפתח הזדווגות מהירה או מאוחרת בין הפלואידים. הזמן המדויק שבו יעילות ההזדווגות מגיעה לשיאה משתנה עבור כל זן. לדוגמה, באמצעות קינטיקה של גדילה, קבענו בניסוי שזן ScAM מציג קצב גדילה נמוך מזה של זני S. cerevisiae אחרים (כמו SK1), וזה כנראה גם משפיע על הדינמיקה של ההזדווגות.

Figure 1
איור 1: מחזור החיים של שמרי אפייה (Saccharomyces cerevisiae). ל- S. cerevisiae שני סוגי הזדווגות, A ו- α, והוא מציג שלבי רבייה א-מיניים ומיניים. שני סוגי ההזדווגות, בהיעדר השני, מתחלקים באופן מיטוטי. עם זאת, כאשר הם נוכחים זה בקרבת זה, הם מפסיקים להתחלק באופן מיטוטי, והתוכן התאי והגרעיני מתמזגים ליצירת דיפלואיד. התא הדיפלואידי יכול להתחלק עוד יותר באופן מיטוטי. עם זאת, בנוכחות תנאים שליליים (רעב), הוא עובר מיוזה כדי לייצר נבגים המכילים ארבעה הפלואידים. נבגים אלה נובטים בתנאים נוחים כדי לשחרר שני הפלואידים מכל סוג, ובכך להשלים את מחזור החיים. היעילות שבה שני הפלואידים a ו- α מזדווגים מכונה יעילות ההזדווגות. כל ירידה ביעילות ההזדווגות מצביעה על מחסום קדם-זיגוטי להזדווגות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. 

Figure 2
איור 2: השלבים המעורבים בבדיקת יעילות ההזדווגות . (A) רשת יעילות הזדווגות של 1 ס"מ x 1.5 ס"מ, המחולקת לקופסאות של 1 ס"מ x 0.5 ס"מ כל אחת, מצוירת על לוח YPD. (B) תאים הפלואידים מותקנים על הקופסאות הקיצוניות. (C) צמיחת תאים הפלואידים לאחר 24 שעות ב-30°C. (D) שליש מהמדבקות ההפלואידים מוסרות באמצעות קיסם, מעורבבות במספרי תאים שווים (בהתבסס על OD600), ומטלאות ברשת המרכזית. (E) צמיחת התאים המתוקנים ברשת המרכזית לאחר 7 שעות ב-30°C. זה מכיל את הדיפלואידים החדשים שנוצרו ואת הפלואידים שלא הזדווגו. (F) מושבות בודדות בודדות המתקבלות על לוחית YPD לאחר דילול וציפוי התאים שנמחקו מהרשת המרכזית. צלחת זו הודגרה בטמפרטורה של 30°C במשך 36-48 שעות. (G) כדי לזהות את מספר הדיפלואידים הנמצאים על לוח YPD, המושבות מועברות לצלחת נשירה כפולה ללא טריפטופן ולאוקין. רק דיפלואידים יכולים לגדול על צלחת זו. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: יעילות ההזדווגות של זני השמרים. (A) יעילות ההזדווגות של שני הפלואידים a ו-α של זני SK1 ו-Scam על צלחת YPD. (B) יעילות ההזדווגות של שני הפלואידים a ו-α של זן Scam על לוחות YP המכילים 2% גלקטוז ועל לוחות גליצרול/לקטט. (ג) הדינמיקה של הזדווגות בזן Scam בסביבת גלוקוז. התוצאות מוצגות כממוצע ± SD מתוך 12 חזרות בלתי תלויות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

זנים גנוטיפ תגובה הפניה
SK1AMa  ars314::TRP1, MATa, ho::LYS2, lys2, ura3, leu2::hisG, his3::hisG, trp1::hisG לזן זה יש גן TRP1 ולכן יכול לגדול בהיעדר טריפטופן בתקשורת.
SK1AMα ars314::LEU2, MATalpha, ho::LYS2, lys2, ura3, leu2::hisG, his3::hisG, trp1::hisG לזן זה יש גן LEU2 ולכן הוא יכול לגדול בהיעדר לאוצין בתקשורת.
הונאהא ars314::TRP1, MATa, ho, MEL1, ade1, ile, trp1-HIII ura3‐52 לזן זה יש גן TRP1 ולכן יכול לגדול בהיעדר טריפטופן בתקשורת. נגזר מ- ScPJB644a בהפניה 28
הונאהα ars314::URA3, MATalpha, ho, MEL1, ade1, ile, trp1-HIII, ura3‐52 לזן זה יש גן URA3 ולכן יכול לגדול בהיעדר אורציל בתקשורת. נגזר מ- ScPJB644α בהפניה 28

טבלה 1: גנוטיפים של זני S. cerevisiae ששימשו במחקר זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כימות יעילות ההזדווגות ב- S. cerevisiae חיוני לביצוע מחקרים הקשורים לגנים המעורבים במסלולי הזדווגות או לחקר השפעת הסביבה החיצונית על התנהגות ההזדווגות. בשני העשורים האחרונים, S. cerevisiae הפך גם למודל פופולרי כדי לענות על שאלות הקשורות speciation 14,36,37,38. נוכחותם של שני סוגי הזדווגות והקלות של מניפולציה גנטית ותחזוקה בסביבות מעבדה הפכו אותו לאורגניזם מתאים לחקר האבולוציה של מחסומי רבייה בזמן אמת. כימות יעילות ההזדווגות הוא חיוני מכיוון שהוא נותן מדד למחסום הרבייה הקדם-זיגוטי. לפיכך, נדרש פרוטוקול נוח עם יכולת שחזור גבוהה.

באמצעות הפרוטוקול הנ"ל כומתה יעילות ההזדווגות של שני זנים שונים המראים התנהגות הזדווגות שונה לחלוטין. לפיכך, ניתן ליישם את הפרוטוקול על כל זן, שכן רוב זני שמרי המעבדה נושאים אוקסוטרופיים שניתן להשתמש בהם לבחירה39. עם זאת, ישנם מספר שיקולים חשובים בעת השימוש בפרוטוקול זה. משך הזמן הדרוש לתרביות YPD הראשוניות להגיע לשלב הנייח תלוי במתח. זן הגדל לאט עשוי להזדקק לדגירת יותר מ -48 שעות ב -30 מעלות צלזיוס. נפח הפלואידים שיש לערבב מחושב על בסיס מדידות OD בספקטרופוטומטר. הערך המדווח בספרות הוא בסדר גודל של 107 תאים/מ"ל עבור 1 OD34; עם זאת, עדיף לאפיין ערך זה עבור זן מסוים באמצעות תרשים של OD לעומת מספר התאים. ניתן לחשב את הנפח הדרוש כדי להבטיח ערבוב של מספר שווה של תאים בהתבסס על ערך OD ומספר התאים / מ"ל ב- 1 OD, המתקבלים מאפיון הזן. יש לוודא שהתאים המתוקנים ברשת המרכזית לאחר ערבוב ההפלואידים יוצרים באופן גס שכבה חד-שכבתית שאינה עבה במיוחד. כמו כן, יש לוודא כי נפח מעורבב הוא כ 6-8 μL. נפח גבוה יותר יכול להוביל לחפיפה עם טלאים הפלואידים שנמצאים משני צדי הרשת המרכזית.

שיטה זו יכולה לשמש גם לחקר מחסומי רבייה קדם-זיגוטיים בין מבודדים אקולוגיים של שמרים. עם זאת, במקרים כאלה, הגן HO endonuclease חייב להיות מוסר תחילה מהגנום של האורגניזם, כמו זנים הנושאים HO endonuclease טופס diploids באופן אוטומטי בשל פעילות מיתוג סוג ההזדווגות שלו40. ניתן לזהות את הפלואידים שבודדו מהדיפלואיד הנבג כ-a או α על ידי זיהוי הרצף הקיים במוקד MAT באמצעות הפריימרים הספציפיים שהוזכרו קודם לכן41. ניתן להחליף את סמן HO בשני גנים שונים של עמידות לאנטיביוטיקה כסמנים כדי להבחין בין שני סוגי ההזדווגות הפלואידים. פרט זה תלוי במבנה המאמץ המשמש במחקר המסוים.

אחת המגבלות של שיטה זו היא שהשימוש בסמנים אוקסוטרופיים מחייב העברת המושבות מלוח YPD ללוחות הנשירה. שימוש בסמנים פלואורסצנטיים כדי להבחין בין תאים הפלואידים ודיפלואידים יכול לעזור להפחית את זמן הניסוי. עם זאת, השימוש בסמנים פלואורסצנטיים יכול להשפיע על דינמיקת הגדילה של התאים מכיוון שיש עלות נוספת הכרוכה בייצור החלבונים הפלואורסצנטיים, אשר, לפיכך, יכולים לשנות את המצב המטבולי והפיזיולוגי של התא42. לחלופין, הסמנים האוקסוטרופיים לזיהוי שני ההפלואידים יכולים להיות מוחלפים בסמנים אנטיביוטיים.

חלק מהשיטות הקודמות ששימשו לאפיון יעילות ההזדווגות מדווחות על שימוש בעודף של אחד מסוגי ההזדווגות ביחס של 10:1 16,21,24. מניסיון, השימוש ביחס מוטה של שני ההפלואידים גורם לגדילה מיטוטית של ההפלואיד בעודף. לכן, השיטה הנוכחית משתמשת בשילוב של 1:1 של שני הפלואידים.

מכיוון שהסמנים האוקסוטרופיים בזנים המשמשים במחקר זה מוכנסים קרוב למוקד MAT , רקומבינציה במהלך מיוזה אינה שוברת את הקשר בין הסמן האוקסוטרופי לבין סוג ההזדווגות. כתוצאה מכך, האוקסוטרופיה וסוג ההזדווגות של הפלואיד מסוים אינם משתנים גם אם מאפשרים לזנים לעבור מיוזה. זה מאפשר לענות על שאלות הקשורות להשפעה של זרימת גנים כמשתנה על הסתגלות ו speciation43. לכן, בסך הכל, פרוטוקול זה מציג שיטה פשוטה וחזקה לכימות יעילות ההזדווגות בין זני שמרים שונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים בעבודה זו. המחברים שמחים לשתף את הזנים שמקורם ב-SK1 לכל שימוש ללא מטרות רווח.

Acknowledgments

עבודה זו מומנה על ידי מענק DBT/Wellcome Trust (India Alliance) (IA/S/19/2/504632) ל- S.S. P.N. הוא עמית מחקר הנתמך על ידי מענק DBT/Wellcome Trust (India Alliance) (IA/S/19/2/504632). A.M. נתמך על ידי המועצה למחקר מדעי ותעשייתי (CSIR), ממשלת הודו, כעמית מחקר בכיר (09/087(0873)/2017-EMR-I). המחברים מודים לפייק ג'איאדווה בהאט על הדיונים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenine Sigma Life Science A8626
Agar Powder regular grade for bacteriology SRL 19661 (0140186)
Ammonium Sulphate, Hi-AR HiMedia GRM1273
D-(+)-glucose Sigma Life Science G8270
Glass Petri plates HiMedia PW008  90 mm x 15 mm dimension
L-Arginine Sigma Life Science A8094
L-Aspartic acid Sigma Life Science A7219
L-Histidine monochloride monohydrate Sigma Life Science H5659
L-Isoleucine Sigma Aldrich I2752
L-Leucine Sigma Life Science L8912
L-Lysine Aldrich 62840
L-Methionine Sigma Life Science M5308
L-Phenylalanine Sigma Life Science P5482
L-Threonine Sigma Aldrich T8625
L-Tyrosine Sigma Life Science T8566
L-Valine Sigma Life Science V0513
Mating efficiency grid 1 cm x 1.5 cm rectangular grid drawn on the Petri plate
Microcentrifuge tubes Tarsons 500010
Peptone HiMedia RM001
Uracil Sigma Life Science U0750
Yeast Extract Powder HiMedia RM027
Yeast Nitrogen Base w/o Amino acids and Ammonium Sulphate BD Difco 233520

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).
  2. Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: A primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).
  3. Herskowitz, I. Life cycle of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiological Reviews. 52 (4), 536-553 (1988).
  4. Erdman, S., Lin, L., Malczynski, M., Snyder, M. Pheromone-regulated genes required for yeast mating differentiation. Journal of Cell Biology. 140 (3), 461-483 (1998).
  5. Merlini, L., Dudin, O., Martin, S. G. Mate and fuse: How yeast cells do it. Open Biology. 3 (3), 130008 (2013).
  6. Gustin, M. C., Albertyn, J., Alexander, M., Davenport, K. MAP kinase pathways in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1264-1300 (1998).
  7. Bardwell, L. A walk-through of the yeast mating pheromone response pathway. Peptides. 26 (2), 339-350 (2005).
  8. Reid, B. J., Hartwell, L. H. Regulation of mating in the cell cycle of Saccharomyces cerevisiae. Journal of Cell Biology. 75, 355-365 (1977).
  9. Williams, T. C., Peng, B., Vickers, C. E., Nielsen, L. K. The Saccharomyces cerevisiae pheromone-response is a metabolically active stationary phase for bio-production. Metabolic Engineering Communications. 3, 142-152 (2016).
  10. Bagnat, M., Simons, K. Cell surface polarization during yeast mating. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14183-14188 (2002).
  11. Trueheart, J., Boeke, J. D., Fink, G. R. Two genes required for cell fusion during yeast conjugation: Evidence for a pheromone-induced surface protein. Molecular and Cellular Biology. 7 (7), 2316-2328 (1987).
  12. Sniegowski, P. D., Dombrowski, P. G., Fingerman, E. Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces paradoxus coexist in a natural woodland site in North America and display different levels of reproductive isolation from European conspecifics. FEMS Yeast Research. 1 (4), 299-306 (2002).
  13. Replansky, T., Koufopanou, V., Greig, D., Bell, G. Saccharomyces sensu stricto as a model system for evolution and ecology. Trends in Ecology and Evolution. 23 (9), 494-501 (2008).
  14. Greig, D. Reproductive isolation in Saccharomyces. Heredity. 102 (1), 39-44 (2009).
  15. Mayr, E. Systematics and the Origin of Species, from the Viewpoint of a Zoologist. , Harvard University Press. Cambridge, MA. (1999).
  16. Sprague, G. F. Assay of yeast mating reaction. Methods in Enzymology. 194, 77-93 (1991).
  17. McCaffrey, G., Clay, F. J., Kelsay, K., Sprague, G. F. Identification and regulation of a gene required for cell fusion during mating of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 7 (8), 2680-2690 (1987).
  18. Valtz, N., Peter, M., Herskowitz, I. FAR1 is required for oriented polarization of yeast cells in response to mating pheromones. Journal of Cell Biology. 131 (4), 863-873 (1995).
  19. Maclean, C. J., Greig, D. Prezygotic reproductive isolation between Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces paradoxus. BMC Evolutionary Biology. 8, 1 (2008).
  20. Murphy, H. A., Kuehne, H. A., Francis, C. A., Sniegowski, P. D. Mate choice assays and mating propensity differences in natural yeast populations. Biology Letters. 2 (4), 553-556 (2006).
  21. Leu, J. Y., Murray, A. W. Experimental evolution of mating discrimination in budding yeast. Current Biology. 16 (3), 280-286 (2006).
  22. Kim, J., Hirsch, J. P. A nucleolar protein that affects mating efficiency in Saccharomyces cerevisiae by altering the morphological response to pheromone. Genetics. 149 (2), 795-805 (1998).
  23. Jin, M., et al. Yeast dynamically modify their environment to achieve better mating efficiency. Science Signaling. 4 (186), (2011).
  24. Rogers, D. W., Denton, J. A., McConnell, E., Greig, D. Experimental evolution of species recognition. Current Biology. 25 (13), 1753-1758 (2015).
  25. McClure, A. W., Jacobs, K. C., Zyla, T. R., Lew, D. J. Mating in wild yeast: Delayed interest in sex after spore germination. Molecular Biology of the Cell. 29 (26), 3119-3127 (2018).
  26. Sena, E. P., Radin, D. N., Fogel, S. Synchronous mating in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (5), 1373-1377 (1973).
  27. Werner-Washburne, M., Braun, E., Johnston, G. C., Singer, R. A. Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiology Reviews. 57 (2), 383-401 (1993).
  28. Johnston, S. A., Hopper, J. E. Isolation of the yeast regulatory gene GAL4 and analysis of its dosage effects on the galactose/melibiose regulon. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (22), 6971-6975 (1982).
  29. Mahilkar, A. Study of metabolic specialization leading to speciation, using yeast as a model system. , Indian Institute of Technology. Bombay, Mumbai. PhD thesis (2021).
  30. Blank, T. E., Woods, M. P., Lebo, C. M., Xin, P., Hopper, J. E. Novel Gal3 proteins showing altered Gal80p binding cause constitutive transcription of Gal4p-activated genes in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 17 (5), 2566-2575 (1997).
  31. Rice, W. R., Hostert, E. E. Laboratory experiments on speciation: What have we learned in 40 years. Evolution. 47 (6), 1637-1653 (1993).
  32. White, N. J., Snook, R. R., Eyres, I. The past and future of experimental speciation. Trends in Ecology and Evolution. 35 (1), 10-21 (2020).
  33. Milo, R., Jorgensen, P., Moran, U., Weber, G., Springer, M. BioNumbers--The database of key numbers in molecular and cell biology. Nucleic Acids Research. 38, 750-753 (2010).
  34. Domitrovic, T., et al. Structural and functional study of YER067W, a new protein involved in yeast metabolism control and drug resistance. PLoS One. 5 (6), 11163 (2010).
  35. Lindegren, C. C., Spiegelman, S., Lindegren, G. Mendelian inheritance of adaptive enzymes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 30 (11), 346-352 (1944).
  36. Dettman, J. R., Sirjusingh, C., Kohn, L. M., Anderson, J. B. Incipient speciation by divergent adaptation and antagonistic epistasis in yeast. Nature. 447 (7144), 585-588 (2007).
  37. Jhuang, H. Y., Lee, H. Y., Leu, J. Y. Mitochondrial-nuclear co-evolution leads to hybrid incompatibility through pentatricopeptide repeat proteins. EMBO Reports. 18 (1), 87-101 (2017).
  38. Lee, H. Y., et al. Incompatibility of nuclear and mitochondrial genomes causes hybrid sterility between two yeast species. Cell. 135 (6), 1065-1073 (2008).
  39. Pronk, J. T. Auxotrophic yeast strains in fundamental and applied research. Applied and Environmental Microbiology. 68 (5), 2095-2100 (2002).
  40. Madhani, H. D. From a to α: Yeast as a Model for Cellular Differentiation. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Long Island, New York. (2007).
  41. Huxley, C., Green, E. D., Dunham, I. Rapid assessment of S. cerevisiae mating type by PCR. Trends in Genetics. 6 (8), 236 (1990).
  42. Rang, C., Galen, J. E., Kaper, J. B., Chao, L. Fitness cost of the green fluorescent protein in gastrointestinal bacteria. Canadian Journal of Microbiology. 49 (9), 531-537 (2003).
  43. Tusso, S., Nieuwenhuis, B. P. S., Weissensteiner, B., Immler, S., Wolf, J. B. W. Experimental evolution of adaptive divergence under varying degrees of gene flow. Nature Ecology and Evolution. 5 (3), 338-349 (2021).

Tags

Retraction גיליון 190 Saccharomyces cerevisiae יעילות הזדווגות haploid diploid פרומונים shmoo a/α
קביעת יעילות ההזדווגות של הפלואידים <em>ב-Saccharomyces cerevisiae</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mahilkar, A., Nagendra, P., Saini,… More

Mahilkar, A., Nagendra, P., Saini, S. Determination of the Mating Efficiency of Haploids in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (190), e64596, doi:10.3791/64596 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter