Применение проточной вермиметрии для количественной оценки и анализа микробиома кишечника Caenorhabditis elegans
Summary
Caenorhabditis elegans является мощной моделью для изучения молекулярных детерминант, управляющих взаимодействием между хозяином и микробиомом. Мы представляем высокопроизводительный конвейер, профилирующий уровни колонизации микробиома кишечника у отдельных животных, а также ключевые аспекты физиологии C. elegans.
Abstract
Состав микробиома кишечника может оказывать существенное влияние на физиологию хозяина на протяжении всего развития и жизни животного. Измерение изменений состава микробиома имеет решающее значение для выявления функциональных взаимосвязей между этими физиологическими изменениями. Caenorhabditis elegans стал мощной системой хозяина для изучения молекулярных факторов взаимодействия микробиома хозяина. Благодаря прозрачному строению тела и флуоресцентным меткам естественных микробов, относительные уровни микробов в микробиоме кишечника отдельного животного C. elegans могут быть легко количественно определены с помощью большого сортировщика частиц. В этой статье мы опишем процедуры экспериментальной настройки микробиома, сбора и анализа популяций C. elegans на желаемой стадии жизни, эксплуатации и обслуживания сортировщика, а также статистического анализа полученных наборов данных. Мы также обсудим соображения по оптимизации настроек сортировщика на основе интересующих микробов, разработку эффективных стратегий стробирования для этапов жизни C. elegans и то, как использовать возможности сортировщика для обогащения популяций животных на основе состава микробиома кишечника. В рамках протокола будут представлены примеры потенциальных приложений, в том числе потенциал масштабируемости для приложений с высокой пропускной способностью.
Introduction
Эволюция животных находится под постоянным микробным влиянием1. Из разнообразных микробов в окружающей среде животные-хозяева приобретают специфическихпартнеров2 , которые расширяют возможности хозяина и управляют его физиологией и восприимчивостью к болезням3. Например, метагеномный анализ микробиома кишечника выявил обогащенные метаболические классы микробных генов, которые могут обеспечить больший сбор и хранение энергии у мышей с ожирением4, многие из которых также обнаружены в микробиоме кишечника человека5. По-прежнему существует большая потребность в установлении причинно-следственных связей и определении молекулярных детерминант воздействия на микробиом, хотя прогресс затруднен из-за сложности микробиома и восприимчивости систем хозяев к широкомасштабному скринингу.
Модельный организм C. elegans обеспечивает платформу для углубления молекулярного понимания связей между микробиомом и физиологией хозяина. C. elegans обладает 20 клетками кишечника со слоем слизистой оболочки и ворсинчатыми структурами. Эти клетки оснащены многочисленными генами хеморецепторов, которые воспринимают микробные продукты и вырабатывают антимикробные молекулы, которые потенциально регулируют их кишечные колонизаторы. Эта консервативная биология C. elegans привела к огромному количеству открытий в области передачи сигналов хозяина, которые регулируют кишечные микробы, включая передачу сигналов инсулина, TGF-бета и MAP-киназу 8,9,10.
C. elegans используют микробы как пищу для роста во время развития и микробиом во взрослом возрасте. С возрастом некоторые микробы могут чрезмерно накапливаться в просвете кишечника, и отношения между хозяином и микробом смещаются от симбиоза к патогенезу11. В естественной среде обитания C. elegans встречает широкий спектр видов бактерий12,13. Секвенирование 16S рДНК из репрезентативных образцов, собранных в естественной среде обитания (гнилые плоды, стебли растений и животные переносчики), показало, что в природном микробиоме C. elegans доминируют четыре типа бактерий: Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes и Actinobacteria. В пределах этих подразделений лежит большая вариативность в разнообразии и богатстве бактерий в зависимости от среды обитания12,13,14,15. Было создано несколько определенных сообществ, в том числе коллекции из 63 членов (BIGbiome)16 и 12 членов (CeMbio), представляющие ведущие роды микробиома, созданные для исследовательского сообщества C. elegans 17. Как микробиомы, так и компонентные штаммы могут оказывать различное влияние на физиологию C. elegans, например, на размер тела, скорость роста и реакцию на стресс 9,16,17. Эти исследования предоставляют ресурсы и примеры, позволяющие установить C. elegans в качестве модели для исследования микробиома.
Здесь представлен рабочий процесс, основанный на сортировщике больших частиц (LPS) (рис. 1), который использует систему C. elegans для одновременного измерения состава микробиома и основных показателей физиологии хозяина в масштабе популяции. С микробной стороны рабочий процесс адаптируется для сборки определенного микробиома или отдельных микробов для проверки надежности и пластичности сообщества с увеличением микробных взаимодействий. На стороне хозяина рабочий процесс позволяет проводить высокопроизводительные анализы для измерения уровней колонизации флуоресцентных микробов в микробиоме и физиологического считывания хозяина с точки зрения развития, размера тела и размножения. В совокупности модель микробиома C. elegans позволяет проводить высокопроизводительные скрининги для выявления метаболических и генетических детерминант, модулирующих физиологию хозяина.
Protocol
Representative Results
Discussion
В нескольких исследованиях для характеристики генов и путей C. elegans против колонизации и токсичности патогенов использовалась проточная вермиметрия21,22. Здесь представлен высокопроизводительный подход, который использует C. elegans для изучения то…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами NIH DP2DK116645 (для B.S.S.), Dunn Foundation Pilot Award и грантом NASA 80NSSC22K0250 (для B.S.S.). Этот проект также был поддержан Центром цитометрии и сортировки клеток в Медицинском колледже Бэйлора при финансировании со стороны CPRIT Core Facility Support Award (CPRIT-RP180672), NIH (S10 OD025251, CA125123 и RR024574) и помощи Джоэла М. Седерстрома, а также гранта на инструментарий для гранта LPS NIH (S10 OD025251). Некоторые штаммы были предоставлены CGC, который финансируется Управлением программ исследовательской инфраструктуры NIH (P40 OD010440).
Materials
| 15 mL conical bottom centrifuge tubes | VWR | 10026-076 | |
| 96 deep-well plates (1 mL) | Axygen | P-DW-11-C | |
| 96 deep-well plates (2 mL) | Axygen | P-DW-20-C | |
| 96-well Costar plate | Corning | 3694 | |
| Agar | Millipore Sigma | Standard bacteriology agar is also sufficient. | |
| Aspirating manifold | V&P scientific | VP1171A | |
| Bleach | Clorox | ||
| Bleach solution | Mix Bleach with 5M Sodium hypochlorite 2:1 (v/v) | ||
| Cell Imaging Multimode Reader | Biotek | Cytation 5 | Bacterial OD measurement |
| Centrifuge | Thermo scientific | Sorvall Legend XTR | For 96 well plate and conical tubes |
| Fluorescent Microscope | Nikon | TiE | |
| ggplot: Various R Programming Tools for Plotting Data. | R package | Version 3.3.2 | |
| Large Particle Autosampler | Union Biometrica | LP Sampler | |
| Large Particle Sorter | Union Biometrica | COPAS Biosorter | |
| Levamisole | Fisher | AC187870100 | |
| Lysogeny Broth (LB) | RPI | L24066 | Standard LB home-made recipes using Bacto-tryptone, yeast extract, and NaCl are also sufficient. |
| M9 solution | 22 mM KH2PO4 monobasic, 42.3 mM Na2HPO4, 85.6 mM NaCl, 1 mM MgSO4 | ||
| Nematode Growth Medium | RPI | N81800-1000.0 | 1 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6.0, 1 mM MgSO4 added after autoclaving. |
| RStudio | GNU | Version 1.3.1093 | |
| Sodium hypochlorite | Sigma-Aldrich | 5M NaOH | |
| Stereo Microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Sterile 10 cm diameter petri dishes | Corning | 351029 | |
| Sterile 12-well plates | VWR | 10062-894 | |
| Sterile 24-well plates | VWR | 10062-896 | |
| Sterile 6 cm diameter petri dishes | Corning | 351007 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
Riferimenti
- McFall-Ngai, M., et al. Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (9), 3229-3236 (2013).
- Seedorf, H., et al. Bacteria from diverse habitats colonize and compete in the mouse gut. Cell. 159 (2), 253-266 (2014).
- Bäckhed, F., et al. The gut microbiota as an environmental factor that regulates fat storage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (44), 15718-15723 (2004).
- Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444 (7122), 1027-1031 (2006).
- Gill, S. R., et al. Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome. Science. 312 (5778), 1355-1359 (2006).
- Bargmann, C. I. Chemosensation in C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-29 (2006).
- Couillault, C., et al. TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans. by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM. Nature Immunology. 5 (5), 488-494 (2004).
- Kim, D. H., et al. A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
- Berg, M., et al. TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
- Garsin, D. A., et al. Long-lived C. elegansdaf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens. Science. 300 (5627), 1921 (2003).
- Cabreiro, F., Gems, D. Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans. EMBO Molecular Medicine. 5 (9), 1300-1310 (2013).
- Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. -. A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).
- Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14 (1), 38 (2016).
- Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).
- Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).
- Zhang, F., et al. Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut. Current biology: CB. 31 (12), 2603-2618 (2021).
- Dirksen, P., et al. CeMbio – The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3. 10 (9), 3025-3039 (2020).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).
- R Core. Team R: A language and environment for statistical computing. R Core. , (2018).
- Wickham, H., et al. . tidyverse. , (2019).
- Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem. Journal of Visualized Experiments. (137), e58068 (2018).
- Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen. Journal of Visualized Experiments. (85), e51090 (2014).
- Portal-Celhay, C., Bradley, E. R., Blaser, M. J. Control of intestinal bacterial proliferation in regulation of lifespan in Caenorhabditis elegans. BMC Microbiology. 12 (1), 49 (2012).
- Zhang, F., et al. High-Throughput assessment of changes in the Caenorhabditis elegans gut microbiome. Aging: Methods and Protocols. 144, 131-144 (2020).
- Wiles, T. J., et al. Modernized tools for streamlined genetic manipulation and comparative study of wild and diverse proteobacterial lineages. mBio. 9 (5), 01877 (2018).
- Ronda, C., Chen, S. P., Cabral, V., Yaung, S. J., Wang, H. H. Metagenomic engineering of the mammalian gut microbiome in situ. Nature Methods. 16 (2), 167-170 (2019).
- Leonard, S. P., et al. Genetic engineering of bee gut microbiome bacteria with a toolkit for modular assembly of broad-host-range plasmids. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1279-1290 (2018).
- Kutscher, L. M., Shaham, S. Forward and reverse mutagenesis in C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-26 (2014).
- Mok, C. A., et al. MIP-MAP: High-Throughput mapping of Caenorhabditis elegans temperature-sensitive mutants via molecular inversion probes. Genetica. 207 (2), 447-463 (2017).
