Тестирование иммунотерапии рака на гуманизированной мышиной модели с опухолями человека
Summary
В этом протоколе описывается генерация мышей иммунной системы человека (HIS) для иммуноонкологических исследований. Инструкции и соображения по использованию этой модели для тестирования иммунотерапевтических средств человека на опухолях человека, имплантированных в эту модель, представлены с акцентом на характеристику реакции иммунной системы человека на опухоль.
Abstract
Изменение иммуносупрессивной природы микроокружения опухоли имеет решающее значение для успешного лечения рака иммунотерапевтическими препаратами. Модели рака мышей крайне ограничены в своем разнообразии и страдают от плохого перевода в клинику. Чтобы служить более физиологической доклинической моделью для исследований иммунотерапии, этот протокол был разработан для оценки лечения опухолей человека у мышей, восстановленных с иммунной системой человека. Этот уникальный протокол демонстрирует развитие иммунной системы человека (HIS, «гуманизированный») мышей с последующей имплантацией опухоли человека, либо ксенотрансплантата, полученного из клеточной линии (CDX), либо ксенотрансплантата, полученного из пациента (PDX). Мыши HIS генерируются путем инъекции CD34+ гемопоэтических стволовых клеток человека, выделенных из пуповинной крови, в новорожденных мышей с высоким иммунодефицитом BRGS (BALB/c Rag2-/- IL2RγC-/- NODSIRPα), которые также способны принимать ксеногенную опухоль. Подчеркивается важность кинетики и особенностей развития иммунной системы человека и имплантации опухоли. Наконец, описана углубленная оценка микроокружения опухоли с помощью проточной цитометрии. В многочисленных исследованиях с использованием этого протокола было обнаружено, что опухолевое микроокружение отдельных опухолей повторяется у мышей HIS-PDX; «Горячие» опухоли проявляют большую иммунную инфильтрацию, в то время как «холодные» опухоли этого не делают. Эта модель служит испытательным полигоном для комбинированной иммунотерапии широкого спектра опухолей человека и представляет собой важный инструмент в поисках персонализированной медицины.
Introduction
Модели рака мышей важны для установления основных механизмов роста опухоли и иммунного ускользания. Однако исследования по лечению рака на мышиных моделях дали конечную трансляцию в клинику из-за ограниченных сингенных моделей и видоспецифических различий 1,2. Появление иммунной терапии в качестве доминирующего подхода к борьбе с опухолями подтвердило необходимость модели in vivo с функциональной иммунной системой человека. Достижения в области мышей иммунной системы человека (мышей HIS) за последнее десятилетие позволили изучать иммуноонкологию in vivo при самых разных типах рака и иммунотерапевтических агентах 3,4,5,6. Модели опухолей человека, включая ксенотрансплантаты, полученные из клеточной линии, и ксенотрансплантаты, полученные от пациента (CDX и PDX соответственно), хорошо растут у мышей с HIS и в большинстве случаев почти идентичны их росту у иммунодефицитного хозяина, лишенного гемопоэтического приживления человека 7,8. Основываясь на этом ключевом выводе, исследователи использовали мышиную модель HIS для изучения иммунотерапии человека, включая комбинированную терапию, предназначенную для изменения микроокружения опухоли (TME) для снижения иммуносупрессии и, таким образом, усиления иммунно-направленного уничтожения опухоли. Эти доклинические модели помогают решить проблемы гетерогенности рака человека, а также могут прогнозировать успех лечения, а также контролировать токсичность лекарств, связанных с иммунитетом 9,10.
Для получения мышиной модели с иммунной системой человека путем введения гемопоэтических стволовых клеток человека требуется мышь-реципиент с иммунодефицитом, которая не будет отторгать ксенотрансплантат. Современные модели мышей HIS получены из иммунодефицитных штаммов мышей, о которых сообщалось более 30 лет назад. Первым описанным иммунодефицитным штаммом мышей были мыши с ТКИД, у которых отсутствовали Т- и В-клетки11, за которыми следовал гибрид NOD-SCID с полиморфизмом SIRPα, ответственным за толерантность макрофагов мыши к клеткам человека, из-за повышенного связывания аллеля NOD SIRPα с молекулой CD47человека 12,13. В начале 2000-х годов делеция общей гамма-цепи рецептора IL-2 (IL-2Rγc) на штаммах с иммунодефицитом BALB/c и NOD изменила правила игры для усиленного приживления человека из-за генетических делеций, запрещающих развитие NK-клеток хозяина14,15,16,17. Альтернативные модели, такие как мыши BRG и NRG, достигают дефицита Т- и В-клеток путем делеции гена Rag1 или Rag2, необходимого для перестройки генов рецепторов Т- и В-клеток и, следовательно, созревания и выживания лимфоцитов18,19. Мышь BRGS (BALB/c -Rag2 nullIl2R γCnullSirpαNOD), используемая в настоящем описании, сочетает в себе дефицит цепи IL-2Rγ и аллель NOD SIRPα на фоне Rag2-/-, в результате чего мышь с высоким иммунодефицитом отсутствует без Т, В или NK-клеток, но с достаточной энергией и здоровьем, чтобы обеспечить долгосрочное приживление более 30 недель13.
Мыши HIS могут быть получены несколькими способами, при этом инъекция PBMC человека является наиболее прямым методом15,18,20. Тем не менее, у этих мышей наблюдается выраженная экспансия активированных Т-клеток человека, что приводит к реакции «трансплантат против хозяина» (РТПХ) к 12-недельному возрасту, что препятствует долгосрочным исследованиям. В качестве альтернативы, гемопоэтические стволовые клетки человека из пуповинной крови (КБ), костного мозга и печени плода также могут быть использованы для приживления и производства иммунной системы человека de novo. В этой системе гемопоэтические стволовые клетки продуцируют многолинейную иммунную систему человека с генерацией Т, В и врожденных иммунных клеток, которые, что важно, толерантны к мыши-хозяину, по сравнению с мышами PBMC, которые развивают в основном Т-клетки. Поэтому РТПХ отсутствует или сильно задерживается, и исследования могут быть распространены на мышей до 10-месячного возраста. CB обеспечивает простой, доступный и неинвазивный источник CD34+ гемопоэтических стволовых клеток человека, который облегчает приживление нескольких мышей HIS с генетически идентичной иммунной системой 17,18,20,21. За последние несколько лет модели мышей HIS широко использовались для изучения иммунотерапии и TME 3,4,5,6. Несмотря на развитие иммунной системы человека у этих мышей, опухоли ксенотрансплантата человека растут с той же скоростью по сравнению с контрольными иммунодефицитными мышами и допускают сложное взаимодействие между раковыми клетками и иммунными клетками, что важно для поддержания микроокружения привитого PDX 3,7,8 . Этот протокол был использован для проведения более 50 исследований, в которых тестировались методы лечения мышей HIS-BRGS с PDX и CDX. Важным выводом является то, что опухоли человека у мышей HIS сохраняют свой уникальный TME, определяемый молекулярной оценкой опухоли по отношению к исходному образцу пациента и характеристиками иммунного инфильтрата 3,22,23. Наша группа фокусируется на углубленной оценке ГИС как в иммунных органах, так и в опухоли с использованием многопараметрической проточной цитометрии. Здесь мы описываем протокол гуманизации мышей BRGS, оценку химеризма, имплантацию опухолей человека, измерения роста опухоли, назначение лечения рака и анализ клеток HIS с помощью проточной цитометрии.
Protocol
Representative Results
Discussion
За последние 6 лет, используя наш опыт как в области иммунологии, так и в области гуманизированных мышей, наша исследовательская группа разработала столь необходимую доклиническую модель для тестирования иммунотерапии на различных опухолях человека 3,7,30,31.<…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить как Центр исследований животных (OLAR) за заботу о наших мышах, так и общий ресурс проточной цитометрии, поддерживаемый грантом поддержки онкологического центра (P30CA046934) в нашем институте, за их огромную помощь во всей нашей работе. Мы также выражаем признательность Гейл Экхардт и Анне Капассо за наше первое сотрудничество по изучению иммунотерапии PDX человека в нашей модели HIS-BRGS. Это исследование было частично поддержано грантом поддержки онкологического центра Национального института здравоохранения P30CA06934 с использованием общего ресурса PHISM (доклинические модели иммунной системы человека), RRID: SCR_021990 и общего ресурса по проточной цитометрии, RRID: SCR_022035. Это исследование было частично поддержано NIAID Национальных институтов здравоохранения по контракту No 75N93020C00058.
Materials
| 1 mL syringe w/needles | McKesson | 1031815 | |
| 15 mL tubes | Grenier Bio-One | 188271 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| 50 mL tubes | Grenier Bio-One | 227261 | |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi | 130-092-545 | |
| BD Golgi Stop Protein Transport Inhibitor with monensin | BD Bioscience | BDB563792 | |
| BSA | Fisher Scientific | BP1600100 | |
| Cell Stim Cocktail | Life Technologies | 509305 | |
| Chill 15 Rack | Miltenyi | 130-092-952 | |
| Cotton-plugged glass pipettes | Fisher Scientific | 13-678-8B | |
| Cultrex Basement membrane extract | R&D Systems | 363200502 | |
| Cytek Aurora | Cytek | ||
| DNase | Sigma | 9003-98-9 | |
| eBioscience FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Set | Invitrogen | 00-5523-00 | |
| Embryonic Stemcell FCS | Gibco | 10439001 | |
| Eppendorf Tubes; 1.5 mL volume | Grenier Bio-One | 616201 | |
| Excel | Microsoft | ||
| FBS | Benchmark | 100-106 500mL | |
| Ficoll Hypaque | GE Healthcare | 45001752 | |
| FlowJo Software | BD Biosciences | ||
| Forceps – fine | Roboz Surgical | RS5045 | |
| Forceps normal | Dumont | RS4919 | |
| Formaldehyde | Fisher | F75P1GAL | |
| Frosted Glass Slides | Corning | 1255310 | |
| Gentlemacs C-Tubes | Miltenyi | 130-096-334 | |
| GentleMACS Dissociator | Miltenyi | 130-093-235 | |
| glass pipettes | DWK Life Sciences | 63A53 | |
| Glutamax | Gibco | 11140050 | |
| HBSS w/ Ca & Mg | Sigma | 55037C | |
| HEPES | Corning | MT25060CI | |
| IgG standard | Sigma | I2511 | |
| IgM standard | Sigma | 401108 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Liberase DL | Roche | 5466202001 | |
| LIVE/DEAD Fixable Blue | Thermo | L23105 | |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
| MEM | Gibco | 1140050 | |
| mouse anti-human IgG-AP | Southern Biotech | JDC-10 | |
| mouse anti-human IgG-unabeled | Southern Biotech | H2 | |
| mouse anti-human IgM-AP | Southern Biotech | UHB | |
| mouse anti-human IgM-unlabeled | Southern Biotech | SA-DA4 | |
| MultiRad 350 | Precision X-Ray | ||
| PBS | Corning | 45000-446 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140122 | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| p-nitrophenyl substrate | Thermo | 34045 | |
| PRISM | Graphpad | ||
| Rec Hu FLT3L | R&D systems | 308-FK-005/CF | |
| Rec Hu IL6 | R&D systems | 206-IL-010/CF | |
| Rec Hu SCF | R&D systems | 255SC010 | |
| RPMI 1640 | Corning | 45000-39 | |
| Saponin | Sigma | 8047-15-2 | |
| Scissors | McKesson | 862945 | |
| Serological pipettes 25 mL | Fisher Scientific | 1367811 | |
| Sterile filter | Nalgene | 567-0020 | |
| Sterile molecular water | Sigma | 7732-18-5 | |
| Yeti Cell Analyzer | Bio-Rad | 12004279 | |
| Zombie Green | biolegend | 423112 |
Riferimenti
- Chulpanova, D. S., Kitaeva, K. V., Rutland, C. S., Rizvanov, A. A., Solovyeva, V. V. Mouse tumor models for advanced cancer immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 4118 (2020).
- Olson, B., Li, Y., Lin, Y., Liu, E. T., Patnaik, A. Mouse models for cancer immunotherapy research. Cancer Discovery. 8 (11), 1358-1365 (2018).
- Marin-Jimenez, J. A., et al. Testing cancer immunotherapy in a human immune system mouse model: correlating treatment responses to human chimerism, therapeutic variables and immune cell phenotypes. Frontiers in Immunology. 12, 607282 (2021).
- Yin, L., Wang, X. J., Chen, D. X., Liu, X. N., Wang, X. J. Humanized mouse model: a review on preclinical applications for cancer immunotherapy. American Journal of Cancer Research. 10 (12), 4568-4584 (2020).
- Cogels, M. M., et al. Humanized mice as a valuable pre-clinical model for cancer immunotherapy research. Frontiers in Oncology. 11, 784947 (2021).
- Jin, K. T., et al. Development of humanized mouse with patient-derived xenografts for cancer immunotherapy studies: A comprehensive review. Cancer Science. 112 (7), 2592-2606 (2021).
- Capasso, A., et al. Characterization of immune responses to anti-PD-1 mono and combination immunotherapy in hematopoietic humanized mice implanted with tumor xenografts. Journal for Immunotherapy of Cancer. 7 (1), 37 (2019).
- Wang, M., et al. Humanized mice in studying efficacy and mechanisms of PD-1-targeted cancer immunotherapy. The FASEB Journal. 32 (3), 1537-1549 (2018).
- Yong, K. S. M., et al. Humanized mouse as a tool to predict immunotoxicity of human biologics. Frontiers in Immunology. 11, 553362 (2020).
- Shen, H. W., Jiang, X. L., Gonzalez, F. J., Yu, A. M. Humanized transgenic mouse models for drug metabolism and pharmacokinetic research. Current Drug Metabolism. 12 (10), 997-1006 (2011).
- Bosma, G. C., Custer, R. P., Bosma, M. J. A severe combined immunodeficiency mutation in the mouse. Nature. 301 (5900), 527-530 (1983).
- Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. The Journal of Immunology. 154 (1), 180-191 (1995).
- Legrand, N., et al. Functional CD47/signal regulatory protein alpha (SIRP(alpha)) interaction is required for optimal human T- and natural killer- (NK) cell homeostasis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (32), 13224-13229 (2011).
- Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. The Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- Traggiai, E., et al. Development of a human adaptive immune system in cord blood cell-transplanted mice. Science. 304 (5667), 104-107 (2004).
- Theocharides, A. P., Rongvaux, A., Fritsch, K., Flavell, R. A., Manz, M. G. Humanized hemato-lymphoid system mice. Haematologica. 101 (1), 5-19 (2016).
- Goldman, J. P., et al. Enhanced human cell engraftment in mice deficient in RAG2 and the common cytokine receptor gamma chain. British Journal of Haematology. 103 (2), 335-342 (1998).
- Stripecke, R., et al. Innovations, challenges, and minimal information for standardization of humanized mice. EMBO Molecular Medicine. 12 (7), (2020).
- Allen, T. M., et al. Humanized immune system mouse models: progress, challenges and opportunities. Nature Immunology. 20 (7), 770-774 (2019).
- Gammelgaard, O. L., Terp, M. G., Preiss, B., Ditzel, H. J. Human cancer evolution in the context of a human immune system in mice. Molecular Oncology. 12 (10), 1797-1810 (2018).
- Rios-Doria, J., Stevens, C., Maddage, C., Lasky, K., Koblish, H. K. Characterization of human cancer xenografts in humanized mice. Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (1), 000416 (2020).
- Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D. Intravenous injections in neonatal mice. Journal of Visualized Experiments. (93), e52037 (2014).
- Lang, J., Weiss, N., Freed, B. M., Torres, R. M., Pelanda, R. Generation of hematopoietic humanized mice in the newborn BALB/c-Rag2null Il2rγnull mouse model: a multivariable optimization approach. Clinical Immunology. 140 (1), 102-116 (2011).
- Laskowski, T. J., Hazen, A. L., Collazo, R. S., Haviland, D. Rigor and reproducibility of cytometry practices for immuno-oncology: a multifaceted challenge. Cytometry Part A. 97 (2), 116-125 (2020).
- Bagby, S., et al. Development and maintenance of a preclinical patient derived tumor xenograft model for the investigation of novel anti-cancer therapies. Journal of Visualized Experiments. (115), e54393 (2016).
- Laajala, T. D., et al. Optimized design and analysis of preclinical intervention studies in vivo. Scientific Reports. 6, 30723 (2016).
- Na, Y. S., et al. Establishment of patient-derived xenografts from patients with gastrointestinal stromal tumors: analysis of clinicopathological characteristics related to engraftment success. Scientific Reports. 10 (1), 7996 (2020).
- Tentler, J. J., et al. RX-5902, a novel beta-catenin modulator, potentiates the efficacy of immune checkpoint inhibitors in preclinical models of triple-negative breast cancer. BMC Cancer. 20 (1), 1063 (2020).
- Lang, J., et al. Development of an adrenocortical cancer humanized mouse model to characterize anti-PD1 effects on tumor microenvironment. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 105 (1), 26-42 (2020).
- Lang, J., et al. Studies of lymphocyte reconstitution in a humanized mouse model reveal a requirement of T cells for human B cell maturation. The Journal of Immunology. 190 (5), 2090-2101 (2013).
- Katano, I., et al. NOD-Rag2null IL-2Rγnull mice: an alternative to NOG mice for generation of humanized mice. Experimental Animalas. 63 (3), 321-330 (2014).
- Brehm, M. A., et al. Parameters for establishing humanized mouse models to study human immunity: analysis of human hematopoietic stem cell engraftment in three immunodeficient strains of mice bearing the IL2rγ(null) mutation. Clinical Immunology. 135 (1), 84-98 (2010).
- Hasgur, S., Aryee, K. E., Shultz, L. D., Greiner, D. L., Brehm, M. A. Generation of immunodeficient mice bearing human immune systems by the engraftment of hematopoietic stem cells. Methods in Molecular Biology. 1438, 67-78 (2016).
- Andre, M. C., et al. Long-term human CD34+ stem cell-engrafted nonobese diabetic/SCID/IL-2Rγnull mice show impaired CD8+ T cell maintenance and a functional arrest of immature NK cells. The Journal of Immunology. 185 (5), 2710-2720 (2010).
- Wunderlich, M., et al. Improved multilineage human hematopoietic reconstitution and function in NSGS mice. PLoS One. 13 (12), 0209034 (2018).
- Lee, J., Brehm, M. A., Greiner, D., Shultz, L. D., Kornfeld, H. Engrafted human cells generate adaptive immune responses to Mycobacterium bovis BCG infection in humanized mice. BMC Immunology. 14, 53 (2013).
- Masse-Ranson, G., et al. Accelerated thymopoiesis and improved T-cell responses in HLA-A2/-DR2 transgenic BRGS-based human immune system mice. European Journal of Immunology. 49 (6), 954-965 (2019).
- Oswald, E., et al. Immune cell infiltration pattern in non-small cell lung cancer PDX models is a model immanent feature and correlates with a distinct molecular and phenotypic make-up. Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (4), 004412 (2022).
