Test d’immunothérapies anticancéreuses dans un modèle murin humanisé portant des tumeurs humaines
Summary
Ce protocole décrit la génération de souris du système immunitaire humain (SIH) pour les études d’immuno-oncologie. Les instructions et les considérations relatives à l’utilisation de ce modèle pour tester les immunothérapies humaines sur les tumeurs humaines implantées dans ce modèle sont présentées en mettant l’accent sur la caractérisation de la réponse du système immunitaire humain à la tumeur.
Abstract
L’inversion de la nature immunosuppressive du microenvironnement tumoral est essentielle au succès du traitement des cancers avec des médicaments d’immunothérapie. Les modèles de cancer murin sont extrêmement limités dans leur diversité et souffrent d’une mauvaise traduction à la clinique. Pour servir de modèle préclinique plus physiologique pour les études d’immunothérapie, ce protocole a été développé pour évaluer le traitement des tumeurs humaines chez une souris reconstituée avec un système immunitaire humain. Ce protocole unique démontre le développement de souris du système immunitaire humain (HIS, « humanisé »), suivi de l’implantation d’une tumeur humaine, soit une xénogreffe dérivée d’une lignée cellulaire (CDX), soit une xénogreffe dérivée du patient (PDX). Les souris HIS sont générées par l’injection de cellules souches hématopoïétiques humaines CD34+ isolées du sang de cordon ombilical dans des souris BRGS néonatales (BALB/c Rag2-/- IL2RγC-/- NODSIRPα) hautement immunodéficientes qui sont également capables d’accepter une tumeur xénogénique. L’importance de la cinétique et des caractéristiques du développement du système immunitaire humain et de l’implantation tumorale est soulignée. Enfin, une évaluation approfondie du microenvironnement tumoral à l’aide de la cytométrie en flux est décrite. Dans de nombreuses études utilisant ce protocole, il a été constaté que le microenvironnement tumoral des tumeurs individuelles est récapitulé chez les souris HIS-PDX; Les tumeurs « chaudes » présentent une infiltration immunitaire importante alors que les tumeurs « froides » ne le font pas. Ce modèle sert de terrain d’essai pour les immunothérapies combinées pour un large éventail de tumeurs humaines et représente un outil important dans la quête de la médecine personnalisée.
Introduction
Les modèles de cancer de la souris sont importants pour établir les mécanismes de base de la croissance tumorale et de l’évasion immunitaire. Cependant, les études sur le traitement du cancer sur des modèles murins ont donné une traduction finie à la clinique en raison des modèles syngéniques limités et des différences spécifiques à l’espèce 1,2. L’émergence des thérapies immunitaires en tant qu’approche dominante pour contrôler les tumeurs a réitéré la nécessité d’un modèle in vivo avec un système immunitaire humain fonctionnel. Les progrès réalisés chez les souris du système immunitaire humain (souris HIS) au cours de la dernière décennie ont permis d’étudier l’immuno-oncologie in vivo dans une grande variété de types de cancer et d’agents immunothérapeutiques 3,4,5,6. Les modèles tumoraux humains, y compris les xénogreffes dérivées de lignées cellulaires et de patients (CDX et PDX, respectivement), se développent bien chez les souris HIS et, dans la plupart des cas, sont presque identiques à leur croissance chez l’hôte immunodéficient dépourvu de greffe hématopoïétique humaine 7,8. Sur la base de cette découverte clé, les chercheurs ont utilisé le modèle murin HIS pour étudier les immunothérapies humaines, y compris les thérapies combinées conçues pour modifier le microenvironnement tumoral (TME) afin de diminuer l’immunosuppression et ainsi améliorer la destruction tumorale dirigée par le système immunitaire. Ces modèles précliniques aident à résoudre les problèmes d’hétérogénéité des cancers humains et peuvent également prédire le succès du traitement ainsi que surveiller les toxicités médicamenteuses liées au système immunitaire 9,10.
La production d’un modèle murin avec un système immunitaire humain par l’introduction de cellules souches hématopoïétiques humaines nécessite une souris immunodéficiente receveuse qui ne rejettera pas la xénogreffe. Les modèles murins HIS actuels sont dérivés de souches de souris immunodéficientes qui ont été signalées il y a plus de 30 ans. La première souche de souris immunodéficiente décrite était des souris SCID dépourvues de cellules T et B11, suivies d’un hybride NOD-SCID avec un polymorphisme SIRPα responsable de la tolérance des macrophages de souris aux cellules humaines, en raison de la liaison accrue de l’allèle NOD SIRPα à la molécule CD47humaine 12,13. Au début des années 2000, la suppression de la chaîne gamma commune du récepteur IL-2 (IL-2Rγc) sur les souches immunodéficientes BALB/c et NOD a changé la donne pour une greffe humaine améliorée, en raison de délétions génétiques interdisant le développement des cellules NK de l’hôte14,15,16,17. Des modèles alternatifs, tels que les souris BRG et NRG, permettent d’obtenir un déficit en lymphocytes T et B par délétion du gène Rag1 ou Rag2, nécessaire aux réarrangements des gènes des récepteurs des cellules T et B et donc à la maturation et à la survie des lymphocytes18,19. La souris BRGS (BALB/c -Rag2 nullIl2RγCnullSirpαNOD) utilisée ici combine le déficit en chaîne IL-2Rγ et l’allèle NOD SIRPα sur le fond Rag2-/-, résultant en une souris hautement immunodéficiente sans cellules T, B ou NK, mais avec une vigueur et une santé suffisantes pour permettre une greffe à long terme de plus de 30 semaines13.
Les souris HIS peuvent être générées de multiples façons, l’injection humaine de PBMC étant la méthode la plus directe15,18,20. Cependant, ces souris ont une expansion prononcée des cellules T humaines activées qui entraîne la maladie du greffon contre l’hôte (GVH) à l’âge de 12 semaines, empêchant les études à long terme. Alternativement, les cellules souches hématopoïétiques humaines du sang de cordon ombilical (CB), de la moelle osseuse et du foie fœtal peuvent également être utilisées pour la greffe et la production du système immunitaire humain de novo. Dans ce système, les cellules souches hématopoïétiques produisent un système immunitaire humain multi-lignée avec la génération de cellules immunitaires T, B et innées qui sont particulièrement tolérantes envers l’hôte souris, par rapport aux souris PBMC qui développent principalement des cellules T. Par conséquent, la GVH est absente ou considérablement retardée, et les études peuvent être étendues aux souris jusqu’à l’âge de 10 mois. Le CB fournit une source facile, accessible et non invasive de cellules souches hématopoïétiques humaines CD34+ qui facilite la greffe de plusieurs souris HIS ayant un système immunitaire génétiquement identique 17,18,20,21. Au cours des dernières années, les modèles murins HIS ont été largement utilisés pour étudier l’immunothérapie et le TME 3,4,5,6. Malgré le développement de systèmes immunitaires dérivés de l’homme chez ces souris, les tumeurs de xénogreffe humaine se développent à des taux similaires à ceux des souris immunodéficientes témoins et permettent l’interaction complexe entre les cellules cancéreuses et les cellules immunitaires, ce qui est important pour maintenir le microenvironnement du PDX 3,7,8 greffé . Ce protocole a été utilisé pour réaliser plus de 50 études testant des traitements chez des souris HIS-BRGS avec PDX et CDX. Une conclusion importante est que les tumeurs humaines chez les souris HIS maintiennent leur TME unique tel que défini par l’évaluation moléculaire de la tumeur par rapport à l’échantillon initial du patient et aux caractéristiques de l’infiltrat immunitaire 3,22,23. Notre groupe se concentre sur l’évaluation approfondie du HIS dans les organes immunitaires et la tumeur à l’aide de la cytométrie de flux multiparamétrique. Nous décrivons ici un protocole pour l’humanisation des souris BRGS, l’évaluation du chimérisme, l’implantation de tumeurs humaines, les mesures de croissance tumorale, l’administration de traitements contre le cancer et l’analyse des cellules HIS par cytométrie en flux.
Protocol
Representative Results
Discussion
Au cours des 6 dernières années, en utilisant notre expertise en immunologie et en souris humanisées, notre équipe de recherche a développé un modèle préclinique indispensable pour tester des immunothérapies sur une variété de tumeurs humaines 3,7,30,31. Ce protocole met l’accent sur la prise en compte de la variabilité du modèle, avec une attention particulière aux populations …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier à la fois l’Animal Research Facility (OLAR) pour les soins qu’ils ont prodigués à nos souris et la ressource partagée en cytométrie en flux soutenue par la subvention de soutien au Centre de cancérologie (P30CA046934) de notre institut pour leur immense aide dans tout notre travail. Nous remercions également Gail Eckhardt et Anna Capasso pour nos collaborations inaugurales sur l’étude des immunothérapies aux PDX humains dans notre modèle HIS-BRGS. Cette étude a été financée en partie par la subvention de soutien du centre de cancérologie P30CA06934 des National Institutes of Health avec l’utilisation de la ressource partagée PHISM (Pre-clinical Human Immune System Mouse Models), RRID: ressource partagée de cytométrie SCR_021990 et de flux, RRID: SCR_022035. Cette recherche a été financée en partie par le NIAID des National Institutes of Health sous le numéro de contrat 75N93020C00058.
Materials
| 1 mL syringe w/needles | McKesson | 1031815 | |
| 15 mL tubes | Grenier Bio-One | 188271 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| 50 mL tubes | Grenier Bio-One | 227261 | |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi | 130-092-545 | |
| BD Golgi Stop Protein Transport Inhibitor with monensin | BD Bioscience | BDB563792 | |
| BSA | Fisher Scientific | BP1600100 | |
| Cell Stim Cocktail | Life Technologies | 509305 | |
| Chill 15 Rack | Miltenyi | 130-092-952 | |
| Cotton-plugged glass pipettes | Fisher Scientific | 13-678-8B | |
| Cultrex Basement membrane extract | R&D Systems | 363200502 | |
| Cytek Aurora | Cytek | ||
| DNase | Sigma | 9003-98-9 | |
| eBioscience FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Set | Invitrogen | 00-5523-00 | |
| Embryonic Stemcell FCS | Gibco | 10439001 | |
| Eppendorf Tubes; 1.5 mL volume | Grenier Bio-One | 616201 | |
| Excel | Microsoft | ||
| FBS | Benchmark | 100-106 500mL | |
| Ficoll Hypaque | GE Healthcare | 45001752 | |
| FlowJo Software | BD Biosciences | ||
| Forceps – fine | Roboz Surgical | RS5045 | |
| Forceps normal | Dumont | RS4919 | |
| Formaldehyde | Fisher | F75P1GAL | |
| Frosted Glass Slides | Corning | 1255310 | |
| Gentlemacs C-Tubes | Miltenyi | 130-096-334 | |
| GentleMACS Dissociator | Miltenyi | 130-093-235 | |
| glass pipettes | DWK Life Sciences | 63A53 | |
| Glutamax | Gibco | 11140050 | |
| HBSS w/ Ca & Mg | Sigma | 55037C | |
| HEPES | Corning | MT25060CI | |
| IgG standard | Sigma | I2511 | |
| IgM standard | Sigma | 401108 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Liberase DL | Roche | 5466202001 | |
| LIVE/DEAD Fixable Blue | Thermo | L23105 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
| MEM | Gibco | 1140050 | |
| mouse anti-human IgG-AP | Southern Biotech | JDC-10 | |
| mouse anti-human IgG-unabeled | Southern Biotech | H2 | |
| mouse anti-human IgM-AP | Southern Biotech | UHB | |
| mouse anti-human IgM-unlabeled | Southern Biotech | SA-DA4 | |
| MultiRad 350 | Precision X-Ray | ||
| PBS | Corning | 45000-446 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140122 | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| p-nitrophenyl substrate | Thermo | 34045 | |
| PRISM | Graphpad | ||
| Rec Hu FLT3L | R&D systems | 308-FK-005/CF | |
| Rec Hu IL6 | R&D systems | 206-IL-010/CF | |
| Rec Hu SCF | R&D systems | 255SC010 | |
| RPMI 1640 | Corning | 45000-39 | |
| Saponin | Sigma | 8047-15-2 | |
| Scissors | McKesson | 862945 | |
| Serological pipettes 25 mL | Fisher Scientific | 1367811 | |
| Sterile filter | Nalgene | 567-0020 | |
| Sterile molecular water | Sigma | 7732-18-5 | |
| Yeti Cell Analyzer | Bio-Rad | 12004279 | |
| Zombie Green | biolegend | 423112 |
Riferimenti
- Chulpanova, D. S., Kitaeva, K. V., Rutland, C. S., Rizvanov, A. A., Solovyeva, V. V. Mouse tumor models for advanced cancer immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 4118 (2020).
- Olson, B., Li, Y., Lin, Y., Liu, E. T., Patnaik, A. Mouse models for cancer immunotherapy research. Cancer Discovery. 8 (11), 1358-1365 (2018).
- Marin-Jimenez, J. A., et al. Testing cancer immunotherapy in a human immune system mouse model: correlating treatment responses to human chimerism, therapeutic variables and immune cell phenotypes. Frontiers in Immunology. 12, 607282 (2021).
- Yin, L., Wang, X. J., Chen, D. X., Liu, X. N., Wang, X. J. Humanized mouse model: a review on preclinical applications for cancer immunotherapy. American Journal of Cancer Research. 10 (12), 4568-4584 (2020).
- Cogels, M. M., et al. Humanized mice as a valuable pre-clinical model for cancer immunotherapy research. Frontiers in Oncology. 11, 784947 (2021).
- Jin, K. T., et al. Development of humanized mouse with patient-derived xenografts for cancer immunotherapy studies: A comprehensive review. Cancer Science. 112 (7), 2592-2606 (2021).
- Capasso, A., et al. Characterization of immune responses to anti-PD-1 mono and combination immunotherapy in hematopoietic humanized mice implanted with tumor xenografts. Journal for Immunotherapy of Cancer. 7 (1), 37 (2019).
- Wang, M., et al. Humanized mice in studying efficacy and mechanisms of PD-1-targeted cancer immunotherapy. The FASEB Journal. 32 (3), 1537-1549 (2018).
- Yong, K. S. M., et al. Humanized mouse as a tool to predict immunotoxicity of human biologics. Frontiers in Immunology. 11, 553362 (2020).
- Shen, H. W., Jiang, X. L., Gonzalez, F. J., Yu, A. M. Humanized transgenic mouse models for drug metabolism and pharmacokinetic research. Current Drug Metabolism. 12 (10), 997-1006 (2011).
- Bosma, G. C., Custer, R. P., Bosma, M. J. A severe combined immunodeficiency mutation in the mouse. Nature. 301 (5900), 527-530 (1983).
- Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. The Journal of Immunology. 154 (1), 180-191 (1995).
- Legrand, N., et al. Functional CD47/signal regulatory protein alpha (SIRP(alpha)) interaction is required for optimal human T- and natural killer- (NK) cell homeostasis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (32), 13224-13229 (2011).
- Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. The Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- Traggiai, E., et al. Development of a human adaptive immune system in cord blood cell-transplanted mice. Science. 304 (5667), 104-107 (2004).
- Theocharides, A. P., Rongvaux, A., Fritsch, K., Flavell, R. A., Manz, M. G. Humanized hemato-lymphoid system mice. Haematologica. 101 (1), 5-19 (2016).
- Goldman, J. P., et al. Enhanced human cell engraftment in mice deficient in RAG2 and the common cytokine receptor gamma chain. British Journal of Haematology. 103 (2), 335-342 (1998).
- Stripecke, R., et al. Innovations, challenges, and minimal information for standardization of humanized mice. EMBO Molecular Medicine. 12 (7), (2020).
- Allen, T. M., et al. Humanized immune system mouse models: progress, challenges and opportunities. Nature Immunology. 20 (7), 770-774 (2019).
- Gammelgaard, O. L., Terp, M. G., Preiss, B., Ditzel, H. J. Human cancer evolution in the context of a human immune system in mice. Molecular Oncology. 12 (10), 1797-1810 (2018).
- Rios-Doria, J., Stevens, C., Maddage, C., Lasky, K., Koblish, H. K. Characterization of human cancer xenografts in humanized mice. Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (1), 000416 (2020).
- Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D. Intravenous injections in neonatal mice. Journal of Visualized Experiments. (93), e52037 (2014).
- Lang, J., Weiss, N., Freed, B. M., Torres, R. M., Pelanda, R. Generation of hematopoietic humanized mice in the newborn BALB/c-Rag2null Il2rγnull mouse model: a multivariable optimization approach. Clinical Immunology. 140 (1), 102-116 (2011).
- Laskowski, T. J., Hazen, A. L., Collazo, R. S., Haviland, D. Rigor and reproducibility of cytometry practices for immuno-oncology: a multifaceted challenge. Cytometry Part A. 97 (2), 116-125 (2020).
- Bagby, S., et al. Development and maintenance of a preclinical patient derived tumor xenograft model for the investigation of novel anti-cancer therapies. Journal of Visualized Experiments. (115), e54393 (2016).
- Laajala, T. D., et al. Optimized design and analysis of preclinical intervention studies in vivo. Scientific Reports. 6, 30723 (2016).
- Na, Y. S., et al. Establishment of patient-derived xenografts from patients with gastrointestinal stromal tumors: analysis of clinicopathological characteristics related to engraftment success. Scientific Reports. 10 (1), 7996 (2020).
- Tentler, J. J., et al. RX-5902, a novel beta-catenin modulator, potentiates the efficacy of immune checkpoint inhibitors in preclinical models of triple-negative breast cancer. BMC Cancer. 20 (1), 1063 (2020).
- Lang, J., et al. Development of an adrenocortical cancer humanized mouse model to characterize anti-PD1 effects on tumor microenvironment. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 105 (1), 26-42 (2020).
- Lang, J., et al. Studies of lymphocyte reconstitution in a humanized mouse model reveal a requirement of T cells for human B cell maturation. The Journal of Immunology. 190 (5), 2090-2101 (2013).
- Katano, I., et al. NOD-Rag2null IL-2Rγnull mice: an alternative to NOG mice for generation of humanized mice. Experimental Animalas. 63 (3), 321-330 (2014).
- Brehm, M. A., et al. Parameters for establishing humanized mouse models to study human immunity: analysis of human hematopoietic stem cell engraftment in three immunodeficient strains of mice bearing the IL2rγ(null) mutation. Clinical Immunology. 135 (1), 84-98 (2010).
- Hasgur, S., Aryee, K. E., Shultz, L. D., Greiner, D. L., Brehm, M. A. Generation of immunodeficient mice bearing human immune systems by the engraftment of hematopoietic stem cells. Methods in Molecular Biology. 1438, 67-78 (2016).
- Andre, M. C., et al. Long-term human CD34+ stem cell-engrafted nonobese diabetic/SCID/IL-2Rγnull mice show impaired CD8+ T cell maintenance and a functional arrest of immature NK cells. The Journal of Immunology. 185 (5), 2710-2720 (2010).
- Wunderlich, M., et al. Improved multilineage human hematopoietic reconstitution and function in NSGS mice. PLoS One. 13 (12), 0209034 (2018).
- Lee, J., Brehm, M. A., Greiner, D., Shultz, L. D., Kornfeld, H. Engrafted human cells generate adaptive immune responses to Mycobacterium bovis BCG infection in humanized mice. BMC Immunology. 14, 53 (2013).
- Masse-Ranson, G., et al. Accelerated thymopoiesis and improved T-cell responses in HLA-A2/-DR2 transgenic BRGS-based human immune system mice. European Journal of Immunology. 49 (6), 954-965 (2019).
- Oswald, E., et al. Immune cell infiltration pattern in non-small cell lung cancer PDX models is a model immanent feature and correlates with a distinct molecular and phenotypic make-up. Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (4), 004412 (2022).
