Generazione di cellule Natural Killer da cellule staminali umane espanse

Summary

Il presente protocollo mostra come differenziare le cellule CD3−/CD45+CD56+ con citotossicità lieve dalle cellule staminali umane a potenziale espanso (hEPSC) sia in condizioni di coltura 3D che 2D. Ciò consente la convalida fenotipica di routine senza la distruzione del complesso microambiente.

Abstract

La differenziazione delle cellule natural killer (NK) dalle cellule staminali pluripotenti umane consente la ricerca e la produzione di prodotti cellulari di grado clinico per l'immunoterapia. Qui è descritto un protocollo a due fasi che utilizza un mezzo commerciale privo di siero e un cocktail di citochine (interleuchina [IL]-3, IL-7, IL-15, fattore delle cellule staminali [SCF] e ligando tirosin-chinasi 3 FMS-like [Ftl3L]) per differenziare le cellule staminali umane a potenziale espanso (hEPSC) in cellule che possiedono proprietà delle cellule NK in vitro con tecnologia di coltura sia tridimensionale (3D) che bidimensionale (2D). Seguendo questo protocollo, le cellule NK CD3-CD56+ o CD45+CD56+ vengono generate in modo coerente. Quando cocolti con bersagli tumorali per 3 ore, i prodotti differenziati mostrano una lieve citotossicità rispetto a una linea cellulare permanente IL-2-indipendente, cellule NK92mi. Il protocollo preserva la complessità del microambiente di differenziazione mediante la generazione di strutture 3D, facilitando così lo studio delle relazioni spaziali tra le cellule immunitarie e le loro nicchie. Nel frattempo, il sistema di coltura 2D consente la convalida fenotipica di routine della differenziazione cellulare senza danneggiare la delicata nicchia di differenziazione.

Introduction

Rispetto alle cellule staminali pluripotenti convenzionali come le cellule staminali embrionali umane (hESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC), le cellule staminali umane a potenziale espanso (hEPSC) sono più vicine allo stato di totipotenza, in quanto possono differenziarsi in linee sia extraembrionali che embrionali¹. Ad esempio, gli hEPSC possono essere differenziati in trofoblasti¹ e cellule simili a sacchi vitellini². Per ottenere la potenza unica degli hEPSC, un singolo blastomero viene coltivato in un terreno contenente diverse piccole molecole che inibiscono l'impegno di lignaggio segnalando¹, che viene indicato come mezzo EPSC (EPSCM). La coltura di hESC e hiPSCs nell'EPSCM espande la loro potenza precedentemente limitata per differenziarli in cellule trofoblaste¹.

Le cellule staminali pluripotenti sono un prezioso strumento di ricerca per sperimentare nuove modificazioni genetiche. A causa delle capacità di auto-rinnovamento e differenziazione delle cellule staminali pluripotenti, un clone trasformato di una cellula staminale pluripotente può produrre prodotti cellulari differenziati che possiedono la stessa modificazione genetica nello stesso luogo. Zhu e Kaufman hanno stabilito lo standard per la differenziazione delle cellule NK dalle cellule staminali pluripotenti convenzionali (hESCs e hiPSCs)³. In primo luogo, hanno indotto cellule staminali ematopoietiche (HSC) da un corpo embrioide derivato da cellule staminali pluripotenti. L'aggiunta del fattore delle cellule staminali (SCF), del ligando tirosin-chinas-simile 3 (Ftl3L), dell'interleuchina (IL)-7, IL-15 e di un primo supplemento di IL-3 ha influenzato le HSC per svilupparsi in cellule natural killer (NK). Successivamente, hanno ampliato le cellule NK con cellule presentanti l'antigene artificiale (aAPC), che presentano IL-21 legata alla membrana, con la continua integrazione di IL-2. I ricercatori hanno applicato questo approccio all'immunoterapia al fine di generare cellule natural killer derivate da iPSC dotate del recettore dell'antigene chimerico (CAR-iNK)⁴.

Le cellule NK umane sono definite come leucociti CD3-CD56+ nel sangue periferico. Sono effettori contro le cellule infette da virus e le cellule tumorali⁵. Alcuni recettori inibitori sulle cellule NK riconoscono molecole espresse ubiquitariamente nelle cellule normali. Ad esempio, l'eterodimero NKG2A/CD94 espresso sulle cellule NK riconosce le molecole MHC di classe I⁵. Nel frattempo, i recettori attivanti sulle cellule NK riconoscono i ligandi indotti dallo stress, come il modo in cui NKG2D riconosce la sequenza A correlata al polipeptide MHC di classe I indotta dalla trasformazione (mica / micb)⁶. Alcune cellule trasformate sottoregolano i loro "auto-ligandi" per sfuggire alla sorveglianza immunitaria e sovraregolare i ligandi aberranti, il che innesca le cellule NK per eseguire il loro macchinario litico. Le capacità antitumorali intrinseche delle cellule NK hanno portato l'attenzione su questo tipo di cellule immunitarie.

La capacità di dare origine simultaneamente a linee sia embrionali che extraembrionali può rendere le hEPSC una ricapitolazione più fedele della nicchia di sviluppo embrionale rispetto alle cellule staminali pluripotenti convenzionali. Per esperienza, è più facile mantenere la potenza delle hEPSC rispetto alle hiPSC. Nel presente studio, è stato sviluppato un protocollo (Figura 1) per polarizzare gli hEPSC a svilupparsi in linee ematopoietiche e successivamente differenziare le cellule progenitrici in cellule natural killer (NK) in vitro. Nel protocollo, i mezzi commerciali sono impiegati per evitare incongruenze sieriche, seguiti dall'aggiunta graduale di citochine alla differenziazione dei pregiudizi nelle linee linfoidi. Questo protocollo ha due sistemi per preservare il complesso microambiente 3D mentre deriva cellule CD3-CD56 + / CD45 + CD56 + che fenotipicamente e funzionalmente assomigliano alle cellule NK umane.

Questo protocollo può essere utile nello studio dell'interazione delle cellule immunitarie con le loro nicchie di differenziazione e può avere il potenziale per purificare i prodotti cellulari per usi immunoterapeutici.

Protocol

Il presente studio ha comportato esperimenti in vitro ; Pertanto, l'approvazione etica non è applicabile. Le linee cellulari stabilite utilizzate in questo studio sono state ottenute da fonti commerciali (vedi la tabella dei materiali).

1. Generazione di strutture organoidi 3D da hEPSC

1. Mantenere gli hEPSC coltivandoli con 1 mL di mezzo EPSC (piastra a 12 pozzetti) su celle di alimentazione SNL¹.
   NOTA: Si osservano colonie a forma di cupola (Figura 2A) se la loro potenza espansa rimane.
2. Eseguire la pre-differenziazione degli hEPSC.
   1. Rimuovere il mezzo hEPSC e aggiungere 1 mL di terreno DFK (DMEM/F12 + 10% di terreno di sostituzione del siero, vedere la Tabella dei materiali). Incubare per 2-3 giorni a 37 °C e 5% di CO₂. Eseguire un cambiamento medio il secondo giorno se si continua l'incubazione per 3 giorni.
      NOTA: Al microscopio, le colonie a forma di cupola sono appiattite (Figura 2B).
3. Controllare la formazione di corpi embrioidi con la tecnica della goccia sospesa ^7,8.
   1. Rimuovere il mezzo DFK e lavare con 1 mL di PBS una volta. Aggiungere 500 μL di tripsina allo 0,05% e incubare la piastra a 37 °C e al 5% di CO₂ per 3-7 minuti in base alla morfologia.
      NOTA: Gli hEPSC devono poter essere staccati dalle celle di alimentazione quando la piastra è leggermente disturbata.
   2. Rimuovere la tripsina e aggiungere 2 ml di terreno DFK per raccogliere le cellule. Girare le cellule a 300 x g per 3 minuti a temperatura ambiente.
   3. Rimuovere il surnatante con una pipetta. Aggiungere 1 mL di terreno DFK e 1 μL di Y27632 (vedere la Tabella dei materiali) per risospendere le celle mediante scorrimento.
   4. Contare il numero di cellule all'interno della sospensione cellulare con un emocitometro⁹. Diluire la sospensione cellulare con DFK mezzo e Y27632 (1.000x) in modo che ci siano 4.000 cellule/25 μL di terreno DFK.
   5. Riempire il tappo di una capsula di Petri di 10 cm con circa 30-40 gocce di 25 μL di sospensione cellulare per tappo. Versare un po 'di PBS nel piatto inferiore per evitare l'evaporazione delle goccioline. Capovolgere delicatamente il tappo e coprire il piatto. Incubare il piatto a 37 °C e 5% di CO₂ per 3 giorni.

2. Mesoderma e pattern emato-endoteliale del corpo embrioide (EB)

1. Raccogli gli EB all'interno della goccia.
   1. Raccogliere tutti gli EB dalla goccia in una provetta da 15 mL usando una pipetta da 1 mL e un po' di PBS. Pompare un po 'di PBS nella goccia, quindi aspirare il mezzo, compresi gli EB, con la pipetta.
      NOTA: Le goccioline che sono più gialle indicano una formazione e una crescita più efficaci rispetto alle goccioline rosa.
   2. Ruotare gli EB raccolti a 100 x g per 1 minuto a temperatura ambiente e utilizzare una pipetta per rimuovere il surnatante. Aggiungere 1 mL di mezzo A (da un kit di differenziazione cellulare disponibile in commercio, vedere la Tabella dei materiali) per trasferire gli EB raccolti in una piastra a 24 pozzetti non aderente. Etichettare questo giorno come Giorno 0 (Figura 1).
      NOTA: Di solito, tutti gli EB raccolti da un piatto da 10 cm vengono raggruppati e trasferiti in un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti.
2. Eseguire il pattern del mesoderma degli EB.
   1. Incubare la piastra per 3 giorni a 37 °C con il 5% di CO₂. Il giorno 2, rimuovere 500 μL di mezzo A (dal kit, punto 2.1.2) evitando il pipettaggio degli EB. Quindi, aggiungere 500 μL di mezzo fresco A.
3. Eseguire la specificazione emato-endoteliale del corpo embrioide.
   1. Rimuovere 700 μL di mezzo A dal pozzetto e aggiungere 700 μL di mezzo B (dal kit, passo 2.1.2). Cultura per 7 giorni. Eseguire un mezzo cambio di B medio il giorno 5, il giorno 7 e il giorno 9.

3. Differenziazione delle cellule NK

1. Trasferire gli EB modellati su un'interfaccia aria-liquido.
   1. Inclinare leggermente la piastra in modo che gli EB si aggreghino sul fondo. Utilizzare una pipetta da 1 mL per rimuovere il più possibile il più possibile di B medio evitando gli EB.
   2. Prelevare gli EB con una pipetta aspirando il mezzo rimanente. Trasferirli in un pozzo transwell in una piastra da 24 pozzetti (vedere la tabella dei materiali).
      NOTA: limitare i numeri a due o tre EB per transwell per una densità ottimale.
2. Eseguire l'espansione del progenitore linfoide.
   1. Aggiungere 500 μL di terreno NK-1 (mezzo di dilatazione linfoide disponibile in commercio + 14 UI/mL IL-3, 4.500 UI/mL IL-15, 8.800 UI/mL IL-7, 26 UI/mL SCF e 12 UI/mL ftl3L, vedere la tabella dei materiali) al compartimento inferiore del transwell. Cultura per 14 giorni ed eseguire un cambio medio a giorni alterni.
3. Raccogliere e trasferire le celle nei giorni 7-10 su una piastra rivestita.
   1. Per rivestire la piastra, diluire il materiale di rivestimento (materiale di rivestimento per differenziazione linfoide disponibile in commercio, 100x, vedere la tabella dei materiali) in PBS. Aggiungere 1 mL di soluzione di rivestimento diluita a ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti e incubare la piastra a 4 °C durante la notte. Coprire l'apertura della piastra con pellicola avvolgente.
   2. Aggiungere 200 μL di PBS nel transwell e pipettare lentamente su e giù da cinque a sei volte per raccogliere le cellule rilasciate dagli organoidi. Evitare di pipettare gli organoidi.
      NOTA: Le cellule rotonde vengono rilasciate continuamente dagli organoidi (Figura 2D).
   3. Trasferire la sospensione cellulare raccolta in una provetta da 2 ml e far girare le cellule a 500 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante con una pipetta e aggiungere 1 mL di terreno NK-1 (punto 3.2.1) per risospendere le cellule mediante pipettaggio.
   4. Rimuovere tutta la soluzione di rivestimento dal pozzetto e lavare ogni pozzetto di una piastra a 12 pozzetti con 1 ml di PBS due volte.
   5. Dividere le celle raccolte in un rapporto 1: 2. Trasferire la sospensione cellulare su una piastra rivestita a 12 pozzetti (punto 3.3.1). Aggiungere 1 mL di mezzo NK-1 in modo che ogni pozzetto abbia 1,5 mL di mezzo.
   6. Per eseguire un cambiamento medio, lasciare riposare le celle per 1-2 minuti per consentire alle celle di affondare sul fondo. Aspirare con cura 750 μL di terreno. Girare il surnatante raccolto a 500 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
   7. Scartare la maggior parte del surnatante e risospendere in 750 μL di terreno NK-1 con pipettaggio da cinque a sei volte. Aggiungere le celle risospese nel mezzo fresco nel pozzetto originale.
      NOTA: questo sistema parallelo è indicato come sistema 2D nella Figura 1. Seguire il programma di cambiamento medio del pozzo degli organoidi da cui hanno avuto origine le cellule.
4. Eseguire la maturazione delle cellule NK seguendo i passaggi seguenti.
   1. Rimuovere il vecchio mezzo del sistema 3D e aggiungere 500 μL di NK-2 (terreno di differenziazione delle cellule NK disponibile in commercio + 4.500 UI/mL IL-15, 8.800 UI/mL IL-7, 26 UI/mL SCF e 12 UI/mL ftl3L, vedere la Tabella dei materiali) nel compartimento inferiore del transwell. Incubare a 37 °C e 5% CO₂ per 14 giorni.
      NOTA: assicurarsi che il mezzo tocchi il fondo del pozzo.
   2. Eseguire una modifica completa del supporto sulle celle nel sistema 2D. Raccogliere tutti gli 1,5 ml di cellule da un pozzetto e centrifugarlo a 500 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere la maggior parte del surnatante con una pipetta e risospendere il pellet con 1,5 mL di terreno NK-2 (punto 3.4.1).
   3. Eseguire una modifica media a giorni alterni. Inclinare leggermente la piastra del sistema 3D e rimuovere tutto il vecchio mezzo all'esterno del transwell. Aggiungere 500 μL di mezzo NK-2 al di fuori del transwell.
   4. Per eseguire un mezzo cambio medio su un pozzetto di una piastra a 12 pozzetti per il sistema 2D, lasciare riposare le celle per 1-2 minuti per consentire alle celle di affondare sul fondo. Aspirare con cura 750 μL del substrato.
   5. Ruotare il surnatante raccolto a 500 x g per 5 minuti a temperatura ambiente per prevenire la perdita di cellule. Scartare la maggior parte del surnatante e risospendere in 750 μL di mezzo NK-2 pipettando da cinque a sei volte. Aggiungere le celle risospese in mezzo fresco nel pozzetto originale.

4. Raccolta di cellule mature

1. Raccogliere le cellule coltivate nel sistema 2D.
   1. Raccogli le cellule pipettando su e giù durante i giorni 38-45. Lavare con 1 mL di PBS due volte. Centrifugare la sospensione cellulare a 500 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
   2. Rimuovere il surnatante con una pipetta e risospenderlo nel tampone scelto (ad esempio, PBS + 2% FBS per citometria a flusso, vedere la Tabella dei materiali).
2. Raccogli le cellule incorporate nell'organoide.
   1. Raccogliere il mezzo dall'esterno del transwell in un tubo da 15 mL durante i giorni 38-45. Lavare l'organoide due volte aggiungendo 200 μL di PBS all'interno del transwell e pipettando su e giù da cinque a sei volte. Trasferire la sospensione nel tubo da 15 ml.
   2. Aggiungere 500 μL di PBS in un pozzetto di una piastra da 12 pozzetti. Trasferire l'organoide dal transwell a quel pozzetto della piastra a 12 pozzetti con una pinza.
   3. Tagliare l'organoide 20 volte usando un paio di forbici e pinze. Lavare le cellule rimanenti sul forcipe e sulle forbici nel pozzo con PBS. Raccogliere quanto più PBS possibile e trasferirlo nel tubo da 15 mL utilizzato al punto 4.2.1 senza aspirare la struttura organoide.
   4. Aggiungere 500 μL del reagente di dissociazione (vedere la tabella dei materiali) nel pozzetto per digerire enzimaticamente l'organoide. Incubare con una soluzione di distacco di cellule commerciali (vedere la tabella dei materiali) per 7-10 minuti a 37 °C e 5% di CO₂. Estinguere la reazione aggiungendo 1 mL di PBS con FBS al 2% e raccogliere la soluzione in un'altra provetta da 15 ml. Lavare il pozzo con 1 mL di PBS con FBS al 2% due volte.
      NOTA: Determinare la lunghezza dell'incubazione in base alla morfologia. Cerca di raggiungere il punto in cui le singole cellule iniziano a essere rilasciate dalla membrana della struttura 3D.
   5. Aggiungere 1 mL di PBS con FBS al 2% e pipettare su e giù 8-10 volte. Raccogli tutte le soluzioni, comprese le strutture organoidi. Trasferirli nel tubo da 15 mL utilizzato al punto 4.2.3 con un filtro cellulare.
   6. Centrifugare entrambi i tubi a 500 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante con una pipetta. Risospendere il pellet cellulare con il tampone scelto (punto 4.1.2).

Results

È stato ipotizzato che gli attuali prodotti di differenziazione in vitro (IVD) possedessero marcatori di superficie e capacità antitumorali simili alle cellule NK umane.

Il marcatore di definizione delle cellule NK umane è stato accessibile per verificare se i prodotti di differenziazione dal sistema di coltura 3D producevano cellule che assomigliavano fenotipicamente alle cellule NK umane. Circa il 15% delle cellule dissociate dal sistema di coltura 3D da due lotti indotti in diversi punti temporali (n = 2) erano CD3-CD56+ (Figura 3A). CD3 è stato sostituito con CD45 (un marcatore pan-leucocitario) nel pannello di prova a causa dell'assenza di CD3 e della difficoltà di indurre cellule T in vitro. Circa il 16% delle cellule dissociate dalla struttura 3D erano CD45 + CD56 + (Figura 3B, n = 1), che è in linea con le percentuali di cellule CD3-CD56+ osservate negli studi precedenti. Le percentuali di cellule CD3-CD56+ nelle cellule raccolte dal sistema di coltura 2D variavano dal 30% al 6%, da induzioni di maggior successo (Figura 3C, n = 3) a induzioni meno riuscite (Figura 3D, n = 2). Sono stati convalidati la funzionalità e i fenotipi delle cellule raccolte dal sistema di coltura 2D. Durante la coltura Day 18 dal sistema 2D, circa il 12% delle cellule ha espresso sia CD56 ectopico che CD107a dopo 2 ore di 50 ng / mL IL-18, 455 UI / mL IL-2 e 20 ng / mL di stimolazione anticorpale anti-CD244 (Figura 4C, n = 1). Circa il 28% delle cellule raccolte erano CD94+CD159a+ (Figura 4B, n = 1). L'espressione ectopica di CD107a, un rivestimento proteico sulla membrana dei granuli, indica la degranulazione¹⁰, mentre l'eterodimero CD94/NKG2A (CD159a) è un altro marcatore che definisce le cellule NK. Questo fornisce un esempio della convalida fenotipica e funzionale dei prodotti IVD.

La funzionalità dei prodotti IVD è stata testata dalla loro citotossicità contro le cellule eritroucemiche umane-cellule K562. Il profilo completo del ligando sulle cellule K562 rivela il loro complesso istochimico maggiore sottoregolato I (MHC-I) e l'espressione relativamente forte del ligando NKG2D (come ULBP-1, ULBP-2/5/6 e ULBP-3)¹¹; pertanto, le cellule K562 sono sensibili all'attività litica delle cellule NK¹². Entrambi i prodotti endpoint IVD e le cellule NK92mi sono stati innescati con 50 ng / mL IL-18, 455 UI / mL IL-2 e 20 ng / mL anticorpi anti-CD244 durante la notte. Le cellule GFP+ K562 sono state cocoltivate con cellule raccolte da cellule IVD o NK92mi a diversi rapporti effettore-bersaglio (E:T) in presenza di 50 ng/mL (UI non fornita) IL-18, 455 UI/mL IL-2 e 20 ng/mL anticorpi anti-CD244 nello stesso volume di terreno H5100 per 3 ore. La lettura dell'attività di uccisione delle cellule NK è stata l'espressione del marcatore della cellula morta sui sottoinsiemi GFP+. Le celle K562 sono state trasdotte con un vettore di controllo disponibile in commercio (vedi la Tabella dei Materiali) per esprimere costitutivamente la GFP, e l'efficienza della trasduzione è stata di circa l'80% (Figura supplementare 1A). Le percentuali di segnale GFP aggiunto erano proporzionali al numero di cellule GFP+ K562 aggiunte, suggerendo un'espressione specifica di GFP dalle cellule K562 trasdotte (Figura supplementare 1B).

Le percentuali di cellule bersaglio morenti mostrate nella Figura 5 sono state calcolate con la seguente formula¹³:

Percentuale di cellule morenti = (FITC + DAPI + % di cocoltura [ad esempio, Figura 5A]) - (FITC + DAPI + % di cellule K562 trasdotte)

Di tutti e tre i rapporti E:T valutati (0,1:1, 0,33:1, 1:1), le percentuali di cellule GFP+ morenti erano positivamente correlate con i rapporti E:T quando cocolte con prodotti IVD (Figura 5B, hEPSC-NK) o cellule NK92mi (Figura 5B, NK92mi), indicando l'uccisione specifica dei bersagli tumorali. Tuttavia, la citotossicità dei prodotti IVD era relativamente modesta entro il periodo di tempo testato (Figura 5C).

Infine, la generazione di cellule progenitrici linfoidi è stata confrontata tra le colture 3D e 2D. È stato riscontrato che la condizione di coltura 3D ha generato più cellule progenitrici (55.000 cellule) rispetto alla condizione di coltura 2D (36.000 cellule) (Figura supplementare 2). Ciò suggerisce che il contesto dell'architettura tissutale e dei componenti cellulari nella coltura 3D ha supportato la generazione di cellule progenitrici linfoidi.

Figura 1: Diagramma schematico che mostra la strategia di differenziazione per differenziare le cellule NK dalle hEPSC . (A) Qui viene mostrata la cronologia dei sistemi di coltura 3D, che descrive in dettaglio le condizioni della coltura e brevi parole chiave di ogni fase. L'interfaccia aria-liquido del sistema 3D viene mantenuta durante l'induzione della cella NK. (B) Qui viene mostrata la cronologia dei sistemi di coltura 2D. Le cellule rilasciate raccolte dai giorni 7-10 dalle strutture del sistema 3D vengono seminate su una piastra rivestita senza l'interfaccia aria-liquido. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Morfologia delle cellule osservate in fasi distinte di differenziazione. (A) La morfologia delle hEPSC quando mantenute nell'EPSCM. Gli hEPSC formano colonie a forma di cupola. (B) La morfologia delle hEPSC dopo la pre-differenziazione. Le colonie a forma di cupola sono appiattite. Gli hEPSC vengono raccolti e formano EB con la tecnica della goccia sospesa. Gli EB sono raccolti e coltivati nel mezzo A e poi nel mezzo B. (C) La morfologia di un EB il giorno 10. Durante questo periodo, l'EB inizia ad espandersi e gonfiarsi, formando strutture membranose. (D) La morfologia di un EB che rilascia cellule. Dopo la semina sul transwell, l'EB cresce e rilascia costantemente cellule rotonde nei dintorni. Alcune delle cellule rilasciate vengono raccolte e coltivate su una piastra a 12 pozzetti rivestita con materiali di rivestimento per la differenziazione linfoide. Le popolazioni cellulari sono morfologicamente eterogenee e tendono ad aggregarsi insieme. (E) La morfologia delle cellule osservate all'endpoint dell'IVD. Si osservano piccole cellule di sospensione circolari (freccia nera). Barre della scala: (A,B,E) = 100 μm; (C,D) = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Grafici FACS rappresentativi di prodotti derivati da hEPSC all'endpoint. Le cellule vengono incubate con anticorpi coniugati al fluoroscopio su ghiaccio per 30 minuti. I campioni vengono colorati con DAPI prima di essere caricati nella porta di iniezione del campione FACS. Le cellule non colorate vengono utilizzate per stabilire il gating negativo. (A) Grafico rappresentativo FACS sull'espressione di CD3 e CD56 in cellule dissociate dal sistema di coltura 3D da due lotti (n = 2). (B) Grafico rappresentativo FACS sull'espressione di CD45 e CD56 in cellule dissociate dalla coltura 3D (n = 1). (C) Grafico rappresentativo FACS sull'espressione di CD3 e CD56 in cellule raccolte dalla piastra rivestita da un'induzione riuscita (n = 3). (D) Grafico FACS rappresentativo sull'espressione di CD3 e CD56 dalla piastra rivestita quando l'induzione è subottimale (n = 2). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Grafico rappresentativo FACS su prodotti derivati da hEPSC durante la coltura Day 18 (n = 1). (A) Grafico FACS sull'espressione di CD56 e CD107a dopo 2 ore di stimolazione con anticorpi IL2, IL-18 e anti-CD244. (B) Grafico FACS sull'espressione CD159a e CD94. I campioni vengono colorati con DAPI prima di essere caricati nella porta di iniezione del campione FACS. Le cellule non colorate vengono utilizzate per stabilire il gating negativo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 5: Grafico delle percentuali di cellule morenti rispetto a diversi rapporti E:T dalla cocoltura di cellule GFP+ K562 con il prodotto endpoint IVD o cellule NK92mi (n = 1). L'espressione delle cellule FITC+ DAPI+ è stata valutata con un analizzatore cellulare e l'analisi dei dati è stata eseguita con software compatibile. (A) Un grafico FACS rappresentativo che mostri il gating di sottoinsiemi FITC + DAPI + dalla cocoltura di prodotti IVD e cellule K562 con un rapporto E/T di 1. (B) Singoli appezzamenti dell'esperimento di cocoltura con prodotti GFP+ IVD (a sinistra) o cellule NK92mi (a destra) per 3 ore. Entrambi riflettono una relazione proporzionale positiva tra la percentuale di cellule morenti e il rapporto E:T. (C) Un grafico che mostra le curve di uccisione dei prodotti IVD e delle celle NK92mi sulla stessa scala. I prodotti IVD hanno mostrato una lieve citotossicità rispetto alle cellule NK92mi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura supplementare 1: Saggio funzionale di cellule NK da hEPSC. (A) Istogramma FACS di cellule K562 trasdotte. Le cellule FITC+ K562 esprimevano GFP. (B) istogrammi FACS dalla cocoltura di cellule GFP+ K562 e prodotti IVD endpoint a tre rapporti E:T (n = 1). Le percentuali di cellule FITC+ nella cocoltura corrispondevano al numero di cellule K562 trasdotte aggiunte. I gatings sono stati stabiliti con cellule K562 non trasdotte. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 2: Differenziazione dei progenitori linfoidi in coltura 2D rispetto a coltura 3D. L'attuale protocollo basato su organoidi è stato utilizzato per indurre progenitori linfoidi da cellule staminali umane espanse potenziali. Sono state create due condizioni: (1) i progenitori linfoidi sono stati tenuti in coltura all'interno degli organoidi (3D) e (2) i progenitori linfoidi sono stati isolati e tenuti sul piatto di coltura (2D). Dopo 2 settimane di coltura aggiuntiva, i numeri delle cellule sono stati determinati per confrontare la coltura 2D rispetto alla coltura 3D. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

Ci sono alcuni passaggi fondamentali per garantire il successo della differenziazione delle cellule CD45 + CD56 + da hEPSC. La pre-differenziazione (fase 1.2) è cruciale poiché il mezzo EPSC contiene inibitori dell'impegno di lignaggio¹. Dopo la pre-differenziazione, le colonie a forma di cupola di hEPSC vengono appiattite (Figura 2B). L'aggiunta di Y27632, un inibitore della Rho-chinasi (ROCKi), durante la formazione di EB da hEPSCs (step 1.3) è indispensabile per la sopravvivenza delle hEPSCs dopo la dissociazione. Un'altra considerazione importante è il numero di EB piantati su ciascun pozzo transwell. Poiché si tratta di un sistema su piccola scala, da due a tre EB per transwell è la densità ottimale per prevenire il consumo eccessivo del fluido. L'interfaccia aria-liquido viene mantenuta durante l'intero corso della differenziazione delle cellule NK per il sistema 3D, che si ritiene mantenga la polarità delle cellule stromali e supporti l'espansione dei progenitori ematopoietici derivati dall'AGM^14,15.

Come accennato in precedenza, la densità di EB sul transwell è un fattore determinante per una differenziazione di successo. Il segno chiave per questo è il colore del mezzo 1 giorno dopo l'impianto di EB sul transwell. Se il colore diventa giallo rapidamente, ciò indica contaminazione o sovraffollamento. Per risolvere il problema, è necessario utilizzare una pipetta da 1 mL per prelevare manualmente EB aggiuntivi e trasferirli in un altro transwell.

Una delle principali limitazioni di questo protocollo è la purezza delle cellule CD3−/CD45+ CD56+ nei prodotti IVD, che si ritiene sia parzialmente responsabile della citotossicità inferiore rispetto alle cellule NK92mi pure. Un sistema di coltura 3D è stato impiegato per indurre progenitori ematopoietici attraverso la generazione di un EB che assomiglia ai tre strati germinali embrionali. Questa strategia imita lo sviluppo delle cellule del sangue nel microambiente del midollo osseo, eliminando così la necessità di cellule stromali per supportare la differenziazione³. Senza una fase di selezione per purificare i progenitori ematopoietici, si prevede che la purezza dei prodotti IVD sarà ridotta. Una strategia per mantenere la complessa nicchia di differenziazione aumentando al contempo la purezza del prodotto endpoint sta sviluppando un metodo di espansione per i prodotti IVD CD3-CD56+ selezionati. Ad esempio, i prodotti IVD CD3-CD56+ selezionati possono essere coltivati su cellule presentanti l'antigene artificiale (aAPC), come le cellule K562 irradicate ingegnerizzate con IL-21 legata alla membrana. Con la fornitura di IL-2 nella coltura, questo metodo può ottenere un aumento di 1.000 volte del numero di cellule NK³.

Un'altra limitazione è l'accesso limitato alle cellule NK umane in buona fede come riferimento positivo. NK92mi è il riferimento positivo impiegato nel saggio di cocultura, ma non è abbastanza accurato. Le cellule NK92mi sono ingegnerizzate da cellule NK92, una linea cellulare permanente che esprime i fenotipi¹⁶ delle cellule NK attivate, per produrre autonomamente IL-2 per soddisfare i requisiti di coltura. Le cellule NK92 dimostrano un'attività di uccisione superiore contro le cellule K562 in vitro rispetto alle cellule NK primarie umane¹⁷. Un confronto più equo della capacità di uccidere il tumore dei prodotti IVD potrebbe essere ottenuto analizzando la citotossicità delle cellule NK del sangue periferico in parallelo, ma sfortunatamente manca l'accesso alle banche del sangue.

Questo protocollo di coltura a due sistemi mira a generare cellule CD3−/CD45+CD56+ da hEPSC. La valutazione dei marcatori di superficie e della citotossicità con FACS può essere eseguita di routine su cellule da sistemi 2D senza interrompere la nicchia di differenziazione. Nonostante le differenze nelle percentuali delle cellule CD3-CD56+, i sistemi 3D e 2D possono derivare cellule CD3-CD56+ con variazioni simili nell'espressione di CD56 (Figura 3) e il sistema 2D riflette l'esistenza di progenitori linfoidi dalla condizione di coltura 3D.

Il significato dell'utilizzo del sistema di coltura 3D è che consente l'uso di saggi di profilazione ad alta risoluzione, come la trascrittomica spaziale o la spettrometria di massa di imaging, per ricercare le relazioni spaziali e le interazioni cellula-cellula all'interno della complessa nicchia di differenziazione.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
30 w/v% Soluzione di albumina, da siero bovino (BSA),	Wako Chemicals	017-22231	Per la risospensione delle citochine.
Tecnologie ACCUMAX	STEMCELL	07921
Anti-umano-CD159a-PE	BD	375104	Durante la colorazione degli anticorpi, 0,5 &; micro; L di anticorpi viene aggiunto nel tampone di colorazione (PBS + 5% FBS)
Anticorpi anti-CD3-APC umani	BD	555355	Durante la colorazione degli anticorpi, 0,5 & micro; L di anticorpi viene aggiunto nel tampone di colorazione (PBS + 2% FBS)
Anticorpi anti-umano-CD45-APC	BD	555485	Durante la colorazione degli anticorpi, 0,5 & micro; L di anticorpi viene aggiunto nel tampone di colorazione (PBS + 3% FBS)
Anticorpi anti-CD56-PE umani	BD	555516	Durante la colorazione degli anticorpi, 0,5 &; L di anticorpi viene aggiunto nel tampone di colorazione (PBS + 4% FBS)
Anticorpi anti-umano-CD56-PEcy7	BD	335826	Durante la colorazione degli anticorpi, 0,5 &; L di anticorpi viene aggiunto nel tampone di colorazione (PBS + 5% FBS)
Anti-umano-CD94-APC	BD	559876	Durante la colorazione degli anticorpi, 0,5 &; micro; L di anticorpi viene aggiunto nel tampone di colorazione (PBS + 5% FBS)
Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film	Thermo Scientific	11772644
Cd244 Anticorpo monoclonale (eBioC1.7 (C1.7)), Functional Grade, eBioscience	Thermo Scientific	16-5838-85
Costar 6,5 mm Transwell, 0,4 &; m Inserti a membrana in poliestere poroso STEMCELL	Technologies	3470
Soluzione Dapi, 1 mg/mL	BD	564907	Viene risospeso con ddH2O quindi la concentrazione è 10 µ M/mL. Aggiungi 1 µ L dell'aliquota in 300 µ L del buffer FACS (PBS + 2% FBS)
DMEM	CPOS-Nucleo del bioreagente	11965092
DMEM/F12	Thermo Scientific	11320033
FcX,	biolengend	422302
fetale bovino (FBS) qualificato dall'UE approvato dall'UE 10270106
FlowJo v10.8.0	BD
Gibco  PBS (10x) pH 7.4	CPOS-Bioreagent core	70011044	10x PBS concentrato è prodotto come segue: senza celle K562 di calcio, magnesio o rosso fenolo
	ATCC	CCL-243
Siero di Ricambio Knockout	Thermo Scientific	10828-028
MyeloCult H5100 medium	STEMCELL Technologies	5150
celle NK92mi	ATCC	CRL-2408	Lotto: 70045208. Una volta scongelati, vengono coltivati in terreno MyeloCult H5100 e mantengono la densità compresa tra 2 x 105 e 1 x 106 cellule/mL.
Piastre multipistole Nunc trattate per colture cellulari Piastra a 12 pozzetti	Thermo Scientific	150628	fondo piatto
Nunc Piastre multiple trattate per colture cellulari Piastra a 24 pozzetti	Thermo Scientific	142475
Nunc EasYDish Dishes	Thermo Scientific	150460
pLenti-GFP Vettore di controllo lentivirale	CELL BIOLABS	LTV-400	Viene confezionato come suggerito dal produttore (https://www.cellbiolabs.com/sites/default/files/LTV-400-gfp- lentiviral-plasmid.pdf). 40 μ L di 50x lentivirus viene aggiunto con 1 μ L 10 mg/mL di polibrene per 1 mL di sospensione cellulare. Il cambio completo del terreno viene eseguito 24 ore dopo l'aggiunta di lentivirus. Le cellule vengono incubate indiscutibilmente per 3 giorni a 37 gradi C, 5% CO2.
Polibrene	EMD Millipore	TR-1003-G
Ligando umano ricombinante Flt-3/Proteina FLT3L	R& D Systems	308-FK-005	È risoluto con PBS + 0,2% BSA. La concentrazione di lavoro è di 10 ng/mL o 12 UI/mL.
Proteina IL-15 umana ricombinante	R& D Systems	247-ILB-005	Viene risospeso con PBS + 0,2% BSA. La concentrazione di lavoro è di 10 ng/mL o 4500 UI/mL.
Proteina IL-18/IL-1F4 umana ricombinante	R& D Systems	9124-IL-010	Viene risospeso con PBS + 0,2% BSA. La concentrazione di lavoro è di 50 ng/mL. L'IU non è fornito dall'azienda.
Proteina IL-2 umana ricombinante	R& D Systems	202-IL-010	Viene risospeso con PBS + 0,2% BSA. La concentrazione di lavoro è di 50 ng/mL o 455 UI/mL.
Proteina IL-3 umana ricombinante, 50ug	PeproTech	200-03	Viene risospesa con PBS + 0,2% BSA. La concentrazione di lavoro è di 5 ng/mL o 14 UI/mL.
Proteina IL-7 umana ricombinante	R& D Systems	207-IL-010	Viene risospeso con PBS + 0,2% BSA. La concentrazione di lavoro è di 20 ng/mL o 8800 UI/mL.
R& Proteina SCF umana ricombinante	D Systems	255-SC-010	Viene risospeso con PBS + 0,2% BSA. La concentrazione di lavoro è di 20 ng/mL o 26 UI/mL.
Kit ematopoietico STEMdiff STEMCELL	Technologies	5310	Medium A: 45 mL di terreno basale ematopoietico STEMdiff + integratore ematopoietico STEMdiff A ; Medium B: 75 STEMdiff Terreno basale ematopoietico + STEMdiff Integratore ematopoietico B
Materiale di rivestimento per differenziazione linfoide StemSpan	STEMCELL Technologies	9950	Viene risospeso in PBS (100x)
Terreno di differenziazione cellulare StemSpan NK	STEMCELL Technologies	9960	Si prepara aggiungendo 500 µ L Integratore per la differenziazione delle cellule NK StemSpan (100x)  in 49,5 mL di SFEM II. Entrambi sono forniti nel kit di generazione di cellule StemSpan NK.
Terreno di espansione linfoide StemSpan	STEMCELL Technologies	9960	Viene preparato aggiungendo 5 ml di integratore di espansione per progenitori linfoidi StemSpan (10x) in 45 ml di StemSpan SFEM II. Entrambi sono forniti nel kit di generazione di cellule StemSpan NK.
Kit di generazione di cellule StemSpan NK	STEMCELL Technologies	9960	Scongelare il mezzo e i materiali a temperatura ambiente e il mezzo viene conservato in 4 ° C una volta scongelato.
Il BD LSRFortessa analizzatore cellulare	BD
Tripsina-EDTA (0,05%), rosso fenolo	Thermo Scientific	25300054
Y-27632 dicloridrato	Tocris	1254	concentrazione di lavoro: 10 &; M