Spontaan muizenmodel van anaplastische schildklierkanker
Summary
Hier presenteren we een standaard pijplijn om murine ATC-tumoren te verkrijgen door spontane genetisch gemanipuleerde muismodellen. Verder presenteren we tumordynamiek en pathologische informatie over de primaire en uitgezaaide laesies. Dit model zal onderzoekers helpen om tumorigenese te begrijpen en medicijnontdekkingen te vergemakkelijken.
Abstract
Anaplastische schildklierkanker (ATC) is een zeldzame maar dodelijke maligniteit met een sombere prognose. Er is dringend behoefte aan meer diepgaand onderzoek naar de carcinogenese en ontwikkeling van ATC, evenals therapeutische methoden, omdat standaardbehandelingen in wezen uitgeput zijn bij ATC-patiënten. De lage prevalentie heeft echter grondige klinische studies en het verzamelen van weefselmonsters belemmerd, zodat er weinig vooruitgang is geboekt bij het creëren van effectieve behandelingen. We gebruikten genetische manipulatie om een voorwaardelijk induceerbaar ATC-muizenmodel (mATC) te maken in een C57BL / 6-achtergrond. Het ATC-muizenmodel werd gegenotypeerd door TPO-cre/ERT2; BrafCA/wt; Trp53 ex2-10/ex2-10 en geïnduceerd door intraperitoneale injectie met tamoxifen. Met het muizenmodel onderzochten we de tumordynamiek (tumorgrootte varieerde van 12,4 mm 2 tot 32,5 mm2 na 4 maanden inductie), overleving (de mediane overlevingsperiode was 130 dagen) en metastase (longmetastasen traden op in 91,6% van de muizen) curven en pathologische kenmerken (gekenmerkt door Cd8, Foxp3, F4/80, Cd206, Ki67 en Caspase-3 immunohistochemische kleuring). De resultaten gaven aan dat spontane mATC zeer vergelijkbare tumordynamiek en immunologische micro-omgeving bezit als menselijke ATC-tumoren. Concluderend, met een hoge gelijkenis in pathofysiologische kenmerken en uniforme genotypen, loste het mATC-model het tekort aan klinisch ATC-weefsel en heterogeniteit van monsters tot op zekere hoogte op. Daarom zou het de mechanisme- en translationele studies van ATC vergemakkelijken en een benadering bieden om het behandelingspotentieel van kleine moleculaire geneesmiddelen en immunotherapiemiddelen voor ATC te onderzoeken.
Introduction
Schildklierkanker is een van de meest voorkomende endocriene maligniteiten1, afkomstig van het schildklierepitheel. In de afgelopen jaren is de incidentie van schildklierkanker wereldwijd snel toegenomen2. Schildklierkanker kan worden onderverdeeld in verschillende typen op basis van de mate van tumorceldifferentiatie. Op basis van klinisch gedrag en histologie worden schildkliercarcinomen onderverdeeld in goed gedifferentieerde carcinomen, waaronder papillair schildkliercarcinoom (PTC) en folliculair schildkliercarcinoom (FTC), slecht gedifferentieerd carcinoom (PDTC) en ongedifferentieerd of anaplastisch carcinoom van de schildklier (ATC)3. In tegenstelling tot PTC, een veel voorkomend type met mild gedrag en een betere prognose4, is ATC een zeldzame en zeer agressieve maligniteit die goed is voor 2% tot 3% van alle schildkliertumoren5. Hoewel ATC zeldzaam is, is het verantwoordelijk voor ongeveer 50% van de schildklierkankergerelateerde sterfgevallen, met sombere overleving (6-8 maanden)6,7. Meer dan 50% van de ATC-gevallen wordt gediagnosticeerd als longmetastase8. Naast de agressieve aard van ATC is er in de kliniek een beperkte effectieve behandeling ontwikkeld. Daarom hebben ATC-patiënten een sombere prognosevan 9,10,11. Dit suggereert dat verdere diepgaande studies dringend nodig zijn naar de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van ATC en behandeling.
De tumorigenese van ATC is een dynamisch gededifferentieerd proces. De moeilijkheid om menselijke tumormonsters te verzamelen in elke fase van klinische studies heeft het begrip van het ontwikkelingsmechanisme van goed gedifferentieerde tot ongedifferentieerde carcinomen belemmerd. Daarentegen bevordert het gebruik van murine ATC-modellen (mATC) de verzameling van mATC-monsters in het hele tumorigeneseverloop. Daarom kunnen we de mechanismen van tumorvorming beter begrijpen door het dynamische gededifferentieerde proces te analyseren. Bovendien heeft de heterogeniteit van klinische ATC-monsters ook bijgedragen aan de moeilijkheid om het moleculaire mechanisme te begrijpen. Niettemin deelden muizen dezelfde genetische achtergronden en werden ze in vergelijkbare leefomgevingen gehouden, waardoor de consistentie van elke tumor werd gewaarborgd. Dit vergemakkelijkt het verkennen van de gegeneraliseerde rol van ATC-ontwikkeling12,13,14. Bovendien is mATC een in situ tumormodel dat de invloed van de anatomische locatie en weefselspecifieke micro-omgeving kan herstellen. Als zodanig, in vergelijking met veelgebruikte immunodeficiënte muizen, is mATC een spontaan muizenmodel met een intact immuunsysteem en immuunmicro-omgeving.
Daarom construeerden we voorwaardelijk geïnduceerde mATC met de C57BL / 6-stam, een muizenmodel dat in staat is om de pathologische kenmerken van gededifferentieerd schildkliercarcinoom te reproduceren. Op basis van dit model gaven we een kort overzicht van de moleculaire basis, constructie-ideeën, pathologische kenmerken en toepassingen van mATC. Daarnaast observeerden en rapporteerden we tumorgroei, overlevingstijd, metastase en pathologische kenmerken van mATC. Wij geloven dat dit een informatica-overzicht zal zijn om andere onderzoekers te helpen dit model gemakkelijker te gebruiken.
We construeerden een voorwaardelijk induceerbaar mATC-model, zoals voor het eerst gerapporteerd door McFadden15; aanvankelijk bouwden we muizen: TPO-cre/ERT2, Braf flox/wt en Trp53flox/wt. Specifiek omvatten TPO-cre / ERT2-muizen de humane schildklierperoxidase (TPO) -promotor (een schildklierspecifieke promotor), die de expressie van een cre-ERT2-fusiegen aandrijft (een cre-recombinase gefuseerd met een menselijk oestrogeenreceptorligandbindend domein). Cre-ERT2 is meestal beperkt tot het cytoplasma en komt alleen in de kern wanneer het wordt blootgesteld aan tamoxifen, wat cre ertoe aanzet recombinante enzymactiviteit uit te oefenen. Wanneer de muizen worden gekruist met muizen die loxP-geflankeerde sequenties dragen, verwijdert cre-gemedieerde recombinatie na tamoxifen-inductie de floxed sequenties in de schildkliercellen om het doel te bereiken van knock-out of knock-out in specifieke genen.
Bovendien zijn Braf flox/wt muizen een knock-in allel van menselijke Braf gebaseerd op het cre-loxP systeem. Brafflox/wt murine transcript is gecodeerd door endogene exonen 1-14 en loxP-geflankeerde menselijke exonen 15-18. Na cre-gemedieerde excisie van de floxed regio’s, worden het mutante exon 15 (gemodificeerd met een V600E aminozuursubstitutie gekoppeld aan constitutief actieve BrafV600E in menselijke kankers) en de endogene exonen 16-18 gebruikt om de transcripten te genereren. Bovendien zijn Trp53 flox/wt muizen knockout allelen van menselijke Trp53 en hebben loxP sites die exonen 2-10 van Trp53 flankeren. Wanneer gekruist met muizen met een cre-recombinase, verwijdert cre-gemedieerde recombinatie de floxed sequentie om Trp53 uit te schakelen. Vervolgens werden TPO-cre/ERT2, Braf flox/w en Trp53flox/wt muizen gekruist om TB (TPO-cre/ERT2; Brafflox/wt) muizen en TBP (TPO-cre/ERT2; Brafflox/wt; Trp53flox/wt) muizen, die kunnen worden gebruikt om PTC en ATC te genereren. Na ongeveer 8 weken werden de muizen geïnduceerd door een intraperitoneale (i.p.) toediening van 150 mg/kg tamoxifen opgelost in maïsolie gedurende twee toedieningen. Tumorgroei kon worden gevolgd door hoogfrequente echografie (het eerste tijdstip van echografie werd geregistreerd als dag 0). De eerste echografie werd 40 dagen na introductie van tamoxifen uitgevoerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritieke stappen binnen het protocol voor schildkliertumordissectie
Tijdens dissectie moet de anatomische locatie van de schildklier correct worden begrepen. De schildklier is een vlindervormige klier aan de dorsale kant van de submandibulaire klier in de buurt van het schildklierkraakbeen en de luchtpijp. Tijdens de procedure werd het doorsnijden van de bloedslagaders aan beide zijden van de nek zorgvuldig vermeden.
Modificatie en probleemoplossing van het mATC-ras…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het National Key Research Development Program van China (2021YFA1301203); de National Natural Science Foundation of China (82103031, 82103918, 81973408, 82272933); het Clinical Research Incubation Project, West China Hospital, Sichuan University (22HXFH019); het International Cooperation Project van het Chengdu Municipal Science and Technology Bureau (2020-GH02-00017-HZ); Natuurwetenschappelijke Stichting van Sichuan, 2022NSFSC1314; het “1.3.5 project for disciplines of excellence, West China Hospital, Sichuan University” (ZYJC18035, ZYJC18025, ZYYC20003, ZYJC18003); en Sichuan Science and Technology Program (2023YFS0098).
Materials
| 100x Citrate antigen retrieval solution (PH 6.0) | MXB | Cat# MVS-0101 | |
| 50x EDTA antigen retrieval solution(pH 9.5) | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9071 | |
| Brafflox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Caspase-3 | Beyotime | Cat# AC033 | |
| CD8 | Cell Signaling Technology | Cat# 98941; RRID:AB_2756376 | |
| CD206 | Cell Signaling Technology | Cat# 24595; RRID:AB_2892682 | |
| Chamber for anesthesia induction | RWDlifescience | ||
| Enhanced DAB chromogenic kit | MXB | Cat# DAB-2031 | |
| Eosin staining solution | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9613 | |
| F4/80 | Abcam | Cat# 100790; RRID:AB_10675322 | |
| Foxp3 | Cell Signaling Technology | Cat# 12653; RRID:AB_2797979 | |
| Fully enclosed tissue dehydrator | Leica Biosystems | ASP300S | |
| Hematoxylin staining solution | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9610 | |
| HistoCore Arcadia fully automatic tissue embedding machine | Leica Biosystems | ||
| Ki67 | Beyotime | Cat# AF1738 | |
| Rotating Slicer | RWDlifescience | Minux S700 | |
| SPlink detection kits (Biotin-Streptavidin HRP Detection Systems) | ZSGB-GIO | Cat# SP-9001 | |
| TPO-cre/ERT2 mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Trp53flox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Ultrasonic cell crusher | Ningbo Xinyi Ultrasound Equipment Co., Ltd | JY92-IIN | |
| Ultrasound gel | Keppler | KL-250 | |
| Ultrasound system | VisualSonics | Vevo 3100 |
Riferimenti
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 69 (1), 7-34 (2019).
- Parenti, R., Salvatorelli, L., Magro, G. Anaplastic thyroid carcinoma: Current treatments and potential new therapeutic options with emphasis on TfR1/CD71. International Journal of Endocrinology. 2014, 685396 (2014).
- Baldini, E., et al. In vitro and in vivo effects of the urokinase plasminogen activator inhibitor WX-340 on anaplastic thyroid cancer cell lines. International Journal of Molecular Sciences. 23 (7), 3724 (2022).
- Haugen, B. R. American Thyroid Association Management guidelines for adult patients with thyroid nodules and differentiated thyroid cancer: what is new and what has changed. Cancer. 123 (3), 372-381 (2015).
- O’Neill, J. P., Shaha, A. R. Anaplastic thyroid cancer. Oral Oncology. 49 (7), 702-706 (2013).
- Simoes-Pereira, J., Capitao, R., Limbert, E., Leite, V. Anaplastic thyroid cancer: Clinical picture of the last two decades at a single oncology referral centre and novel therapeutic options. Cancers. 11 (8), 1188 (2019).
- Fagin, J. A., Wells, S. A. Biologic and clinical perspectives on thyroid cancer. The New England Journal of Medicine. 375 (11), 1054-1067 (2016).
- Neff, R. L., Farrar, W. B., Kloos, R. T., Burman, K. D. Anaplastic thyroid cancer. Endocrinology and Metabolism Clinics of North America. 37 (2), 525-538 (2008).
- Lareau, C. A., et al. Droplet-based combinatorial indexing for massive-scale single-cell chromatin accessibility. Nature Biotechnology. 37 (8), 916-924 (2019).
- Guo, H., et al. Single-cell methylome landscapes of mouse embryonic stem cells and early embryos analyzed using reduced representation bisulfite sequencing. Genome Research. 23 (12), 2126-2135 (2013).
- Mooijman, D., Dey, S. S., Boisset, J. -. C., Crosetto, N., van Oudenaarden, A. Single-cell 5hmC sequencing reveals chromosome-wide cell-to-cell variability and enables lineage reconstruction. Nature Biotechnology. 34 (8), 852-856 (2016).
- Smallridge, R. C., Marlow, L. A., Copland, J. A. Anaplastic thyroid cancer: molecular pathogenesis and emerging therapies. Endocrine-Related Cancer. 16 (1), 17-44 (2009).
- Charles, R. -. P. Overview of genetically engineered mouse models of papillary and anaplastic thyroid cancers: enabling translational biology for patient care improvement. Current Protocols in Pharmacology. 69, 1-14 (2015).
- Tuttle, R. M., Haugen, B., Perrier, N. D. Updated American joint committee on cancer/tumor-nodemetastasis staging system for differentiated and anaplastic thyroid cancer (8th Edition): What changed and why. Thyroid. 27 (6), 751-756 (2017).
- McFadden, D. G., et al. p53 constrains progression to anaplastic thyroid carcinoma in a Braf-mutant mouse model of papillary thyroid cancer. Protocols of the National Academy of Sciences. 111 (16), 1600-1609 (2014).
- Gunda, V., et al. Combinations of BRAF inhibitor and anti-PD-1/PD-L1 antibody improve survival and tumour immunity in an immunocompetent model of orthotopic murine anaplastic thyroid cancer. British Journal of Cancer. 119 (10), 1223-1232 (2018).
- He, Y., et al. High-resolution ultrasonography for the analysis of orthotopic ATC tumors in a genetically engineered mouse model. Journal of Visualized Experiments. (188), e64615 (2022).
- Zhang, L., et al. Novel recurrent altered genes in Chinese patients with anaplastic thyroid cancer. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 106 (4), 988-998 (2021).
- Luo, H., et al. Pan-cancer single-cell analysis reveals the heterogeneity and plasticity of cancer-associated fibroblasts in the tumor microenvironment. Nature Communications. 13 (1), 6619 (2022).
- Luo, H., et al. Characterizing dedifferentiation of thyroid cancer by integrated analysis. Science Advances. 7 (31), (2021).
- Knostman, K. A. B., Jhiang, S. M., Capen, C. C. Genetic alterations in thyroid cancer: the role of mouse models. Veterinary Pathology. 44 (1), 1-14 (2007).
- Kim, C. S., Zhu, X. Lessons from mouse models of thyroid cancer. Thyroid. 19 (12), 1317-1331 (2009).
- Champa, D., Di Cristofano, A. Modeling anaplastic thyroid carcinoma in the mouse. Hormones and Cancer. 6 (1), 37-44 (2015).
- Cabanillas, M. E., Ryder, M., Jimenez, C. Targeted therapy for advanced thyroid cancer: kinase inhibitors and beyond. Endocrine Reviews. 40 (6), 1573-1604 (2019).
- Ljubas, J., Ovesen, T., Rusan, M. A systematic review of phase II targeted therapy clinical trials in anaplastic thyroid cancer. Cancers. 11 (7), 943 (2019).
- Huang, N. -. S., et al. An update of the appropriate treatment strategies in anaplastic thyroid cancer: a population-based study of 735 patients. International Journal of Endocrinology. 2019, 8428547 (2019).
- Subbiah, V., et al. Dabrafenib and trametinib treatment in patients with locally advanced or metastatic BRAF V600-mutant anaplastic thyroid cancer. Journal of Clinical Oncology. 36 (1), 7-13 (2018).
- Baldini, E., et al. Effects of selective inhibitors of Aurora kinases on anaplastic thyroid carcinoma cell lines. Endocrine-Related Cancer. 21 (5), 797-811 (2014).
